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肿瘤学杂志
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肿瘤学杂志/2020年/文章

研究文章|开放获取

体积 2020年 |文章的ID 9342732 | https://doi.org/10.1155/2020/9342732

,乔凡尼Luca Gravina亚历山德罗•Colapietro Francesco Petragnano艾琳Fasciani,比安卡玛丽亚西奇塔诺,菲利普Beirinckx, Philippe Pujuguet Laurent Saniere艾伦·范德Aar Daniela Musio,弗朗西斯卡·德·菲利斯Vincenzo加尼姆,斯特凡诺Martellucci,罗伯托•Maggio Vincenzo Tombolini,克劳迪奥Festuccia,弗朗西斯科·Marampon, ”抗癌的作用抑制Ephrin受体激酶信号GLPG1790对结直肠癌细胞系在体外和在活的有机体内”,肿瘤学杂志, 卷。2020年, 文章的ID9342732, 16 页面, 2020年。 https://doi.org/10.1155/2020/9342732

抗癌的作用抑制Ephrin受体激酶信号GLPG1790对结直肠癌细胞系在体外和在活的有机体内

亚历山德罗Colapietro,1 乔凡尼卢卡Gravina,1 弗朗西斯科·Petragnano,2 艾琳Fasciani,2 比安卡玛丽亚西奇塔诺,3 菲利普Beirinckx,4 菲利普Pujuguet,5 Laurent Saniere,5 艾伦·范德Aar,4 丹妮拉Musio,6 弗朗西斯卡·德·菲利斯,6 Vincenzo加尼姆7et al。 斯特凡诺Martellucci,1,7 罗伯特·Maggio,2 Vincenzo Tombolini,6 克劳迪奥·Festuccia,1 弗朗西斯科·Marampon6

1生物技术和应用临床科学、放射生物学实验室,拉奎拉,意大利拉奎拉大学

2生物技术和临床应用科学,药理学实验室,拉奎拉,意大利拉奎拉大学

3史di Istologia ed Embriologia意大利Cattolica del Sacro库雷,基金会亲自阿戈斯蒂诺•Gemelli大学庄严的弗朗西斯科·维托1 - 00168,罗马,意大利

4加拉帕戈斯群岛NV,梅赫伦,比利时

5加拉帕戈斯群岛SASU Romainville,法国

6放射治疗部门,医院翁贝托一世“Sapienza大学罗马,罗马,意大利

7大学实验室的实验医学和环境病理中心“萨比娜Univeristas Rieti,意大利

学术编辑器:托马斯·e·艾德里安
收到了 2019年11月19日
修改后的 2020年1月17日
接受 2020年1月29日
发表 2020年2月27日

文摘

爆发Erythropoietin-producing肝细胞受体(以弗所书)促进和维持癌症的进展如结直肠癌(CRC)、弗的A2亚型受体表达已被证明与预后不良,已被确认为一种有前途的治疗目标。在此,我们研究了,在体外和在活的有机体内与GLPG1790治疗的效果,一个强有力的pan-Eph抑制剂。小分子的选择性活动对人类HCT116 EphA2对碘氧基苯甲醚和HCT15 CRC细胞系表达既定的RAS的活性形式与野生型p53的突变形式的,同时分别。EPHA2磷酸化/激活和诱导G GLPG1790减少1/ S细胞循环增长逮捕通过下调细胞周期素E和PCNA的表达,而p21上调Waf1 / Cip1和p27Cip /躺下睡觉。ephrin信号诱导静止的抑制HCT15 HCT116细胞衰老。在调查CRC-related的角色,pro-oncogenic p53和RAS途径,我们发现GLPG1790调节p53表达和沉默p53或抑制RAS(人类鼠肉瘤)/ erk(细胞外signal-regulated激酶)信号限制在HCT116 GLPG1790诱导衰老细胞的能力。另一方面,HCT15沉默的p53倾向GLPG1790-induced衰老细胞,同时没有观察到ERK抑制的影响。最后,GLPG1790阻碍了epithelial-mesenchymal过渡,减少了CRC的迁移能力,在异种移植模型中肿瘤形成的影响在活的有机体内更有效地使用比HCT15 HCT116异种移植。综上所述,我们的数据表明GLPG1790作为信号的治疗潜力transduction-based治疗CRC的治疗策略。

