文摘

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是全球最常见的癌症之一。标准治疗的手术、化疗和放疗可能导致长期并发症,降低患者的生活质量,如进食障碍、语言障碍,毁容或者弯曲的美容问题。对癌症特异性抗原抗体治疗是有利的较小的副作用通过其更高的特异性,但通常抗肿瘤活性仍不足以获得一个完整的治疗。Robo1,轴突引导受体,可能已经受到了相当大的关注在各种癌症药物目标。我们展示了以前的增强细胞毒性效应saporin-conjugated anti-Robo1抗毒素(IT-Robo1) HNSCC细胞系hsq - 89与光化学内化相结合的技术。考虑到光源,只有有限的组织穿透性,我们检查了药物内化皂素的影响。皂苷治疗促进重大IT-Robo1 hsq - 89细胞的细胞毒性效应。皂素施加自己的非特异性的细胞毒性,这可能覆盖的实际程度内化的效果。我们因此检查是否产生了重大具体治疗皂素闪过对癌细胞的细胞毒性的影响。皂素的抗毒素的组合也表现出显著的肿瘤抑制影响老鼠HSQ-19异种移植。 These results suggest the utility of saponin treatment as an enhancer of immunotoxin treatment in cancer.

1。介绍

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是全球第六个最常见的癌症1,2]。HNSCC改变了小的发病率和死亡率在过去的30年3]。除了死亡率,一个主要问题是,常规治疗如手术、放疗、化疗和长期功能下降,导致包括饮食失调以及演讲和化妆品问题导致减少的生活质量(QOL) (4]。因此,开发新型治疗方法减少这些治疗相关的并发症是一个紧迫的问题。单克隆抗体治疗的方法将负担改善保健。西妥昔单抗和Nivolumab HNSCC治疗通过美国食品和药物管理局(FDA) (5,6]。然而,抗体的抗肿瘤效应的庇护下(ADCC)抗体依赖的细胞毒性为实体肿瘤已被证明是不充分的。要解决这个问题,许多技术来增强细胞毒性的活动,如抗体药物配合(adc),抗毒素(其)和放射(RIT)开发(7- - - - - -9]。

它或嵌合毒素设计这样的他们有一个肿瘤表面抗原部分和蛋白质毒素部分。这些药物的跨膜受体分子的目标,以便单克隆抗体受体或受体的配体肽大多使用。经常使用的蛋白质毒素细菌毒素或ribosome-inactivating植物来源的蛋白质(8]。Saporin,孤立于植物的种子Saponaria officinalis,是归类为I型ribosome-inactivating蛋白质(RIP) [10]。Saporin大约是30 kd分子量。它没有自然细胞绑定域名,所以它是活跃的只有当内源性针对受体分子或类似的机制并转移到胞质(11]。我撕开的类型是一个非常强大的毒素在癌症治疗中,其使用的主要问题是需要把它与一些手段从核内体转移到胞质。

我们之前尝试了光化学内化(PCI)方法(12,13]的saporin-conjugated anti-Robo1抗体交付到癌细胞,找到了一个数百次扩增的细胞毒性anti-Robo1活动(14]。因此,一种总线标准方法已经被证明有效的实现endosomal释放它。然而,它有一个限制在光不渗透深层组织。

另一方面,皂苷还产生主要来自植物和已知与许多生物效应在膜表面活性的苷透化作用,胆固醇代谢、免疫系统调制,和肿瘤生长抑制(15]。在各种常见的商用皂苷,Quillaja saponaria皂苷(Quillaya皂甙)在这项研究中的应用是南美soaptree从树皮中提取的,是一个异构混合糖和糖苷配基的分子不同的两根。Quillaya皂苷具有溶血性等多种生物活性,抗炎,immune-stimulatory,抗病毒和细胞毒性活动16,17]。它内化机制通过皂素据报道由于换位的毒素从核内体胞质而不影响质膜完整性(18- - - - - -20.]。

