基于综合代谢组学-蛋白质组学分析的非小细胞肺癌细胞奥西替尼耐药的病理机制研究

摘要

出身背景．Osimertinib是t790m突变型非小细胞肺癌的一线治疗选择，获得性耐药阻碍了其应用。找出奥西替尼耐药的潜在机制，以寻找新的治疗方法是一项迫切的挑战。方法．本研究采用了基于超高效液相色谱-线性离子阱-轨道rap质谱的细胞代谢组学和定性和串联质谱标记的蛋白质组学。结果．分别鉴定出54个差异代谢物和195个差异表达蛋白。氨基酸代谢明显改变。在奥西替尼耐药过程中，调节p -糖蛋白表达的HIF-1信号通路、调节survivin表达的PI3K-Akt通路和氧化磷酸化上调，调节NO生成和糖酵解/糖异生的精氨酸和脯氨酸代谢下调。结论．调控HIF-1和PI3K-Akt信号通路、能量供应过程和氨基酸代谢是治疗奥西替尼耐药的有效手段。

1.导言

肺癌，特别是占肺癌病例80%以上的非小细胞肺癌(NSCLC) [1]，已成为各种恶性肿瘤中最常见和最致命的癌症之一，发病率为16%，死亡率为18.4% [2]在非小细胞肺癌患者中，表皮生长因子受体（EGFR）突变病例的百分比在西方国家约为15%，在亚洲国家约为40%[3.]对于EGFR突变的NSCLC患者，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR TKIs）已成为首选的靶向治疗方法，它可以有效地结合到EGFR酪氨酸激酶结构域的ATP结合口袋以阻断下游信号通路[4- - - - - -6]．在给药的前6个月，egfr突变的NSCLC患者对第一代和第二代EGFR-TKIs敏感，但随后，超过50%的患者病情进展 ．编码EGFR基因中的Thr790位点突变（T790M）[7，8]。对于T790M阳性NSCLC患者的治疗，第三代EGFR TKIs，如奥西美替尼（AZD9291），于2015年获得食品和药物管理局批准[9]．

Osimertinib作为一种不可逆的EGFR-TKI，确实影响t790m突变NSCLC患者的治疗策略，其客观缓解率约为60%，无进展生存期为9个月[9- - - - - -11]．然而，自2015年起，奥西替尼获得性耐药又一个接一个出现。获得性抗性可分为两种改变，一种是EGFR改变，如C797S突变[12]，另一种是改变激活下游信号，绕过EGFR，维持EGFR的致癌作用，或启动平行信号通路，促进癌细胞转移[13，14]．虽然获得性耐药的一些机制已经被确定，但仍有许多隐藏的耐药机制成为有效EGFR靶向治疗的主要障碍。

系统生物学已经成为一个关键的工具，它整合来自基因、蛋白质和代谢物的生物信息，以发现生物体、组织或细胞的生理和病理状态的潜在机制[15，16]．本研究采用代谢组学与蛋白质组学分析相结合的方法，揭示非小细胞肺癌H1975细胞转化为奥西替尼耐药H1975细胞的生物学变化。本研究将有助于发现新的奥西替尼耐药机制，并为克服奥西替尼耐药提供一些启示。

2.材料和方法

2.1.材料

MTS细胞增殖比色分析试剂盒从Abcam（英国剑桥）购买。奥西米替尼从Selleck Chemicals（美国德克萨斯州）购买。UPLC级甲醇、乙腈和分析级甲酸从Merk（德国达姆施塔特）获得。去离子水通过Milli-Q系统（美国马萨诸塞州贝德福德）净化.尿素、三氯乙酸、碘乙酰胺和三（s-羧乙基）-膦（TCEP）购自Sigma Aldrich（美国圣路易斯）。胰蛋白酶购自Promega（美国威斯康星州）。膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒购自BD Biosciences（美国新泽西州）。抗丙酮酸激酶PKM（PKM）、整合素β3（ITGB3）的抗体，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PCK2），和β-肌动蛋白从英国剑桥Abcam获得。抗ATP合成酶蛋白（ATP8）、纤溶酶原激活物抑制剂1（SERPINE1）和甘氨酸氨基转移酶（GATM）的抗体从细胞信号技术公司（MA，美国）购买。HRP结合二级抗体从Bios，Inc.（中国北京）获得.所有细胞培养试剂均从Gibco BRL Life Technologies（美国马里兰州）购买，所有化学品均为分析级。