1。介绍

结直肠癌(CRC)是第三和第二最常见癌症的男性和女性,分别,每年有100万新病例的诊断(1]。CRC通过不同阶段的发展,与被收购或遗传基因突变的积累,最终促进恶性演化[2]。在这方面,突变的腺瘤息肉病杆菌(APC),克里斯汀•鼠肉瘤病毒致癌基因相同器官(喀斯特)和肿瘤蛋白质53 (TP53或p53)都进行了广泛的调查,并已被证明在CRC的发展起到关键作用[3]。然而,CRC细胞组成复杂的遗传性状,以及额外的作用基因突变或异常表达更多的仍是未知的。

erythropoietin-producing肝癌受体(弗)构成最大的受体酪氨酸激酶家族(rtk)。家庭由16个总受体分为——或B-subclasses。EphA小组由EphA1 EphA10受体,和EphB组由六个受体名叫EphB1 EphB6。弗蛋白质结合膜结合配体命名ephrins生成非常复杂的信号网络。弗受体和ephrins表达在不同的细胞相互作用反式从弗和ephrin激活双向信号级联,已被称为“向前”和“反向”信号,分别。弗和ephrins coexpressed位于相同的单元中进行交互独联体,抑制的现象反式信号(4,5]。

通过不同的kinase-mediated弗调节多个生物过程向前和反向途径,包括小gtpaseρ成员,RAS,粘着斑激酶(FAK) PI3激酶通路(PI3K), Jak / Stat通路,Src (4,5]。因为他们的至关重要的作用在调节多种生理过程,弗的异常表达和ephrins被报道在许多人类肿瘤包括CRC (6,7]。弗的异常表达和ephrins也已被证明能够促进癌细胞生长、迁移和入侵通过多个分子机制的破坏5- - - - - -7]。一些研究表明,重要的EphA1 upregulation EphA2, EphA3, EphA4, EphB2, EphB4发生在CRC进展(7,8],EphA2已被证明是一个先进的疾病和不良预后的标志,是一个重要的治疗目标9]。

我们最近开发了一个临床前,口服生物小分子命名GLPG1790能够抑制,在摩尔浓度,各种弗受体的活性,尤其强劲效率与EphA2 [10]。分子有效地减少几个乳房的表型转换,横纹肌肉瘤,和胶质母细胞瘤肿瘤细胞系在体外和在活的有机体内(10- - - - - -12),我们的最近的初步数据显示一个潜在的治疗作用GLPG1790也在治疗CRC (13]。本研究调查了GLPG1790的治疗效率与HCT116 HCT15 CRC细胞系,都表达一种变异的喀斯特除了野生型p53蛋白(p53WT)或(p53突变p53太),分别14]。这里,GLPG1790显著抑制肿瘤细胞生长在体外和在活的有机体内来,treatment-induced静止或衰老细胞中泛型类型的方式和影响epithelial-mesenchymal过渡计划。有趣的是,我们发现p53的突变状态,随着RAS(人类鼠肉瘤)/ erk(细胞外signal-regulated激酶)信号,影响GLPG1790-mediated高p53的抗癌活性WT表达的细胞。因此,这里收集的数据支持这一观点,针对弗可能提供一个新的开发新型抗癌策略对CRC的手段。

2。材料和方法

2.1。细胞培养、可行性、扩散、愈合试验β牛乳糖活动分析,流式细胞仪分析

人类大肠癌细胞(HCT116和HCT15)从美国购买类型文化集合(罗克维尔市,医学博士,美国)。结直肠癌细胞在DMEM培养(杜尔贝科的修改中)补充10%的边后卫和1%谷氨酰胺和1%链霉素或青霉素。细胞在37°C和5%孵化有限公司2,湿度。评价细胞的生存能力(IC50)和扩散,愈合化验,流式细胞仪分析,β牛乳糖化验进行如前所述[12,15]。

