文摘

Epithelial-mesenchymal过渡(EMT)中扮演一个重要的角色在结肠直肠癌的浸润和转移,这是由FAK和EGF。然而,FAK是否参与EMT在结直肠癌细胞通过EGF /表皮生长因子受体信号通路仍然未知。本研究的目的是探讨FAK的效应机制的过程中EGF-induced EMT在结直肠癌细胞和mir - 217是否参与这一过程。Caco-2癌症细胞常规培养,没有100 ng / mL EGF治疗,并使用一个倒置显微镜观察细胞形态学变化。此外,transwell试验是用来检测细胞迁移的情况下EGF治疗。FAK的表达,pFAK,钙粘蛋白、波形蛋白和β肌动蛋白进行免疫印迹,mir - 217的表达是评估使用实时PCR。我们发现EGF诱导EMT在结直肠癌细胞,增强细胞迁移和入侵的能力。此外,FAK参与了EGF-induced EMT的结直肠癌细胞。表皮生长因子调节钙粘蛋白的表达在结直肠癌细胞通过激活FAK, mir - 217被发现参与EGF-induced EMT在结直肠癌细胞。我们的发现表明EGF诱导EMT在结直肠癌细胞通过激活FAK, mir - 217是参与EGF / FAK /钙粘蛋白信号通路。

1。介绍

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,转移是大肠癌的主要死因。然而,肿瘤转移是一个高度复杂的过程涉及多个因素和步骤。最近的研究表明,epithelial-mesenchymal过渡(EMT)中扮演一个重要的角色在肿瘤侵袭和转移1,2]。EMT的现象是指上皮细胞失去上皮特征和转变成间充质细胞在一定的生理或病理条件下。的变化导致细胞发生形态变化,表现出增强的迁移能力。EMT过程不仅包括细胞表型的变化,也改变在细胞标记,如上皮细胞标记的损失(如钙)和获得间充质细胞的标记(例如,波形蛋白和alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma))。研究表明,EMT的发生是一个复杂的过程,涉及肿瘤微环境,生长因子,激酶,转录因子,和微- rnas (microrna),但这个过程的具体机制仍不清楚。许多研究正在开展调查的详细机制EMT在肿瘤细胞的发生。

许多因素可以诱导肿瘤细胞EGF、EMT在结直肠癌细胞启动EMT通过EGF /表皮生长因子受体信号通路,从而促进入侵和转移。这会触发酪氨酸激酶的磷酸化,紧随其后的是启动的信号通路激活下游信号分子促进EMT。EGF进一步激活绑定EGFR磷酸化酶激酶,导致异常蛋白质表达和EMT的发生。然而,具体的机制仍不清楚。

FAK的中央枢纽各种信号通路。FAK调节的激活一系列信号通路和诱发EMT在各种肿瘤细胞(3),从而影响一系列的细胞生物学行为如增殖、生存、粘附、迁移,入侵和转移。然而,FAK的具体机制调节EMT的发生尚不清楚。迄今为止,很明显,上游分子主要结合其n端,导致Tyr397及其后续的快速磷酸化绑定不同的下游分子。这激活下游通路,诱导EMT在结直肠癌细胞(4)和增强他们的迁移能力。然而,尚不清楚这蛋白质和microrna参与这个过程。

单链,microrna是内生的,非编码小分子rna在真核生物中发现,调节基因的表达。发现各种异常的microrna的表达在肿瘤组织和被认为是参与调节的过程,如肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和入侵。这些将成为新的预后标记。据报道,mir - 217在乳腺癌组织中表达的高度5),也有报道称其表达下调在结直肠癌组织中(6]。然而,迄今为止没有报道是否mir - 217参与EGF-induced EMT在结直肠癌细胞。

它尚未确定是否参与了FAK EMT在结直肠癌细胞通过调节EGF /表皮生长因子受体信号通路。因此,本研究旨在探讨FAK是否参与大肠癌细胞的调节通过促进EMT通过EGF /表皮生长因子受体信号通路和迁移能力的增强。我们进一步寻求确定mir - 217是否参与这个过程提供一个理论依据临床新目标的识别。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类结肠癌细胞系Caco-2在RPMI1640培养在一个孵化器中包含100μ青霉素g / ml链霉素,100 U /毫升,和10%的胎牛血清。孵化器是维持在饱和湿度以5%的股份有限公司₂和一个温度37°C。细胞通常通过每隔3 - 5天,和0.25%胰蛋白酶是用于细胞消化每一次。所有实验进行细胞指数增长阶段。