２.２.细胞培养

人非小细胞肺腺癌细胞株(H1975)购自美国型培养收集(ATCC, Rockville, MD, USA)，在含有100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，37℃加5% CO湿化培养箱₂．每天喂H1975细胞，当它们接近80%的一致性时进行传代培养。

2．3.奥西替尼耐药细胞系的建立

将H1975细胞以1 × 10的密度置于96孔板中⁴细胞/完全培养基，培养过夜。为建立奥西替尼耐药(OR)细胞，将细胞置于含5 × 10的培养基中培养⁻⁸mol/L奥西替尼作用近60 h。然后在新鲜完全培养基中再次培养，选择指数生长的细胞作为潜在的OR细胞。潜在的OR细胞在含有奥西替尼的培养基中经历了几个周期的培养，并在指数生长期被选择。在循环过程中，奥西替尼的浓度由5 × 10增加⁻⁸mol/L至5 × 10⁻⁶mol / L。在含5 × 10的培养基中孵育6个月后⁻⁶mol/L奥西替尼，细胞变成OR细胞。OR细胞也每天喂食，当它们接近80%的一致性时进行传代培养。

２.４.细胞生存能力分析

采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-巯基苯基)- 2h -四唑(MTS)法研究奥西替尼作用下H1975细胞和OR细胞的细胞活力。将H1975细胞和OR细胞分别以1 × 10的密度镀于96孔板中⁵将细胞/孔置于完全培养液中浸泡24小时。然后，将H1975细胞和OR细胞分别置于含有0,10的培养基中孵育⁻¹⁰， 10⁻⁹， 10⁻⁸， 10⁻⁷， 10⁻⁶, 10⁻⁵ 摩尔/升奥西美替尼72 h、 72岁以后 h孵育，H1975和OR细胞在MTS试剂中培养4小时 h、 然后，在光密度（OD）490处测量吸光度 用微孔板读取器（美国加利福尼亚州Bio-RAD）将H1975和/或未经奥西米替尼处理的细胞的OD值视为OD（未处理），细胞活力表示为细胞生长（%） = OD（已治疗）/OD（未治疗）。

2．5．细胞凋亡检测

细胞培养于密度为2 × 10的6孔板中⁵细胞/孔，用完整培养基培养24 h，然后用10⁻⁵mol/L奥西替尼作用8 h。收集细胞，用冰冷的PBS洗涤3次，然后用1x结合缓冲液重悬。100年μL细胞悬液用1/1000 (v/v) Annexin v - fitc染色，室温黑暗20分钟。然后，用冰冷的PBS洗涤细胞，用稀释的含有2的结合缓冲液染色μg/mL碘化丙啶。采用流式细胞仪(Beckman Coulter, CA, USA)检测细胞凋亡情况。采用FlowJo软件(Tree Star, OR, USA)对数据进行分析。

2.6。细胞周期分析

为了评估细胞周期阻滞，将H1975和OR细胞置于6孔板中培养24 h，然后用10⁻⁵mol/L奥西替尼作用8 h。PBS洗涤细胞，4℃固定15分钟。固定细胞用50℃洗涤染色μg/mL PI在100μ克/毫升核糖核酸酶。然后用流式细胞仪(Beckman Coulter, CA, USA)分析细胞，用ModFit软件分析细胞周期谱。

2.7。代谢组学分析的样品制备和LC-MS条件

一个100μL细胞颗粒悬浮于500μL甲醇在−80°C预冷。细胞悬液旋转30 s，然后在液氮中快速冷冻。冷却后的细胞在室温下解冻，涡旋30 s，然后在800 ×g离心1 min。细胞上清储存在干冰上的管中。未淬灭的细胞重复冻融循环。收集所有细胞上清于1管中，于15000×g离心1 min。上清液在30℃真空浓缩吹干，然后用300溶解μL 2-氯苯丙氨酸甲醇水溶液(1:1,4℃)LC-MS分析。