2.2。瞬时转染

如前所述(执行瞬时转染的细胞16]。简而言之,HCT116 HCT15细胞被播种在50 - 60%融合6-well盘子。小核RNA)对人类p53 (p53-siRNA, sc - 29435;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)或siRNA-negative控制(CTR-siRNA, sc - 37007;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)结合RNAiMAX(表达载体)和使用60 nM最终浓度。p53-siRNA存在的池三个有针对性,19-25 nt siRNAs旨在专门击倒目标基因。

2.3。西方墨点法

免疫印迹分析如前所述[17,18)使用以下主要抗体:p27 EphA2(颈)Cip /躺下睡觉(这种),生存素(D-8),钙粘蛋白(g10), PCNA (fl - 261),苷(b - 12), p21Waf1 / Cip1(C-19), p16 (F-12) p53 (1) phospho-ERK1/2 (Tyr204)(军医),到(DCS-35),细胞周期蛋白D1 (M-20),细胞周期素E (HE12) phospho-PAK4 (Thr423) PAK4 (B3) Ku70 (h - 308), Ku86 (h - 300), ERK1/2(碳14)(圣克鲁斯生物技术、钙、美国),α微管蛋白(TU-02) phospho-p38 (Thr180 / Tyr182) (9211), phospho-EPHA2 (Ser897) (D9A1)细胞信号技术(丹弗斯,MA), ZO-1 (D6L1E),和蜗牛(L70G2)(细胞信号技术、莱顿、荷兰)。样本孵化与适当的辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(EuroClone、MI、意大利)在室温下1 h。蛋白质信号检测使用西方亮ECL工具包(Advansta,门洛帕克,CA)根据制造商的指示和可视化使用ChemiDoc XRS + (Bio-Rad大力神,CA)。测密度术进行量化蛋白质表达的变化使用图像Lab5.1软件(Bio-Rad) [19,20.]。

2.4。在活的有机体内研究

四十个,六个,女CD1小鼠ν/ν(购买的查尔斯河;意大利米兰)被用于在活的有机体内我们研究所的研究按照指南(拉奎拉大学医学院和科技学校董事会规定,遵守意大利政府监管n。1992年116年1月27日,实验动物的使用)。20在旁边皮下接种动物HCT116或HCT15悬挂1×10组成6细胞在100年μ我看看没有的边后卫基底膜基质。肿瘤被允许种植接种后10天,直到质量达到体积约为0.2 - -0.3厘米3动物随机化,这被认为是足够的。然后,老鼠分为两组:对照组和一个对待GLPG1790(30毫克/公斤体重,5天/周,4周)使用剂量之前定义的药理调查执行的加拉帕戈斯群岛。以下参数被用来量化不同疗法的抗肿瘤作用:肿瘤体积,测量在整个实验过程;肿瘤重量,测量的实验;和肿瘤进展(TP),定义为肿瘤体积的增加大于50%的基线。用游标卡尺测量肿瘤大小,任何单一的TP肿瘤进行了计算。TP数据用于生成kaplan meier曲线来描述进程。这种分析的方法减少了主体间变异性造成移植疗效的差异,以及intrasubject可变性。

2.5。统计方法

综述了连续变量的平均数标准误差(SEM)。连续变量,建立的统计比较控制和治疗组进行单向方差分析测试或学生的t以及(在这种情况下,有两个独立的组)。综述了二分变量的绝对或相对频率。对于二分变量,建立了统计比较控制和治疗组进行确切概率法。为多个比较,意义被乘以校正水平 通过比较执行的数量(n)根据Bonferroni调整。所有测试都是双面的,由蒙特卡罗的意义。 值小于0.05被认为是具有统计学意义。所有使用SPSS统计分析®统计分析软件包,10.0版本21]。