2.2。转染mir - 207模拟

的mir - 207模拟和消极的控制(GenePharma公司、苏州、江苏、中国)与lipofectamineTM转染3000转染试剂。然后,细胞进一步培养12小时和播种到新的板块在适当的密度每口井的试验。

2.3。西方墨点法

细胞(1×10⁶)的控制和治疗组添加到6-well盘子,和200年µl细胞裂解缓冲(购自Beyotime)补充道。超声波裂解后,解决方案是离心20分钟,每分钟13000转,上层清液获得蛋白质量化采用BCA法。接下来,3 x样品缓冲是补充说,解决方案是煮5分钟,样本存储在冰箱−20°C。解决凝胶和叠加凝胶准备,20µ包含50 l样本获得的μ克蛋白质。SDS-polypropylene凝胶电泳进行叠加凝胶在60 V 60分钟和60分钟解决凝胶在120 V。然后将蛋白质转移PVDF膜,阻止了5%脱脂牛奶1小时。FAK, pFAK (397), pFAK(925),钙粘蛋白、波形蛋白和β肌动蛋白抗体主要是接着说,膜是孵化一夜之间在4°C。第二天,膜清洗与ttb三次,和山羊anti-rabbit二级抗体用辣根过氧化物酶标记(1:1000)是补充道,紧随其后的是屏蔽膜在室温下的1小时。膜与ttb洗10分钟三次,和ECL发光试剂的添加。照片拍摄和分析使用凝胶文档系统。

2.4。Transwell化验的迁移和入侵

为transwell化验有或没有人工基底膜,2%胎牛血清中加入下议院transwell,之后2.5×10⁵细胞被获得和加入1毫升的无血清细胞悬液。混合后,200μl细胞悬液的获得和播种在参议院transwell孔隙大小的8μ有或没有人工基底膜。transwell是37°C孵化器孵化24小时。transwell的内室被移除。剩余的细胞腔内被用棉签,和美国商会是在室温下干燥1小时。商会与结晶紫染色15分钟,用自来水冲洗,干燥,在显微镜下拍摄的。五20 x视觉领域选择在每个室,和细胞计数。细胞的数量已经穿过过滤膜显示肿瘤细胞的迁移和入侵能力。

2.5。总RNA的隔离

孤立的细胞总RNA进行根据试剂盒试剂的指令。贴壁细胞的培养基是丢弃,PBS被添加和细胞被洗两次,1毫升试剂盒是补充道,这些细胞被剥离,小心和重复吸量。混合物在室温下被允许站5分钟,这样细胞彻底溶解。接下来,0.2毫升氯仿添加每毫升的试剂盒,和混合大力动摇了15秒,让站在室温下3分钟前在4°C和12000×离心法15分钟。上层清液是获得并加载到一个新的离心管,同等体积的异丙醇,氯仿和混合添加了彻底;这是允许在室温下站了10分钟,在4°C和12000×离心机10分钟,后上层清液被丢弃。然后,1毫升75%乙醇添加,沉淀轻轻洗。混合物在4°C和7500×离心机5分钟,浮在表面的被丢弃。沉淀脱水再次清洁的长椅上,溶解在20 - 30μl nuclease-free水。测定RNA浓度和纯度,少量的RNA得到稀释,和样品的RNA浓度计算基于OD260(值为1,OD260表明RNA浓度为40μg / mL)。OD260 / OD280比率在1.8和2.1之间的样本表明足够的质量。的样本存储在冰箱−80°C。

2.6。反转录

20的反应混合物μl包含4μl 5 x逆转录缓冲区,1μl逆转录酶,1μl低聚糖dT底漆(50μM), 1μl随机引物(100μM), 1μl总RNA (1μ克/μl)和12μl RNase-free水被添加到一个RNase-free EP管的总RNA逆转录和互补脱氧核糖核酸的合成。这个解决方案是混合彻底和离心10年代。反转录的条件如下:16°C为30分钟,30分钟42°C,逆转录酶失活在85°C 5分钟。反应是储存在−20°C在冰上冷却后使用。