Robo1最初发现的轴突引导受体果蝇(21]。无袖长衫家族由Robo1-4 [22]。人类Robo1五immunoglobulin-like域和三纤连蛋白III-like域在其细胞外部分(22]。Robo1是胎儿组织中表达,特别是在神经系统,最初报道作为肝癌的肿瘤特异性抗原(23]。现在发现在一个广泛的癌症,如结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、头部和颈部鳞状细胞癌(24- - - - - -26]。Robo1也是neoangiogenetic血管内皮细胞的表达在肿瘤和非肿瘤的疾病(26]。据报道,Slit2 / Robo1信号在癌症中扮演一个重要的角色在入侵,迁移,epithelial-mesenchymal过渡,以及肿瘤导致血管生成(24,25,27]。我们已经开发出一种anti-Robo1单克隆抗体(28),显示一个isotope-labelled版本的抗肿瘤作用的抗体对肝细胞癌和小细胞肺癌异种移植(29日,30.]。

在这项研究中,我们再次肯定endosomal释放是必要的对于saporin-conjugated anti-Robo1抗体(IT-Robo1)的细胞毒性效应对Robo1-expressing上颌窦鳞状细胞癌癌细胞hsq - 89使用皂素。我们也检查是否皂苷抗肿瘤活性的治疗产生协同效应在hsq - 89异种移植小鼠。研究结果表明,皂素促进endosomal释放它。这里描述的药物输送系统应适用于其他目标,从而扩大治疗难治性癌症的窗口。

2。材料和方法

2.1。细胞

HNSCC细胞系hsq - 89(来自于上颌窦RCB0789)购买从日本(日本埼玉县)。在先前的研究中,我们证实Robo1信使rna和蛋白质的表达在hsq - 89细胞通过实时逆转录PCR,免疫印迹分析,流式细胞术(14]。hsq - 89在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM)(西格玛奥德里奇,密苏里州,美国)与抗生素(青霉素90单位/毫升·90μg / ml链霉素,热科学、马、美国)和孵化37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司2。杜尔贝科的磷酸缓冲盐(D-PBS)和光(JP)从kouichi购买。

2.2。生物素酰化的抗体

anti-Robo1抗体(B5209B)和控制生成抗体(B8109B)如前所述[28]。每个抗体生物素化的根据制造商的说明“EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin”(美国马热科学)。删除后自由生物素与PD-10脱盐列(英国通用电气医疗集团生命科学),每个抗体分子共轭生物素的数量估计使用傻瓜化验设备(Aproscience JP),测量吸光度在500海里。

2.3。抗毒素皂苷的制备及细胞毒性试验

一个saporin-conjugated anti-Robo1抗体(B5209B)和saporin共轭负控制抗体(B8109B),以下称为IT-Robo1 IT-NC,分别是121年由孵化μl的1.1μM streptavidin-saporin (Biotin-Z内化工具包(KIT-27-Z),先进瞄准系统、钙、美国)和138年μl的1.1μ米生物素化的单克隆抗体在室温下30分钟,像前面描述的那样14]。hsq被播种2.0×10 - 89细胞4每在96孔板和细胞培养过夜。第二天,他们暴露在各种浓度(0.054∼4.2 nM)下午IT-Robo1或IT-NC(图1 (b)),分别。皂苷的Quillaja树皮是购买的西格玛奥德里奇(美国密苏里州)。根据制造商的指示,Quillaja皂素是一种异构混合物的分子不同的糖和糖苷配基,半个皂角苷配基含量不小于10%。皂素为3.5μg / ml随之被加入到培养基和培养48 h(图1 (b))。细胞生存能力评估与CCK-8工具包(Dojindo实验室,JP)所描述的14]。

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图1
皂素hsq - 89的剂量依赖性细胞毒性效应细胞(a)皂苷的影响的可行性IT-Robo1或IT-NC hsq治疗- 89细胞(b, c) hsq - 89细胞被播种在20000细胞/ 96孔板和孵化与不同浓度(0.054∼4.2 nM)下午IT-Robo1或IT-NC一起3.5μ克/毫升的皂素48 h。的治疗协议(b)连续IT-saponin或(c)下的冲刷实验指定各自的面板。实线表示的实心圆IT-Robo1皂素,和开环与虚线表明IT-NC皂素。

冲刷实验(图1 (c)),IT-Robo1或IT-NC同样添加到每个在最终的浓度区间内下午0.054∼4.2 nM,孵化1 h,在D-PBS洗,然后皂素添加3.5的最终浓度μ克/毫升。这些细胞被孵化1 h,在D-PBS洗,46 h中添加和孵化。细胞生存能力就类似的评估。