3所示。结果

3.1。GLPG1790诱发G1 / S细胞循环增长逮捕通过促进静止HCT15和HCT116细胞衰老状态

的剂量GLPG1790能够影响50%的CRC细胞生存能力(IC50)调查。两天的治疗后HCT116 HCT15使用0.1 -10μM GLPG1790生产集成电路50值为1.87±0.32μM和6.98±0.67μ分别为M(图1(一))。24小时后细胞治疗剂量等于IC50每一个细胞类型,GLPG1790显著降低EphA2磷酸化/激活71±9% HCT116 HCT15细胞(图和90.4±6.2%1 (b))。GLPG1790的影响细胞的增殖率(图1 (c))和细胞形成的殖民地(图的能力1 (d))也被调查。四天的治疗GLPG1790 CRC细胞的增殖率减少了96.5 HCT116±13.3%和98.2±18.4% HCT15细胞。14天的治疗后,colonies-forming HCT116容量和HCT15细胞减少66±3.1%和66±5.2%,分别。流式细胞术显示,治疗细胞GLPG1790 (IC50)24小时显著降低DNA复制(S期)主要逮捕细胞G1阶段的细胞周期(图2(一个))。符合G1/ S逮捕,GLPG1790减少细胞周期素E (CycE)和PCNA的表达水平的同时增加p21Waf1 / Cip1和p27Cip /躺下睡觉蛋白表达细胞系(图2 (b))。出乎意料,治疗调节细胞周期蛋白D1 (CycD1)和到蛋白表达在HCT116和HCT15细胞系(图2 (b))。因此,调查是否GLPG1790的抗增殖作用是可逆的,CRC细胞系是暂时性的治疗与GLPG1790 4天(IC50)。如图3(一个),消除GLPG1790恢复HCT15增殖的能力。这是与观察到的影响从HCT116细胞移除GLPG1790后,仍持续被捕(图3(一个))。值得注意的是,在四天的治疗后,β牛乳糖活动(图3 (b))和大形态(图3 (c)),广泛使用作为衰老细胞的标记,在HCT116已经显著增加,但不是在HCT15细胞。GLPG1790没有诱导凋亡细胞死亡所显示治疗无法增加活跃(裂解)形式的半胱天冬酶3和PARP(图3 (d))。总的来说,这些结果表明,弗的抑制信号能够影响CRC-transformed表型的诱导静止或衰老,但不是细胞死亡,细胞中泛型类型的方式。

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图1
GLPG1790 CRC细胞生存能力下降,增长潜力和anchorage-dependent单独使用能力。(a)的影响存在剂量依赖的相关性GLPG1790 HCT116的可行性和HCT15细胞经过48小时的治疗已被证明。使用MTT测定细胞活力测定。结果±SD代表三个独立的实验。(b)细胞溶解产物从HCT116和HCT15细胞(DMSO)(−)未经治疗或治疗(+)GLPG1790 (IC50)24 h与特定的抗体通过免疫印迹分析表明蛋白质。α微管蛋白的表达是一个示例加载控制。光密度分析的四个独立的实验报道墨迹图(以下 与控制)。(c) HCT116和HCT15细胞,生长在附着条件,服用GLPG1790 (IC50指定的时间)。细胞的数量获得了利用台盼蓝染料排除测试。结果代表平均值±SD四个独立实验( 与控制)。(d) (DMSO)未经治疗或GLPG1790-treated HCT116 HCT15细胞被播种在低浓度anchorage-dependent条件。殖民地拍摄和14天的治疗后统计。结果代表三个独立实验的平均值±SD ( 与控制)。
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图2
GLPG1790诱发增长逮捕在G1 / S期的细胞周期和调节细胞循环相关的蛋白质。HCT116、HCT15执行(a)流式细胞仪分析细胞治疗与DMSO(负控制)或GLPG1790 (IC50) 24 h。直方图显示细胞的比例在每个细胞循环阶段HCT116 HCT15细胞±GLPG1790。结果代表四个独立实验的平均值( 或 与控制)。(b)细胞溶解产物从HCT116 HCT15细胞±GLPG1790 (IC50)在指定的时间通过与特定的抗体免疫印迹分析表明蛋白质。α微管蛋白表达作为样本的加载控制。光密度分析以下三个独立的实验报道墨迹图( , 或 与控制)。
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图3
GLPG1790诱发静止在HCT116 HCT15和衰老细胞,根据p53的表达。(一)HCT116 HCT15细胞处理2μ米和7μ分别M GLPG1790 GLPG1790前4天从细胞中删除。细胞计数进行2、6和8天后删除GLPG1790 ( 与GLPG1790与治疗4天)。(b)β牛乳糖活动评估使用ELISA GLPG1790治疗4天后( 比未经处理的)。(c)的细胞形态学HCT116和HCT15细胞,分别用2μ米和7μ分析了M GLPG1790在20 x光显微镜放大后在4天的治疗。(d)细胞溶解产物从HCT116和HCT15细胞(DMSO)(−)未经治疗或治疗(+)GLPG1790 (IC50)12、24、48 h与特定的抗体通过免疫印迹分析表明蛋白质。α微管蛋白的表达是一个示例加载控制。光密度分析的四个独立的实验报道墨迹图(以下 与控制)。
3.2。p53突变状态参与调停GLPG1790-Induced衰老比RAS / ERK信号不同