2.7。荧光定量聚合酶链反应(rt - PCR)

mir - 217引物是购自上海GenePharma有限公司有限公司:上游引物,5′XXXXXXXXXXX 3′和下游引物5′XXXXXXXXXXX 3′。20μl反应混合物包含10μl 2 x SYBR预混料交货Taq II, 0.4μl上游引物(10μ0.4米),μ下游引物(10 lμ0.4米),μl火箭II, 1μl cDNA、和7.8μl ddH₂o . PCR反应条件如下:在95°C变性5分钟;40周期在95°C 30年代,56为45°C年代,40年代和72年,其次是72°C 10分钟。

反应完成后,放大和溶解曲线被确认,结果被ΔΔCT分析方法。对于每一个PCR反应,盘子与去离子水作为消极的控制,和实验进行了为每个样本一式三份。

2.8。统计分析

从实验中得到的所有数据进行至少三次,结果是用平均值±标准偏差表示。统计分析的实验数据使用SPSS 17.0统计软件进行。两组的平均值进行比较t测试:方差分析(参数)和图基的测试被用于多个组的比较。表示一个重要的区别。

3所示。结果

3.1。EGF诱导EMT和提高Caco-2癌细胞的迁移和入侵的能力

Caco-2大肠癌细胞100 ng / mL EGF处理24小时,并使用一个倒置显微镜观察细胞形态学的变化(图1(一))。EGF治疗后,细胞从紧密相连的椭圆形松散连接和长梭形。西方墨点法用于检测上皮和间质蛋白(数字1 (b)和1 (c))。与对照组相比,钙粘蛋白的表达明显减少EGF治疗24小时后,当波形蛋白的表达明显升高。

接下来,细胞迁移和入侵能力评估在Caco-2细胞治疗100 ng / mL EGF transwell试验24小时。结果表明,控制细胞相比,Caco-2癌症细胞EGF处理表现出更多的细胞迁移和入侵每视野比控制(60±30±2和5, ,数据1 (d)- - - - - -1 (g))。这表明,大肠癌细胞的迁移和入侵的能力显著增强,EGF治疗。

3.2。FAK参与EGF-Induced EMT在结直肠癌细胞,增强细胞迁移和入侵的能力

的Caco-2细胞EGF治疗后24小时内,FAK磷酸化是增加,被西方墨点法。此外,细胞使用FAK抑制剂pf - 228 (10μ米)1小时,然后用EGF治疗24小时观察上皮和间质蛋白表达的变化。此外,细胞转染与FAK siRNA然后EGF处理24小时观察蛋白表达。因此,钙粘蛋白和波形蛋白的upregulation差别EGF-induced对这些显著抑制预处理与FAK蛋白抑制剂pf - 228和FAK siRNA,独自与EGF治疗组相比(图2)。上述结果表明,表皮生长因子诱导的FAK磷酸化(397处)在结直肠癌细胞,和FAK的表达下调表达或活动显著抑制EGF-induced EMT在结直肠癌细胞。

与FAK抑制剂预处理后pf - 228 (10μ米)1小时,EGF-induced结直肠癌细胞的迁移和入侵能力是由transwell化验。此外,细胞也被转染与FAK siRNA检查EGF-induced结直肠癌细胞的迁移和入侵的能力。结果表明,用100 ng / mL EGF治疗24小时增加Caco-2细胞的迁移和入侵的能力,就是指入侵细胞的数量增加( )。相比之下,EGF, pf - 228或小干扰rna结合EGF显著降低FAK细胞迁移和入侵的平均数量 )。FAK的表达下调表达或活动抑制EGF migrative和侵入性的促进作用效果( ,图2)。上述结果表明,FAK激活参与EGF-induced大肠癌细胞的迁移和入侵。

3.3。mir - 217参与EGF-Activating FAK针对钙粘蛋白诱导EMT的Caco-2癌细胞

3.3.1。EGF诱导Upregulation Caco-2 mir - 217的细胞

Caco-2癌细胞与100 ng / mL EGF治疗24小时,和mir - 217的表达水平的变化进行评估使用实时PCR(图3(一个))。结果表明,mir - 217的表达EGF治疗后增加。

