长非编码RNA Lnc-TLN2-4:1抑制胃癌转移与患者生存

文摘

胃癌(GC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,和GC患者的肿瘤转移会导致糟糕的结果。长非编码rna (lncRNAs)已成为新的监管分子在肿瘤转移中起到至关重要的作用。然而,众多的生物功能和底层机制lncRNAs GC转移在很大程度上仍不清楚。lnc-TLN2-4:1,在这里,我们报告一个小说lncRNA的表达式是减少GC组织与正常组织,和其低表达参与了GC的淋巴结和远处转移,以及贫穷的GC患者的总体生存率。我们进一步发现lnc-TLN2-4:1抑制GC细胞迁移和入侵的能力,但并不影响GC细胞增殖和证实lnc-TLN2-4:1主要位于GC细胞的细胞质中。然后我们发现lnc-TLN2-4:1 TLN2的mRNA和蛋白表达增加GC细胞之间存在着正相关的表达lnc-TLN2-4:1 TLN2 mRNA在GC组织。集体,我们发现了一个小说lncRNA lnc-TLN2-4:1,在GC, lnc-TLN2-4:1压制细胞迁移和入侵。与贫穷相关的低表达lnc-TLN2-4:1 GC患者的总体生存率。这些表明,GC期间lnc-TLN2-4:1可能是一个肿瘤抑制转移。

1。介绍

胃癌(GC)是第五位最常见的癌症和全球癌症死亡的第三大原因(1]。早期的GC患者受到操作有令人满意的结果。然而,对于患者先进的GC,尽管成功的手术和优化化疗,生存时间仍然仍然贫穷(2]。导致病人死亡的主要原因是GC转移(3),但潜在的机制基本上仍不清楚。

长非编码rna (lncRNAs)是一类单一的rna与超过200个核苷酸长度和不能编码蛋白质(4]。在过去的十年里,lncRNAs已经证明扮演重要角色在各种各样的疾病,包括癌症。例如,lncRNAs可以影响细胞增殖、凋亡、迁移、入侵,坚持,等,在恶性肿瘤的发展5]。有几个在lncRNAs监管机制,如(1)lncRNAs与蛋白质相互作用,产生的功能性改变的蛋白质或细胞器官的位置(6];(2)内源性rna吸收microrna lncRNAs作为竞争力,从而控制microrna的表达的靶基因(7];(3)lncRNAs也绑定到mrna然后防止mrna退化,或影响他们的翻译8]。最近的一份报告显示,lncRNA GMAN促进ephrin A1 (EFNA1) mRNA翻译成蛋白质通过绑定到反义GMAN-AS EFNA1 mRNA的补充,导致GC的增强能力细胞转移和入侵,这样就导致GC转移和病人生存(9]。即便如此,GC,有许多lncRNAs尚未确定及其生物功能和底层机制尚未研究。有趣的是,在我们之前的微阵列数据的分析(GSE58828),我们发现一个不明lncRNA, lnc-TLN2-4:1的表达明显减少GC组织与正常组织匹配。然而,这个lncRNA GC的作用和机理仍然未知。

蛋白(TLN)起着关键作用的细胞迁移,入侵和癌症转移(10]。TLN基因编码两种TLN亚型,TLN1 TLN2。TLN2是由2532个氨基酸组成的74%相同的相似(86%)对人类TLN1含有2541个氨基酸,和完整的排序表明,较低的真核生物只编码一个对应TLN1 TLN基因,而脊椎动物有两个TLN基因(11),这表明TLN2在这些物种都具有特定的功能。在过去的几十年里,大量的研究已经证明TLN1生物功能的几种类型的癌症的发展(12- - - - - -15GC(),包括16),但没有证据表明关于TLN2在GC转移的作用。

在目前的研究中,我们发现小说lncRNA lnc-TLN2-4:1,位于GC细胞的细胞质的表达式是减少GC组织与正常组织和参与贫困GC患者的总体生存率。我们进一步发现lnc-TLN2-4:1 GC过度抑制细胞迁移和入侵,但并不影响GC细胞增殖。这些表明,GC期间lnc-TLN2-4:1可能是一个肿瘤抑制转移。