p53的角色和RAS关键球员CRC调控衰老的细胞(22,23),进行调查。HCT116和HCT15细胞系转染与特定的小干扰rna (siRNAs)针对p53 mRNA (p53-siRNA),而对一个序列秀丽隐杆线虫基因(CTR-siRNA)被用作-控制(图4(一))。免疫印迹分析,进行转染后36小时,表明p53蛋白质含量特别减少p53-siRNA-transfected细胞(图4(一))。转染后36小时,细胞治疗GLPG1790 (IC50),β牛乳糖活动(图4 (b))评估。如数据所示4 (b)和4 (c)沉默p53 GLPG1790促进的能力下降β牛乳糖活动在HCT116(图54.2±7.1%4 (b))。然而,β牛乳糖活动增强HCT15细胞(图70.23±12.6%4 (b))。36小时GLPG1790治疗HCT116 p53表达水平增加而不是HCT15细胞(图4 (c))。喀斯特作用的调查评估的影响GLPG1790 ERK的活化状态,这是其主要pro-oncogenic下游目标。如图5(一个)GLPG1790(集成电路50治疗持续增加了HCT116细胞ERK活化而没有HCT15细胞(图中观察到的影响5(一个))。Cotreating HCT116细胞MEK / ERK抑制剂U0126 (10μ米)的活性下降β牛乳糖诱导GLPG1790(图5 (b)),同样减少衰老标记蛋白p16的表达INK4p21,Waf1 / Cip1,p27Cip /躺下睡觉(图5 (c))。综上所述,这证据表明p53和KRAS-ERKs-mediated抗增殖信号调解,senescence-promoting根据CRC GLPG1790不同细胞类型的影响。

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图4
p53突变状态参与调解GLPG1790-induced衰老。(一)细胞溶解产物从HCT116 HCT15表达p53-siRNA被免疫印迹分析转染后36小时以内使用特定抗体表示蛋白质。α微管蛋白的表达显示示例加载。(b)β牛乳糖活动评估ELISA。HCT116、HCT15 p53-silenced细胞治疗GLPG1790 36 h ( , 与未经处理的细胞,§§§ 与CTR-siRNA + GLPG1790)。(c)细胞溶解产物从HCT116和HCT15细胞(DMSO)(−)未经治疗或治疗(+)GLPG1790 (IC50)36 h与特定的抗体通过免疫印迹分析表明蛋白质。α微管蛋白的表达是一个示例加载控制。
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图5
GLPG1790诱发衰老HCT116细胞通过ERK信号的激活。(一)细胞溶解产物从HCT116 HCT15细胞处理2μ米和7μM GLPG1790分别为24或48小时使用特定抗体的免疫印迹分析表明蛋白质。α微管蛋白表达函数加载控制。(b)β牛乳糖活动评估使用HCT116和HCT15细胞ELISA cotreated U0126 (10μM)和GLPG1790, 2μ米或7μM,分别为36 h ( 与未经处理的, 比GLPG1790)。(c)细胞溶解产物从HCT116 HCT15细胞cotreated U0126 (10μM)和GLPG1790, 2μ米或7μM,分别分析了36 h为表示与特定的抗体免疫印迹蛋白质。α微管蛋白表达函数加载控制。
3.3。GLPG1790在活的有机体内减少了CRC细胞的增长能力