2.4。hsq - 89异种移植小鼠

所有程序老鼠与协议进行协议批准东京大学(RAC130109-2)。的semiconfluent hsq - 89细胞培养在10厘米Φ菜被胰蛋白酶分离,与D-PBS洗两次,离心机。细胞与D-PBS补充和调整2×107细胞/毫升。我们混合等量的细胞悬液和基底膜基质凝胶(美国纽约康宁)[31日]。我们购买5 - 6周大(18 - 20 g)雄性BALB / cSlc-nuν老鼠和注射皮下注射(SC)和2×106hsq / 200 - 89细胞μ我的右肩。提供了水和食物随意。

2.5。在活的有机体内IT-Robo1与皂苷

小鼠平均重达18 - 23 g(6 - 8周大)在实验的开始,当肿瘤体积达到了40毫米3。肿瘤体积计算使用以下公式:V =π/ 6×长×宽×深度(32]。IT-Robo1 0.1μg / D-PBS 100μl是腹腔内接种(IP) 5乘以每隔48小时。皂素30μg / D-PBS 100μl在肿瘤同时注入SC IT-Robo1管理。急性毒性并没有表现出任何组。小鼠随机分为4组,(1)IT-Robo1 +皂苷(IT-Robo1 0.1μg / D-PBS 100μ30 l IP +皂素μg / D-PBS 100μl SC), (2) IT-Robo1只(IT-Robo1 0.1μg / D-PBS 100μl IP + D-PBS 100μl SC),(3)皂苷(D-PBS 100μ30 l IP +皂素μg / D-PBS 100μl SC)和(4)PBS控制(D-PBS 100μl IP + D-PBS 100μl SC)。相同的药物注射4次每48小时,总共五次。肿瘤的生长监测通过测量肿瘤大小。当肿瘤的大小达到1000毫米3或小鼠的体重急剧下降(即。,a loss of more than 25% of the body weight in one week), mice were sacrificed.

2.6。组织学分析

在治疗开始后的第十天,代表肿瘤切除的小鼠牺牲后,放入10%中性缓冲福尔马林溶液(Muto纯化学物质,摩根大通(JP)好几天了。常规处理和石蜡包埋后,组织连续切片。Hematoxylin-eosin(圆))染色用于组织学检查。

2.7。数据分析

数据显示为±SD方法。统计评估了使用方差分析(方差分析)其次是图基诚实的显著差异测试。一个 值< 0.01是统计学意义。

3所示。结果

3.1。生物素酰化的单克隆抗体

anti-Robo1单克隆抗体(B5209B,生成内部)(28)和控制抗体B8109B生物素化的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin工具包中描述的材料和方法(M&M)。每个抗体的生物素分子共轭被傻瓜估计试验根据制造商的指示。抗体都是同样与约8生物素分子/抗体和生物素化的计算在500 nm的吸光度值。

3.2。细胞毒性的皂苷

没有细胞毒性研究皂苷的最佳浓度活动,hsq被播种2.5×10 - 89细胞3每在96孔板和细胞培养在37°C一夜之间在不同浓度的皂苷。第二天,细胞存活率是衡量CCK-8 M&M的描述。如图1(一)在3.5的浓度μg / ml没有明显的细胞毒性,皂素本身。另一方面,观察细胞死亡在10.0的浓度μ克/毫升。基于这些结果,皂素3.5的最终浓度μg / ml被选为随后的细胞毒性实验。

3.3。细胞毒性的影响IT-Robo1皂素在体外

Saporin进行接合的anti-Robo1抗体(B5209B)和负控制抗体(B8109B) streptavidin-saporin解决方案,如前所述[14]。相应的共轭抗体是以下称为IT-Robo1 IT-NC。先前报道(14),这些抗体几乎没有影响的可行性hsq - 89细胞,尽管IT-Robo1的光化学内化增强细胞毒性效应。这些结果促使我们检查皂素的影响来确定它是否有利于endosomal /溶酶体逃逸的毒素进入细胞溶质(18- - - - - -20.]。

如图1 (b)细胞毒性效应,IT-Robo1表现出明显强于IT-NC。然而,在浓度为4.2 nM, IT-NC也减少了细胞的存活率约30%(方差分析, )(图1 (b))。这意味着有一个非特异性的影响与皂素没有抗原抗体复合物的形成。因此,我们接下来进行冲刷,皂苷培养基。如图1 (c)在冲刷条件下,看到IT-NC控制没有影响,但仍在IT-Robo1治疗细胞细胞毒性的影响。细胞的生存能力是40%的浓度IT-Robo1 4.2 nM和100%的浓度IT-NC 4.2 nM(图1 (c))。的细胞毒性效应IT-Robo1明显大于IT-NC(方差分析, )。