2。材料和方法

2.1。病人和标本

49条新鲜的人类GC从允许个人在这项研究中收集的样本根据指令在新桥医院伦理审查委员会批准的,军队医科大学(第三医科大学),从2013年到2017年。GC在手术室组织处理并存储在液态氮在10分钟。匹配的正常组织收集的距离> 5厘米的肿瘤组织,和所有组织确定组织学检查。没有一个病人接受化疗或放疗前操作。四年随访的49个GC病人了。

2.2。细胞培养

六个人类GC细胞系(AGS、MKN45 MGC803, BGC823, SGC7901、和MKN74)从希伯来文名字购买文化集合(BNCC)。AGS细胞的F12培养基培养(美国UT HyClone Logan)补充10%的边后卫(Gibco BRL),和其他细胞在DMEM培养/高葡萄糖中(美国UT HyClone Logan)补充10%的边后卫(Gibco BRL) 37°C的氛围中5%的股份有限公司₂。

2.3。RNA提取、定量逆转录酶聚合酶链反应(存在)和免疫印迹

RNA提取的程序和试剂,存在,免疫印迹是描述在我们之前的研究17]。中存在的实验,lnc-TLN2-4:1的表达和TLN2规范化的内部控制,β肌动蛋白,使用2^-ΔΔCt方法。引物序列为:TLN2意义:5′ACGGCGGAACCAGAGGAGAT3′, TLN2反义:5′GGTGTCCAGGTCGGCAATGAT3′;lnc-TLN2-4:1意义:5′GCTGGCTGCTTCTGAGACTTAC3′, lnc-TLN2-4:1反义:5′TGGAGCAACAGACTGAGGACAT3′。PCR的参数运行1分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期为30秒15秒和60°C。免疫印迹,anti-TLN2抗体(ab108967)从Abcam购买,中国(上海,中国),和HRP-conjugated二级抗体购自中山生物技术(中国,北京),和所有抗体都是根据制造商的指示。

2.4。向量和慢病毒结构

LV5-V6256-1向量包含lnc-TLN2-4:1 cDNA序列合成一个公司,GenePharma(上海,中国)。我们之前描述的慢病毒建设研究(18]。

2.5。细胞迁移、入侵和扩散

细胞迁移的过程和试剂,入侵和扩散实验描述在我们之前的研究18]。BGC823和SGC7901细胞转染与控制或lnc-TLN2-4:1-overexpressing向量被用来执行细胞迁移,入侵和扩散实验。细胞迁移和入侵的统计数据是基于从每个transwell三个不同区域的图像。

2.6。统计分析

所有数据提出了意味着±标准差或标准误差。两组之间的差异进行了分析使用学生的t测试或Mann-WhitneyU测试。单向方差分析是用来分析三个或更多组之间的差异。接受者操作特性曲线(ROC)被用来评估区分两组的力量。病人使用kaplan meier生存分析方法和生存率较。被认为是具有统计学意义。所有使用SPSS 19.0统计分析(美国芝加哥,IL)和8.0 GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,加州)。

3所示。结果

3.1。Lnc-TLN2-4:1表达式通常是减少GC组织与正常组织和与GC转移有关

找到一个小说lncRNA这可能是GC的监管功能的发展,我们分析了数据从一个lncRNA微阵列(GSE58828)进行在我们之前的研究19]。基于严格的筛选标准(褶皱变化> 2, ,和lncRNAs的长度是1000元至2000元),我们发现一个不明lncRNA, AF070527的表达减少三个GC组织与匹配的正常组织相比(图1(a))。这个lncRNA的名称已经更新在LncBook lnc-TLN2-4:1,人类lncRNAs策划知识库(https://bigd.big.ac.cn/lncbook/index)。Lnc-TLN2-4:1是一个基因间lncRNA示没有编码能力(LncBook)。