使用Waters ACQUITY超高效液相色谱(UPLC)系统(Waters Corporation, Milford, USA)和Thermo (Thermo Fisher Scientific, Inc.)的线性离子阱(LTQ)-Orbitrap XL质谱仪。Waters ACQUITY HSS T3色谱柱(2.1 mm × 150 mm, 1.8μm） 用于代谢物分离。流速为0.25 mL/min，柱保持在40°C。A 4 μ各样品的分配量注入UPLC系统。最佳流动相由线性梯度体系(一个)在水中加入0.1%甲酸及(B0.1%甲酸乙腈:0-1.0 min，B0 - 2%;1 - 9.5分钟,B2 - 50%;9.5 -14分钟,B50% - -98%;14日至15日,B98%; 15–15.5 闵，B98 - 2%;15.5 -17分钟,2%。两组均为阳性(ESI)⁺)和阴性(ESI⁻)电离模式和最佳分析条件如下：喷雾电压为4.8 正向模式和4.5 kV 剪切气体和辅助气体分别设置为45和15个任意单位。毛细管温度为325℃，毛细管电压为3.5 正向模式和1.5 kV 负模为kV，管电压为50 V表示正模式，50 V表示阴性模式。获取的完整扫描范围为m/z89至1000 Da的分辨率为60000。碰撞能量设置为30 对先前碎片化的前体离子进行eV和动态排斥，重复时间为15分钟 s

2.8。样品重复性和LC-MS系统稳定性

为保证代谢组学结果的准确性，对LC-MS体系的稳定性和代谢组学方法的重复性进行了评价。在稳定性评价方面，质量控制(QC)样品是每次细胞提取的汇集样品，在整个过程中每6个样品注射到LC-MS系统中，QC样品在主成分分析(PCA)得分图中紧密聚类(附图)1)这表明LC-MS系统的稳定性非常好。对于重复性评估，相对标准偏差（RSD）分析了六种萃取离子在LC-MS光谱中的峰面积和保留时间，峰面积的RSD小于8.0%，保留时间的RSD不大于1.0%，表明该分析方法重复性好。

2.9。代谢组学数据分析

原始数据通过Proteowizard包(v3.0.8786)转换成mzXML格式，然后通过R语言(v3.3.2)处理，进行反褶积、对齐和数据缩减。使用SIMCA-P软件(v13.0, Umetric, Umeå， Sweden)对紫外线分级代谢产物数据矩阵进行无监督PCA，以评估H1975和OR组数据集的内在特征。采用监督正交投影潜结构判别分析(OPLS-DA)对H1975和OR细胞进行分组和含量差异分析应用交叉验证方差分析(CV-ANOVA)的值评价其信度。

为了揭示潜在的微分变量，对OPLS-DA分析的s图和投影(VIP)图中的变量影响进行了积分。通过将差异变量的精确分子质量与HMDB、METLIN和KEGG数据库的数据进行比对，以质量偏差< 5ppm和高i-Fit值为标准，确定潜在的代谢物。MS/MS片段、同位素分布和保留时间也用于代谢物鉴定。累积ROC曲线下面积(area under ROC curve, AUC)，临界值为0.8，评价差异代谢物的鉴别能力。构建以欧氏距离聚类的差异代谢物热图，利用MetPA进行代谢途径分析。

2.10。蛋白质样品制备

100年μL细胞球溶于300μL裂解缓冲液(8 mol/L尿素，1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒)，用高强度超声处理器超声三次(Scientz, Ningbo, China)。蛋白液于15000×g 4℃离心10 min，按厂家说明书使用bicinchoninic acid (BCA)试剂盒检测上清液中的蛋白浓度。

以5 × 10还原蛋白溶液⁻³mol/L二硫苏糖醇在56℃下反应30 min，然后用11 × 10烷基化⁻³mol/L碘乙酰胺室温避光15min。用0.1 mol/L三乙基苄基铵(TEAB)稀释蛋白溶液，将尿素浓度调节至小于2 mol/L。最后将胰蛋白酶以1:50 (w/w)的比例加入蛋白溶液中，在37℃下消化过夜。蛋白样品用5%甲酸脱盐，然后按照制造商的说明用6-plex TMT试剂盒标记(Applied Biosystems, CA, USA)。