3.4。IT-Robo1与皂苷抗肿瘤的影响在活的有机体内

hsq - 89细胞皮下接种裸鼠M&M检查所述皂素的影响治疗在活的有机体内。剂量和管理路线的皂素测定中描述一个以前的报告25]。没有观察到急性毒性假设溶血SC注入的Quillaja树皮皂素在30本研究中使用μg / D-PBS 100μl

在接种后大约10天,当肿瘤大小已达40毫米3,老鼠被分成4组,治疗结合皂素:(1)IT-Robo1 +皂素,(2)IT-Robo1,(3)皂素,和(4)PBS控制。

如图2(一个),观察肿瘤生长的显著减少小鼠IT-Robo1 +皂苷组小鼠相比IT-Robo1only集团或皂苷组和对照组(方差分析, )。减少它的重量- Robo1 +皂苷治疗组相比显著地抑制其他组织(图2 (b))(方差分析, )。如图1 (c),IT-Robo1 +皂苷治疗组宏观上展出推迟肿瘤的生长。

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图2
IT-Robo1皂苷治疗对异种移植小鼠的影响。hsq - 89细胞接种裸鼠皮下注射。(a)与(1)肿瘤生长被IT-Robo1 +皂素,(2)IT-Robo1,(3)皂素,和(4)PBS(控制):小鼠的肿瘤生长IT-Robo1 +处理皂素是抑制比其他老鼠治疗(方差分析, )。(b)的体重减少- Robo1 +皂素相比明显改善小鼠接受其他治疗(方差分析, )。(c)的小鼠的肿瘤图像处理IT-Robo1 +皂素,IT-Robo1,皂素,和PBS 10天:IT-Robo1 +皂素宏观上推迟肿瘤的进展。
3.5。肿瘤组织病理学评价

在IT-Robo1皂苷治疗组,有明显的凝固坏死肉芽组织形成内外肿瘤(图3(一个))。它只治疗组,观察大量的出血性坏死的肿瘤。广泛肉芽组织形成和新血管形成被邻近肿瘤(图3 (b))。在皂苷治疗组,中央空泡形成的肿瘤。腔周围退化肿瘤细胞致密的核和核破裂,但是很少观察到肿瘤细胞坏死。局灶性肉芽组织邻近肿瘤(图3 (c))。在控制PBS治疗组,观察大腔这可能是由于中央坏死,这表明极快的肿瘤生长超过血液供应(图3 (d))。

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图3
组织病理学评价肿瘤治疗IT-Robo1 +皂素,IT-Robo1,皂素,PBS。肿瘤切除后10天的治疗和彩色);(一)IT-Robo1 +皂素,(b) IT-Robo1, (c)皂素,(d) PBS控制。

4所示。讨论

Robo1最初报道的表面抗原肝细胞癌(23]。然而,ROBO1以前识别作为一个肿瘤抑制基因,和发展积累了ROBO1专门表达在多种恶性肿瘤细胞或neoangiogenic内皮细胞(22,26]。它现在被称为一个好的分子癌症治疗的目标。

基于endosomal释放的可能性,我们在这项研究检查皂素的影响。皂苷是促进endosomal释放它,这样它大大增强蛋白质的细胞毒性效应saporin等毒素,一种我ribosome-inactivating蛋白(18,20.]。Quillaja树皮皂素的主要成分是三萜皂苷的糖苷配基是Quillaic酸类型,和它是已知抗癌活性15]。我们之前已经确认在几个HNSCC Robo1细胞系的表达(14]。其中,hsq - 89表现出一定程度的表达与肝癌细胞HepG2的线。生成的anti-Robo1单克隆抗体B5209内部已被证明具有较高的亲和力与人类Robo1 [28,33]。肿瘤的111年In-anti-Robo1抗体达到最大15.0±0.69%的ID / g在48 h后注入和居高不下的一段时间HepG2异种移植(29日]。放射性anti-Robo1贴上90年Y已被证明具有抗肿瘤活性对小细胞肺癌和HepG2异种移植(29日,30.]。之前报道,anti-Robo1共轭与saporin施加一点hsq - 89细胞的细胞毒性效应(14]。然而,光敏剂治疗和增加曝光Robo1-IT的细胞毒性效应,暗示的可能性endosomal保留它14]。PCI技术是这样一种方式实现endosomal释放,但光渗透到深层组织的能力是有限的34,35]。