治疗效率GLPG1790当时调查使用CRC在裸鼠异种移植瘤模型。对于任何细胞系,二十老鼠皮下注射1×106细胞/ /鼠标;后肿瘤体积达到0.2∼-0.3厘米310只小鼠中,动物被分为两组。动物对待GLPG1790(30毫克/公斤)5天/周4周。如图6(一)在实验的最后,GLPG1790肿瘤体积减少了74.6±11.6%和52.3±11.2%,老鼠接受HCT116 HCT15异种移植,分别。肿瘤重量明显减少小鼠接受GLPG1790控制相比,与70 - 90%抑制HCT15-derived HCT116-derived肿瘤和抑制50 - 90%的肿瘤(图6 (b))。老鼠的数量经历TP跨组明显不同,这是证实了TP(图的中间值6 (c))。汽车组,肿瘤进展在三周内完成接收HCT116异种移植和一周内收到异种移植HCT15(图6 (c))。在HCT116-grafted GLPG1790-treated老鼠,老鼠,TP从未发生,而对于HCT15-grafted老鼠,TP开始第一周,两周后(图完成6 (c))。免疫印迹显示GLPG1790切除肿瘤治疗表达下调EPHA2磷酸化与肿瘤从vehicle-treated老鼠(图6 (d))。

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图6
GLPG1790对体内肿瘤生长的影响。(a)生长曲线表明肿瘤体积从异种移植HCT116或HCT15细胞系,未经处理的(汽车)或GLPG1790-treated (GLPG1790)比较。肿瘤体积是评估部分中描述的方法,和值代表均值±SEM从10老鼠。上部面板显示了异种移植小鼠的序贯治疗,开始当肿瘤体积达到约0.2 - -0.3厘米3。GLPG1790(30毫克/公斤)管理为4周每周5天。(b)的小鼠肿瘤重量还未经处理或被接受GLPG1790已被证明。(c) kaplan meier进展的治疗和估计GLPG1790-treated HCT116-derived肿瘤。EphA2 (d)磷酸化/激活状态的肿瘤从车辆或GLPG1790-treated老鼠。代表从6肿瘤免疫印迹实验分析已被证明。
3.4。GLPG1790影响Epithelial-to-Mesenchymal过渡标记的表达和CRC细胞迁移的能力

GLPG1790推迟epithelial-to-mesenchymal过渡的能力(EMT)过程和相关的CRC细胞的迁移。GLPG1790治疗(集成电路50)迅速和持续增加的钙粘蛋白的表达和ZO-1存活素水平降低和蜗牛(图7(一))。此外,分子有效地减少CRC细胞系的能力迁移(图7 (b))。综上所述,这些数据表明GLPG1790抑制pro-oncogenic EMT过程和减少癌细胞迁移的能力。

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图7
GLPG1790减少epithelial-to-mesenchymal过渡的表达标记和损害CRC细胞来修复伤口的能力。(一)细胞溶解产物从HCT116 HCT15细胞±GLPG1790 (IC50)在指定的时间通过与特定的抗体免疫印迹分析表明蛋白质。α微管蛋白的表达表明样本的加载。光密度分析以下三个独立的实验报道墨迹图( , ,或 与控制)。(b)愈合实验HCT116和HCT15细胞。擦伤是在0和维护时间48 h GLPG1790 (IC的存在50)或DMSO溶液。虚线代表伤口的边缘。光显微镜下拍摄照片(放大10倍)。迁移指数(h / T48 T0)下表的图片报道。

4所示。讨论

CRC仍是一个无法控制的疾病和癌症相关死亡的第二大原因(1]。因此,迫切需要新的治疗CRC的治疗策略。弗,从rtk最大的家族,通过绑定命名ephrins膜结合配体,调节许多细胞功能的调制信号转导途径包括RAS / erk / MAPKs通路(4,5)已知维持CRC (24]。CRC细胞表达高水平的不同包括EphA2弗蛋白质,一个已知的不良预后的标志在先进的CRC和一个潜在的重要的治疗目标治疗CRC (7- - - - - -9]。我们最近发现GLPG1790抗癌礼节,一个新的锅弗受体的抑制剂与一个强大的效率与EphA2,与几个乳房,横纹肌肉瘤,和胶质母细胞瘤细胞系在体外和在活的有机体内(10- - - - - -12]。因为我们的初步在体外调查显示的治疗潜力GLPG1790也与CRC (13),我们决定更好地描述在CRC通过使用这种药物的药理作用在体外而在体内方法在p53野生型或突变CRC细胞系。