2.11。蛋白质组学分析的LC-MS条件

将标记的肽溶解在10%的溶液中⁻²mol/L乙酸铵水溶液(pH = 10.0一个)，然后装入Waters BEH C18柱(2.1 mm × 150 mm, 1.7μm)。流速为0.25 mL/min，流速为50μ各样品的分配量注入UPLC系统。最佳流动相由线性梯度体系(B) 10⁻²mol/L乙酸铵在90%乙腈中(pH = 10.0): 0-35.0 min，B0 - 45%;35.0 - -37.0分钟,B45–80%; 37.0–40.0 闵，B80%;40.0 - -42.0分钟,B0 80%;42.0 - -45.0分钟,B0.全扫描质谱图(来自米/z400-1500)，由分辨率为60000的轨道rap分析仪收集米/z200.自动增益控制设置为3 × 10⁶．15个最强烈的离子以32%的归一化能量进行碰撞诱导离解。最佳质谱分析条件为:喷雾电压为2.2 kV。毛细管温度设定在320°C，使用MS2的32%宽带激活模式归一化碰撞能量。离子选择阈值为5万离子强度，激活时间为80 ms。

2.12。蛋白质组信息数据分析

使用Proteome Discoverer软件(v2.1 thermo fisher scientific, Inc)过滤MS/MS光谱，然后使用Proteome Discoverer序列在Uniprot-Swissprot数据库(Homo sapiens)中搜索。MS/MS搜索对前体离子的质量容限分别为10 ppm和50 mmu。氨甲酰亚胺在Cys上的修饰为固定修饰，在Met上的氧化为可变修饰。过滤算法的假阳性率(FDR)调整为<1%。

基因本体（GO）注释蛋白质组源自Uniprot GOA数据库(http://www.http://www.ebi.ac.uk/GOA/)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库注释蛋白质通路。对注释的KEGG通路以及参与该通路的差异代谢物进行综合分析。

2.13。免疫印迹

蛋白提取步骤与2.10节相似。对等效蛋白样品进行12% SDS-PAGE检测，然后进行western blot分析。PVDF膜都被5%的脱脂牛奶TBST 1 h在室温下一夜之间,然后被孵化在4°C的主要抗体:反PKM (1: 1000), ATP8 (1: 1000), ITGB3 (1: 2000), GATM (1: 1000), SERPINE1 (1: 2000), PCK2 (1: 1000)β-Actin(1: 1000)。一抗孵育后，将PVDF膜与酶标二抗室温孵育1 h。用Immobilon™Western Chemiluminescent HRP Substrate检测试剂(Millipore, MA, USA)对蛋白进行染色，并使用Image Lab™软件(Bio-Rad, VA, USA)捕获。为了量化蛋白质的相对强度，目标蛋白质与β-肌动蛋白信号由ImageJ软件计算。

2.14.统计分析

所有数据均以均数±标准差(SD)表示。采用SPSS v.18.0统计分析软件(SPSS Inc.， Chicago, USA)进行统计学分析。H1975组和OR组之间的统计比较采用双尾学生组进行t以及和值<0.05被认为是显著的。

3.结果

３．１．或对奥西替尼失去敏感性

采用MTS法检测H1975细胞和OR细胞对奥西替尼的敏感性。结果表明，H1975细胞对奥西替尼治疗敏感，且奥西替尼剂量依赖性地降低了细胞生长(%)(图)1(一))到10时，细胞生长率（%）几乎接近于0⁻⁵ mol/L奥西米替尼给药。然而，奥西米替尼治疗几乎不干扰OR细胞的生长，并且在10周内细胞生长（%）略有下降⁻⁵mol / L osimertinib(图1(一)）.这些结果表明OR细胞对奥西替尼失去了敏感性。

早期凋亡细胞仅用Annexin V染色，位于图中Q4区域1 (b)，而晚期凋亡细胞经Annexin和PI染色，位于图Q2区1 (b)．细胞凋亡评估包括早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞。刺激10后⁻⁵mol/L奥西替尼作用8 h后，H1975细胞凋亡百分率明显高于OR细胞凋亡百分率(图)1 (b)）.

与H1975细胞相比，经10倍刺激后，G1、G2期OR细胞百分率明显降低，S期OR细胞百分率增加⁻⁵ 摩尔/升奥西美替尼，用于8小时 h（图1 (c)）.