的主要活动Quillaja皂甙广泛描述包括抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、抗肿瘤,王亚南,immunoadjuvant [17),但在人类太毒,是有用的。

为了区分溶血和癌细胞死亡效果,胡锦涛等人分开Quillaja皂苷分数21 (QS-21),更疏水部分酰基chain-ASAP,制定成一个纳米颗粒形式,杀戮和生长抑制(凯基)尽快16]。尽快的溶解性影响红细胞被抑制凯基实践,制定和ASAP-KGI诱发癌症通过细胞凋亡(细胞死亡16]。急性毒性的Quillaja皂苷在活的有机体内2018年报道了Tam和罗恩。他们口头管理新生鼠,LD50成立于32.5μg /鼠标(36]。

如图1(一),皂素对hsq - 89细胞的细胞毒性作用,存在剂量依赖的相关性和3.5的浓度μg / ml被选为进一步在体外研究。我们以前报道几乎没有影响hsq - 89细胞,甚至在最大剂量(4.2海里)60%的细胞还活着(14]。在这项研究中,添加皂素的培养基导致了增加细胞毒性IT-Robo1影响hsq - 89细胞,作为集成电路50是几十个点,大多数细胞死亡在1纳米(图1 (b))。同时,控制抗体IT-NC也显示细胞毒性活动hsq - 89细胞更高的浓度范围,这被认为是一个非特异性(图皂素的影响1 (b))。我们利用冲刷过程中为了避免这种非特异性的影响皂苷治疗。如图1 (c),一个重要的细胞毒性效应仍然冲刷后,表明抗体本身是有效的。皂苷的功效增强对拉莫斯细胞b细胞淋巴瘤治疗与saporin-Rituximab报道Gilabert-Oriol et al。37]。

已经有在活的有机体内与嵌合毒素协同抗肿瘤作用的研究,也就是说,saporin-EGF和皂素表皮生长因子受体表达肿瘤异种移植(19,20.]。我们进一步研究了在活的有机体内抗肿瘤效应下的IT-robo1皂苷治疗使用hsq - 89细胞异种移植小鼠。为了避免系统性副作用等皂苷的溶血(16,38),我们选择皮下皂素管理局附近的肿瘤。我们现在还没有观察到任何暗示急性不良反应症状。如图2,共同服用皂素的IT-robo1导致显著降低肿瘤的体积和保持体重。明显凝固坏死肉芽肿的形成内部或外部观察肿瘤的组织病理学评价残余肿瘤的老鼠接受IT-Robo1with皂苷治疗,建议杀肿瘤的效果和愈合过程的开始。这些结果表明,皂素的协同抗肿瘤效应。

它是一个强有力的工具在癌症治疗和有很多试验结合各种毒素,癌症特异性指标,并增强剂(8]。其中,saporin-based毒素已被证明是重要的因为saporin没有任何特定的膜受体,结合使用时目标形态如抗体,他们获得特异性肿瘤细胞(11]。皂甙可以促进endosomal /溶酶体逃逸ribosome-inactivating蛋白质如saporin这里使用不影响质膜完整性(18]。研究结果表明,皂素促进saporin-based的细胞毒性效应,从而扩大了治疗的分子靶向治疗癌症。

5。结论

它建议saporin-conjugated anti-Robo1抗毒素包括一种新的治疗目标在HNSCC皂素的应用,这里开发和药物输送系统应该被证明是适用于其他癌症的目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。之前报道的数据被用来支持这项研究和可用DOI: 10.21767 / 2254 - 6081.100157。这些之前的研究都是在相关地方引用文本中引用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢太平洋·博茹博士编辑这篇文章的评论。作者还要感谢博士Osamu Arai-Kusano为实验过程有用的建议。他们感谢吴克群Oyachi(组织病理学核心设施,新泻大学医学院)和Naoyuki山口(分子和诊断病理学,新泻大学医学和牙科科学研究生院)为他们杰出的技术援助。这项工作也是转化支持的研究项目;战略促进创新的医疗技术的实际应用,TRSPRINT,来自日本的医学研究和发展机构艾湄湾。