3.3.2。FAK抑制剂下调mir - 217的表达

Caco-2癌细胞治疗与FAK抑制剂pf - 228 (10μM) 24小时,mir - 217的表达检测使用实时PCR(图3 (b))。结果表明,治疗后与pf - 228,在Caco-2 mir - 217细胞的表达低于对照组(0.7倍 )。

3.3.3。外源性超表达的mir - 217的差别会导致对这些由绑定3′UTR上皮钙粘蛋白

Caco-2细胞转染和mir - 217模拟和控制。96小时后,钙粘蛋白水平的变化是由免疫印迹检测(数字4(一)和4 (b))。结果表明,钙粘蛋白的表达在mir - 217模拟组表达下调的价格相比对照组。mir - 217的潜在目标是探索使用miRWalk 2.0 (http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microT_CDS/index),发现钙粘蛋白是一个假定的mir - 217(图的目标4 (c))。然后,进行双荧光素酶报告实验检查mir - 217直接绑定的3′UTR区域钙粘蛋白mRNA。根据预测暴食站点,我们结构化的荧光素酶报告质粒。pmirGLO荧光素酶报告质粒,包含野生型或变异上皮3′UTR和mir - 217 cotransfected agomir或消极的控制。它显示荧光素酶活性的细胞转染野生型质粒和agomir表达下调,而没有效果时,细胞转染突变类型(图4 (d))。

4所示。讨论

已经证实,EMT参与肿瘤的浸润和转移,在这些过程起着重要的作用。EMT过程中,上皮癌细胞失去apical-basal极性,和和cell-ECM粘连,伴随着细胞骨架重组,从而促进肿瘤细胞浸润和转移(7]。此外,EMT还赋予肿瘤细胞与癌症干细胞的特性和抗衰老和细胞凋亡8]。几十年来,研究阐明微环境的重要作用在肿瘤细胞表型转换展出。特别是在CRC, Wnt /β连环蛋白信号同时参与调节EMT和肿瘤血管生成在肿瘤发生和发展是至关重要的。此外,EMT扮演了一个角色在维护铂电阻(9]。EMT是一个复杂的过程涉及多个阶段和因素。研究表明EGF可以减少钙粘蛋白的表达和增强EMT的发生在子宫癌细胞3]。同样,表皮生长因子受体也结直肠癌中高度表达,与结直肠癌的浸润和转移。EGF进一步激活绑定EGFR磷酸化酶激酶,导致异常蛋白质表达和EMT的发生。然而,尚不清楚哪些信号通路激活促进结肠直肠癌的转移。

FAK nonreceptor酪氨酸激酶。作为信号转导的中央枢纽,参与多种信号通路,激活转录因子,调节相关基因的表达,诱导EMT在肿瘤细胞。研究表明,FAK提高头颈部肿瘤诱导的入侵能力EMT在头部和颈部鳞状细胞10]。FAK也在浸润转移性肿瘤如结肠癌和肝癌。FAK的作用在于绑定与上游的n端分子,导致快速Tyr397 FAK磷酸化和激活。磷酸化可以触发信号转导机制,激活下游信号分子,并导致相应的生理反应。表皮生长因子受体属于酪氨酸激酶受体,可以通过绑定激活FAK n端。表皮生长因子受体激活促进上皮间充质迁移的人类视网膜色素上皮细胞通过调节FAK-mediated麦克米兰/ Src途径[11]。激活表皮生长因子受体/ FAK途径促进迁移A549肺癌细胞(12]。EGF-induced激活的FAK Y925调节焦点粘连分解细胞传播(13]。本研究表明EGF /表皮生长因子受体可以使磷酸化FAK和诱导EMT在结直肠癌细胞。