３.２．细胞代谢谱的分类和差异代谢物的鉴定

为了区分分类和评估整体代谢变化，在阳性和阴性谱中都进行了无监督PCA。阳性谱PCA 3D分值图显示H1975细胞和OR细胞的观察结果有明确的分类(图)2(一个)).与阳性光谱的PCA类似，H1975细胞和或细胞的观察结果在得分图中清楚地分为两部分，或细胞的观察结果位于左侧，H1975细胞的观察结果位于右侧，在阴性光谱的PCA中（图1）3(一个)）.为了进一步区分H1975细胞和OR细胞并识别差异变异，进行了监督OPLS-DA。在图2 (b)，在OPLS-DA评分图中，H1975组与OR组阳性数据显著分离(R²X= 0.423,R²Y = 1.问²= 0.95)和CV-ANOVA值为1.221E⁻⁴，表明该OPLS-DA模型是非过拟合的。在图3 (b)， OPLS-DA得分图(R²X= 0.565,R²Y = 1.问² = 0.911，CV-ANOVA = 0.01635）的阴性数据显示，或组的观察值聚集在右象限，H1975组的观察值分布在左象限。从OPLS-DA的正模式和负模式加载S-和VIP值图中筛选和识别差异变体（图2 (c)和3 (c)）.差异变异对应的代谢物通过单因素ROC曲线分析进行验证，阈值为0.8。共鉴定出54种差异代谢物，差异代谢物的热图如图所示4(一)．

３．３．基于差异代谢物的途径分析

为揭示奥西替尼耐药最相关的生物学途径，采用MetPA进行独创性网络分析。富集和拓扑分析表明，奥西替尼抗性与氨基酸代谢有关，特别是精氨酸和脯氨酸代谢、嘌呤代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(图)4 (b)）.

3．4．差异表达蛋白鉴定及氧化石墨烯功能分析

在目前的研究中，我们采用TMT标记的定量蛋白质组学方法来研究奥西米替尼耐药性的潜在机制。原始数据是根据Uniprot Swissprot数据库（智人）进行搜索的，每个样本大约有5000个蛋白质被鉴定，FDR小于1%。

根据两种以上标准的fold-change进一步筛选差异表达蛋白 ．基于差异表达蛋白进行基因本体论(GO)分析。结果显示，共鉴定出195个差异表达蛋白(补充表)1)，这些蛋白主要富集于4个氧化石墨烯途径，包括化学反应途径(61个蛋白，FDR = 1.36e⁻⁵)，对外界刺激的反应（39种蛋白质，FDR = 2.25e⁻⁵)、细胞通讯调节(52种蛋白，FDR = 1.6e⁻³)和小分子代谢过程（38个蛋白质，FDR = 1.27e⁻⁶)(图5）.从GO分析结果来看，奥西替尼耐药主要与细胞对化学或外界刺激的反应和氨基酸代谢等小分子代谢过程有关。除GO分析外，KEGG分析显示奥西替尼耐药与糖酵解/糖异生、氧化磷酸化、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢等通路密切相关。在这些通路中，HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路和氧化磷酸化上调，而精氨酸和脯氨酸代谢和糖酵解/糖异生下调(图)6(一)）.图中标注了相应的蛋白质变化趋势6(一)，并在补充表中显示2．

3.5.通过蛋白质印迹验证蛋白质表达

为了验证上述组学中鉴定的信号分子的变异，我们采用western blots分析ITGB3、PCK2、PKM、GATM、SERPRINE1和ATP8的表达。结果显示，ITGB3、PCK2、SERPRINE1、ATP8在OR细胞中的表达明显升高，而PKM、GATM在OR细胞中的表达明显降低(图)6（b））.这一结果与上述组学分析中观察到的信号分子变化趋势相似，说明代谢组学-蛋白质组学分析的结果是可靠的。

4.讨论

EGFR下游平行或辅助信号通路的激活，如MET扩增和RAS信号通路的激活，在奥西替尼耐药中起关键作用[17]．Survivin是一种促生存因子，促进了对EGFR-TKIs的耐药性[18，19]，通过抑制PI3K-Akt信号通路降低survivin表达，增强肿瘤干细胞对EGFR-TLIs的化疗敏感性[19]．此外，阻断mTOR活性增强了胶质瘤细胞对EGFR-TKIs的敏感性，而mTOR也是PI3K-PTEN-Akt通路的下游信号分子[20].在目前的结果中，参与PI3K-AKT通路的10个差异表达蛋白上调，这表明与H1975细胞相比，PI3K-AKT信号通路在OR细胞中上调。此外，在OR细胞中AMP含量显著降低，这可能部分是由于参与了mTOR促进蛋白质合成的信号通路。

缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factors, hfs)是一种在缺氧环境下被激活以维持细胞活性的转录因子，在肿瘤耐药中发挥重要作用[21]．HIF-1可以通过结合MDR1启动子中的HIF-1结合位点诱导p -糖蛋白表达，p -糖蛋白是细胞内多药外排转运蛋白[22，23]因此，HIF-1信号通路与多药耐药密切相关。有研究表明，低氧环境下，人肺癌组织中HIF-1、P-糖蛋白的表达增加，耐药性增强[24]．在我们的研究中，IFN-γOR细胞中HIF-1上游蛋白受体和4EBP1有统计学意义升高，提示HIF-1信号通路上调，HIF-1表达增强。因此，与能量传递相关的TFRC表达上调。然而，与H1975细胞相比，OR细胞中与厌氧代谢相关的ENO1和GAPDH表达降低。与正常细胞不同，癌细胞总是从微环境中获得葡萄糖，并将多余的葡萄糖主要通过糖酵解而不是氧化磷酸化来转运，后者向正常细胞提供近80%的ATP [25]然而，一些报道支持氧化磷酸化在癌症进展中也起着至关重要的作用[26，27]．一组从不同肿瘤中分离出来的慢周期细胞表现出致瘤潜能和多药耐药的特征，这些慢周期细胞有一个共同的代谢过程，即能量的产生依赖于线粒体氧化磷酸化而不是糖酵解[28]在我们的研究中，糖酵解途径被下调，12种差异表达蛋白被降低，氧化磷酸化被显著上调，这表明OR细胞的代谢模式与那些慢循环细胞完全相似。一些研究还表明霉素（复合物V线粒体抑制剂）和酪氨酸激酶抑制剂会产生致癌信号的灭绝效应，这支持了我们的结果，即OR细胞具有恢复的氧化磷酸化[29]．因此，当癌细胞转化为奥西替尼耐药细胞时，能量供应格局发生了逆转。

能量供应的另一个关键部分是氨基酸代谢。氨基酸是能量稳态、线粒体呼吸和超氧化物产生的重要参与者和调节者[30.，31]在本研究中，代谢组学的结果表明氨基酸代谢明显改变，蛋白质组学的结果表明精氨酸和脯氨酸代谢在OR细胞中下调。精氨酸是合成NO、脯氨酸、肌酸和许多其他代谢物的主要来源，其中NO对癌症进展的调节起着至关重要的作用[32，33]．NO在低水平时可促进癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，而在高浓度时可抑制嗜铬细胞瘤PC12细胞增殖，促进癌细胞凋亡[34，35]．由此可见，OR细胞中精氨酸含量的降低和精氨酸代谢的下调表明其NO产生量低于H1975细胞，说明OR细胞具有较强的增殖和生存能力。

5.结论

总体而言，本研究采用了代谢组学和蛋白质组学相结合的多组学策略，以确定人类非小细胞肺腺癌细胞对奥西替尼耐药的潜在机制。结果表明，在OR细胞中鉴定出54个差异代谢物，这些差异代谢物大多位于氨基酸代谢途径。此外，在OR细胞中鉴定出195个差异表达蛋白，这些蛋白富集于氧化石墨烯通路，包括化学反应、外界刺激反应、细胞通讯调节和小分子代谢过程。奥西替尼耐药伴随着HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路和氧化磷酸化上调，糖酵解/糖异生及精氨酸和脯氨酸代谢下调。与H1975细胞相比，这些改变表明OR细胞中生存素和p -糖蛋白增加，无氧代谢减少，NO产生减少。因此，我们的研究结果表明，靶向survivin和p -糖蛋白的产生和能量供应过程可能是预防敏感癌细胞产生奥西替尼耐药的有前景的治疗方法。

数据可用性

所有用于支持本研究发现的数据均可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

马青负责概念化。马青和王静负责方法论。形式分析由任耀耀和泛鲁孟完成。泛陆孟进行了调查。原稿由马青和曾丽丽负责。审稿和编辑工作由马青、范禄孟完成。

致谢

国家自然科学基金项目(no . 81572268);天津市自然科学基金项目(no . 16JCYBJC24400);天津市医院科技基金项目(no . 2014KZ118)。

补充材料

在补充资料中，QC样品在正、负两种模式的PCA分值图中聚类紧密，说明LC-MS体系稳定性良好。在OPLS-DA检测中，H1975细胞与OR细胞差异表达的蛋白及富集的KEGG通路见表。（补充材料）

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