GLPG1790 EphA2磷酸化/激活水平降低和影响CRC细胞生存和增殖,诱导促进G细胞循环逮捕1/ S期的细胞周期。根据细胞循环分布,GLPG1790下调细胞周期素E和PCNA,从而影响战略目标分子的发病和进展CRC (25,26]。此外,GLPG1790调节细胞循环抑制剂p21和肿瘤抑制基因的表达Waf1 / Cip1和p27Cip /躺下睡觉,曾被证明恢复chemo-resistant表型的几种癌症细胞类型(27]。出乎意料,GLPG1790增强的细胞周期蛋白D1的表达,是一个积极监管机构的G1/ S细胞循环过渡(28]。我们最近发现,GLPG1790上调表达的细胞周期蛋白D1在RMS,诱导cytoplasmatic /细胞核周围的蛋白质的积累(11]。报告表明,这种积累相关增殖指数较低在多种癌症类型(29日,30.]。我们假设一个类似的机制发生在CRC细胞,和未来的调查将是完全阐明蛋白质调节扩散。,值得注意的是,GLPG1790浓度测试,没有诱导细胞凋亡在CRC细胞系表明它做抑制细胞生长的纯治疗。然而,GLPG1790可以使敏感细胞的细胞毒性作用其他药物,像我们的一些初步的数据13和正在进行的实验表明。

抑制细胞生长的药物诱导可逆或不可逆的细胞循环逮捕称为静止或衰老,分别。quiescence-related增长逮捕期间,细胞代谢活动降低,蛋白质合成和其他细胞功能。这导致缺乏细胞增长;然而,消除细胞依靠细胞生长抑制细胞生长的刺激。与静止相反,细胞衰老的特征是不可逆的损失的增殖潜能,增加β牛乳糖活动,和细胞扩张(31日- - - - - -33]。GLPG1790 HCT116细胞诱导衰老的增强β牛乳糖的收购活动和形态学特点,包括大型和扁平细胞衰老的标志(33]。然而,静止发生在HCT15细胞系。这里收集的数据支持这个建议,GLPG1790是一个潜在的强大的治疗对CRC的治疗。事实上,治疗诱发衰老预计将比治疗更有效诱导静止(31日]。这是因为衰老是不可逆转的,也因为衰老细胞可以通过吞噬作用更容易消除,这一过程会导致肿瘤回归(32]。然而,这些数据表明,GLPG1790诱导的能力最大的治疗效果与CRC进展可能取决于目标细胞的分子特性。

能够诱导静止或衰老取决于几个信号通路,包括p53和RAS / erk / MAPKs [22,23),开车的发病和进展CRC (2,3]。尽管没有突变状态之间的关系曾被证明p53或RAS / erk / MAPKs和弗信号调节异常,我们决定调查的蛋白质是否在调停角色GLPG1790-induced效果。沉默与siRNA特定蛋白质p53增强GLPG1790导致HCT15衰老细胞的能力,而对HC116产生相反的效果,这表明p53的角色在细胞环境而异。p53WT和p53太,分别表示,HCT116 HCT15 [12),分别是促进或降低,激活衰老的CRC (22,34,35]。这个证据似乎表明p53的突变状态可能影响的能力GLPG1790诱导衰老p53突变的存在,已知致癌特性获得由于功能获得突变(36),有一个负面影响GLPG1790的治疗效果。此外,GLPG1790 HCT116 p53的表达水平增加,没有引起任何调制HCT15细胞强化p53的想法WT同时提供中介p53太抵消由GLPG170衰老引起的。然而,需要进一步的测试来确认是否确实有p53的突变状态之间的关系和弗抑制剂的治疗效率。