进一步确定lnc-TLN2-4:1在GC的确切表达,我们收集了49对GC匹配组织和正常组织的入学GC的病人。中存在的实验显示,lnc-TLN2-4:1的表达明显减少GC组织与正常组织(图相匹配1(b))。我们接下来分析了GC的临床特征的相关性lnc-TLN2-4:1的表达,发现患者的表达lnc-TLN2-4:1显著减少GC组织与淋巴结转移、远处转移、TNM I期和II相比,没有淋巴结转移、远处转移、TNM阶段III和IV(数字1(c) -1(e))。然而,并没有相关lnc-TLN2-4:1的表达与患者的性别和年龄、肿瘤大小和分化(数据没有显示)。这些数据表明,lnc-TLN2-4:1是小说lncRNA显著降低GC和GC转移相关。

3.2。Lnc-TLN2-4:1表达式与GC患者的总体生存率

我们下一个决心lnc-TLN2-4:1在GC组织的表达是否有诊断GC。接受者操作特征曲线(ROC)分析显示0.7071的AUC,的敏感性65.31%,特异性81.25%,截止值为1.246时,在不同的GC组织与正常组织(图2(a)), 0.733的AUC,的敏感性70.97%,特异性72.22%,截止值为1.016,在区分GC组织与淋巴结转移和无淋巴结转移(图2(b))。我们进一步分析的相关性lnc-TLN2-4:1表达式与GC患者的总体生存率的基础上,从两个以上ROC曲线获得不同的截止值截断值为1.246时,发现用于定义lnc-TLN2-4:1的低或高表达,没有显著差异的总体生存率GC之间的低和高表达患者lnc-TLN2-4:1(图2(c))。然而,当截止值为1.016,总体生存率的显著差异是观察(图2(d))。这些数据表明,lnc-TLN2-4:1表达式为GC可能预后标记。

3.3。Lnc-TLN2-4:1压制GC细胞迁移和入侵在体外

如上述,lnc-TLN2-4:1的异常表达与GC转移;因此,我们直接调查lnc-TLN2-4:1能否影响GC细胞的迁移和入侵。执行功能,我们测量六GC lnc-TLN2-4:1细胞系的表达,包括AGS MKN45, MGC803, BGC823, SGC7901和MKN74发现BGC823和SGC7901几乎最低的表达lnc-TLN2-4:1(图3(一个));因此,我们进行了两个GC lnc-TLN2-4:1细胞的异位表达使用慢病毒包含lnc-TLN2-4:1-overexpressing向量(图3 (b))。伤口愈合和transwell化验表明,upregulation lnc-TLN2-4:1显著抑制BGC823和SGC7901细胞的迁移和入侵在体外(数据3 (c)和3 (d))。因为细胞增殖通常发生在GC开发,包括GC转移,我们也确定lnc-TLN2-4:1 GC可能影响细胞增殖。然而,基于CCK-8工具包的化验显示lnc-TLN2-4:1超表达不能修改BGC823和SGC7901细胞的增殖能力(图S1)。这些数据表明,lnc-TLN2-4:1可能是一个肿瘤抑制压制GC细胞转移但不扩散。

3.4。Lnc-TLN2-4:1位于GC细胞胞浆,其表达与TLN2表达呈正相关GC组织

好理解底层机制的lnc-TLN2-4:1 GC转移,我们确定的位置lnc-TLN2-4:1 GC细胞因为lncRNA的监管机制是制约它的位置。我们发现lnc-TLN2-4:1 BGC823细胞主要位于胞浆,和lnc-TLN2-4:1的表达显著增加在BGC823细胞的细胞质的异位表达与野生型相比lnc-TLN2-4:1表达lnc-TLN2-4:1(图4(一)- - - - - -4 (c)的位置),这表明在GC lnc-TLN2-4:1细胞的异位表达相应的自然位置和反映其真正的功能。TLN2是一个编码基因已被报道参与癌症转移。由核苷酸爆炸,我们发现在lnc-TLN2-4:1和TLN2 mRNA存在大量重叠的核苷酸。因此,我们应该lnc-TLN2-4:1能否在GC细胞调节TLN2 mRNA的表达。存在和免疫印迹实验表明lnc-TLN2-4:1 upregulation显著增加的mRNA和蛋白表达TLN2(数字4 (d)和4 (e))。我们进一步分析了lnc-TLN2-4:1和TLN2 mRNA的表达在GC组织和发现之间存在正相关的表情在49 GC组织(图4 (f))。这些数据表明,GC lnc-TLN2-4:1抑制转移通过调节TLN2 mRNA的表达。

4所示。讨论

Lnc-TLN2-4:1预计没有编码能力和1558元的长度。在这项研究中,我们发现lnc-TLN2-4:1表达显著减少GC组织与正常组织和与GC细胞淋巴结和远处转移。ROC分析表明lnc-TLN2-4:1表达有可能预测能力区分GC组织和正常组织,和减少表达lnc-TLN2-4:1密切参与贫穷GC患者的总体生存率。到目前为止,有数百名lncRNAs已确定异常表达在GC发展和为GC也被视为潜在的生物标记物检测。例如,卓等人报告lncRNA GMAN,在GC组织与nontumor组织及其upregulation也与贫穷相关的整体存活率GC患者(9];张等人报告一个lncRNA HOXC-AS3的表达式是增加GC组织与nontumor组织和与临床结果的GC [20.]。这些实例表明,GC lncRNAs可能是一个潜在生物标志物检测,和我们的研究结果还表明,lnc-TLN2-4:1可能是一种新型生物标志物的诊断和预后GC和GC期间暗示它可能有一个重要的角色转移。

在GC确定lnc-TLN2-4:1的生物功能,我们选择两个GC细胞株BGC823 lnc-TLN2-4:1和建造的低表达与稳定SGC7901细胞异位表达lnc-TLN2-4:1使用慢病毒包含lnc-TLN2-4:1-overexpressing向量。这种效应的异位表达lnc-TLN2-4:1被确认存在和免疫荧光。稳定修改使用慢病毒表达lncRNAs是广泛应用于研究其生物学功能,如在我们之前的研究18]。lncRNAs的生物功能是细胞内与位置密切相关,和免疫荧光实验的结果在我们的研究表明,与异位表达lnc-TLN2-4:1的位置是对应于其自然的位置。我们的研究结果显示,lnc-TLN2-4:1 upregulation可以显著抑制GC的迁移和入侵细胞,但不影响GC细胞增殖,表明lnc-TLN2-4:1作为肿瘤抑制在GC转移。

解决底层机制lnc-TLN2-4:1压制GC转移,我们寻找lnc-TLN2-4:1的候选靶基因。因为lnc-TLN2-4:1位于细胞细胞质中,我们认为lnc-TLN2-4:1调节TLN2 mRNA稳定的可能性。大量的研究报道,lncRNAs可以防止信使rna降解[21,22]。特定的稳定lncRNAs对mrna的影响是基于互补的碱基配对,和我们的研究结果显示,lnc-TLN2-4:1完全重叠的核苷酸序列TLN2的3′末端片段。我们进一步的调查显示,lnc-TLN2-4:1 upregulation增加TLN2在GC的mRNA表达细胞之间存在着正相关的表达lnc-TLN2-4:1 TLN2 mRNA在49 GC组织。这些数据表明,GC lnc-TLN2-4:1抑制转移通过调节TLN2 mRNA的表达,但底层机制需要确定在未来。

总之,我们发现了一个小说lncRNA lnc-TLN2-4:1, GC组织中表达下调与匹配的正常组织和其低表达与GC转移和穷人GC患者的总体生存率。我们进一步发现lnc-TLN2-4:1压制GC细胞迁移和侵袭的能力,和GC lnc-TLN2-4:1促进TLN2的表达细胞之间存在着正相关的表达lnc-TLN2-4:1和TLN2 GC组织。这些数据表明,lnc-TLN2-4:1可能GC的治疗目标。

数据可用性

所有生成的数据或分析在本研究中包括发表的这篇文章(及其补充信息文件),和更详细的数据可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Yuyun吴和宁波豪了同样的工作。

确认

本研究由国家自然科学基金支持的中国没有。81502132)和重庆科技委员会基金(没有。cstc2015jcyjBX0021)。

补充材料

图S1。Lnc-TLN2-4:1剂量不影响BGC823和SGC7901细胞增殖的能力。(A和B)的增殖能力BGC823和SGC7901细胞转染的控制或使用CCK-8工具包lnc-TLN2-4:1-overexpressing向量进行了分析。(补充材料)

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