大约30%到50%的crc表达突变RAS基因促进本构的激活ERK / MAPK信号通路下游[37]。这个途径是细胞增殖和转换的主要监管机构,促进CRC发病,而维持CRC进展(38]。有趣的是,弗是几个已知的受体酪氨酸激酶负调控RAS及其下游信号通路在不同的细胞类型(39)不过,在某些情况下,弗受体激活,而不是抑制MAPK信号(40]。我们也有先前的报道所示表达下调GLPG1790引起不可逆转的生长逮捕和分化的细胞ERK在RMS (11]。这里,GLPG1790强烈和持续增加的磷酸化/激活ERK信号HCT116细胞表明RAS和弗信号之间的关系类似于RMS的细胞。然而,这一事实RMS (40]和CRC [12)细胞系表达持续激活RAS,无法监管,表明弗可以调节ERK激活下游的RAS。这也可以解释为什么GLPG1790未能调节HCT15细胞erk表达持续活跃的Ras。有趣的是,p53WT已被证明对ERK激活(41],HCT15 p53突变的存在可能的原因未能激活erk和GLPG1790治疗后。鉴于erk在促进肿瘤发生的作用,他们在HCT116 GLPG1790激活似乎不利。然而,根据时间、大小和其亚细胞定位的erk激活各种有利的细胞反应可能会受到影响,如增殖、迁移、分化和死亡(42]。虽然文学经常强调增强ERK活化的致癌潜力,越来越多的研究表明,冲突,在一定条件下,异常的ERK激活可以促进抗癌效果包括衰老和细胞死亡43]。GLPG1790-mediated激活erk的生物学意义需要进一步研究;然而,抑制ERK信号减少衰老表明antioncogenic作用的蛋白质。

CRC细胞逐渐获得转移表型。虽然一些分子机制已被证明编排这一过程,发挥关键作用的EMT已被证明(44,45]。EMT是一个生物过程,允许极化上皮细胞获得间充质细胞表型特征是一个增强的迁移能力和侵袭性(44,45]。考虑到弗信号主要是调节细胞间的相互作用,我们认为GLPG1790可能会扰乱EMT过程通过减少CRC细胞迁移的能力。证实了我们的假设这里收集的数据。此外,GLPG1790更强烈破坏EMT在HCT116 HCT15,符合p53的作用导致转移(46]。

因为自然的限制在体外研究模型中,我们还检测了GLPG1790异种移植模型的有效性。,我们已经表明,尽管GLPG1790有效地阻止EphA2磷酸化在肿瘤来源于HCT116——或者HCT15-xenografted老鼠,GLPG1790 HCT116肿瘤更敏感。这些结果支持在体外数据,合在一起,表明p53的存在WT代表了最佳条件弗inhibition-based治疗CRC的使用。

CRC的发病率和死亡率在过去二十年中下降。这样的成功归因于CRC的早期发现和治疗47];然而,CRC仍是一个无法控制的疾病和癌症相关死亡的第二大原因。这项研究的结果表明了临床前在体外和在活的有机体内抗肿瘤活性GLPG1790,一个新的强有力的锅弗受体抑制剂,反对人类CRC细胞。这里收集的数据进一步表明p53的突变状态可能影响CRC的响应性细胞疗法针对弗。考虑到这里使用的CRC细胞系来自不同的肿瘤完全不同的遗传背景,当然其他分子可能参与调节响应在CRC GLPG1790细胞。这些结果表明针对弗信号可用于信号transduction-based治疗CRC证在临床前和临床CRC进一步测试试验。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

伦理批准

研究动物模型进行根据准则建立了拉奎拉大学的医学院和科技学校董事会规定,不符合意大利政府监管。116年1月27日,1992年,国家/国际动物保健和使用指南。本研究伦理委员会批准的医学院大学的拉奎拉(555/2017-PR)。这篇文章不包含任何研究与人类参与者。

的利益冲突

菲利普Beirinckx, Philippe Pujuguet Laurent Saniere,艾伦Van der Aar是加拉帕戈斯群岛NV的员工。其他作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

弗朗西斯科·Marampon Colapietro亚历山德罗,克劳迪奥·Festuccia同样起到了推波助澜的作用。CA、GLGIP FP, BS, ADF,如果计划和执行实验;FB, PP、LS、EVdA开发和合成GLPG1790;RM,房颤,DM,英孚,美联社,VT分析数据;调频和CF和批判性的修订手稿。

确认

这项工作是支持的部分“FIVA Confcommercio”。

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