microrna的知识继续增长,超过1000个microrna在人类基因库已确定。在20多个类型的人类恶性肿瘤,发现特定微分microrna的表达(14]。很少有报道microrna与结直肠癌关系(15),但在这个领域的研究正在进行。miR-30由致癌信号表达下调,如表皮生长因子(EGF)。表皮生长因子(EGF)已被证明是最有效的抗病诱导剂的EMT在宫颈癌和宫颈基质入侵和淋巴结的转移。慢性EGF治疗诱发EMT通过upregulation EMT-inducing转录因子蜗牛在宫颈癌细胞,和EGF-mediated EMT是与表皮生长因子受体(EGFR)过度和宫颈癌的临床进展。官员等人的研究表明,mir - 137表达很低在结肠癌及其启动子是hypermethylated (16]。Ng et al。17)观察到的高表达miR-21和低表达在结肠癌mir - 143。这两个microrna是负相关,两者都是结肠癌肝转移密切相关。吴等人的研究。18)表明,mir - 107可以负调控大肠癌的生长,通过调节HIF-1血管生成等过程α表达式。microrna表达下调钙粘蛋白的表达可以通过具体绑定IGFlR, FAK和其他蛋白质。这增强了EMT在细胞,从而影响细胞粘附和能动性。肿瘤细胞转移的过程也涉及到这种行为。然而,很少有报道mir - 217到目前为止,只有少数研究人员已经开展了相关的研究。例如,mir - 217表达在乳腺癌,白血病(19),肺癌20.),胃癌21,22),结肠直肠癌(23- - - - - -25),和胰腺癌24- - - - - -29日]。展品低表达在胃癌和结直肠癌显著下调(6]。此外,mir - 217可以作为治疗乳腺癌的目标(5),还可以抑制增长,移民和入侵三阴性乳腺癌细胞(30.]。在这项研究中,mir - 217在结直肠癌细胞的作用是进一步探讨,我们发现EGF上调mir - 217通过激活FAK,导致EMT在结直肠癌细胞,从而提高大肠癌的浸润和转移。

这项研究的结果表明,EGF诱导EMT Caco-2癌细胞和增强细胞迁移能力。的具体机制是绑定EGF表皮生长因子受体,激活下游信号通路,钙粘蛋白和upregulation差别导致对这些波形蛋白,从而诱导EMT在结直肠癌细胞。钙粘蛋白和波形蛋白是癌症发展的EMT过程中非常重要的因素。此外,他们有重要关系EGF / FAK / mir - 207通路。所以,他们被用作EMT因素代表EMT的状态。类似于另一项研究[31日),本研究进一步表明EGF可以诱导EMT在结直肠癌细胞。公园GB和金姆D报道,VEGF和TGF -β1可以增加EMT标记物的表达,VEGF和TGF - FAK击倒的阻塞β1-mediated EMT过程CSE-stimulated RPE细胞(11]。在我们的研究中发现了同样的现象。同时,观察到的细胞迁移能力的增加表明EGF提高结直肠癌细胞的转移。FAK抑制剂的差别也可以抑制对这些钙粘蛋白和波形蛋白upregulation EGF-induced过程中EMT在结直肠癌细胞。这也导致迁移细胞的数量明显下降,表明FAK参与的过程EGF-induced EMT和结直肠癌浸润和转移有关。FAK的抑制减少结直肠癌细胞的迁移能力,它为后来的靶向治疗提供了一种方法。此外,这项研究的结果表明,EGF诱导FAK磷酸化在Caco-2癌细胞,FAK抑制剂可以抑制EGF-induced FAK磷酸化在结肠直肠癌。

最后,本研究表明,mir - 217参与EGF-induced EMT。我们观察到激活的FAK EGF和upregulation Caco-2 mir - 217表达的癌细胞的差别导致了对这些EMT在结直肠癌细胞的粘附和归纳。mir - 217会使钙粘蛋白的表达和3′UTR钙粘蛋白的。mir - 217表达的差别,对这些FAK抑制剂表明mir - 217参与的过程EGF-induced EMT在结直肠癌细胞。这项研究是第一个报道的存在结合位点AUGCAGU mir - 217的3′UTR区域钙在mir - 217精确匹配UACGUCA序列,提供了一个理论依据mir - 217作为一个潜在的肿瘤抑制作用的目标。

本研究选择Caco-2细胞系。Caco-2细胞是人类科隆结肠细胞腺癌,相似的结构和功能分化的小肠上皮细胞,微绒毛和其他结构和含酶系统与小肠刷状缘上皮有关。它可以用于实验,模拟体内肠道运输。在细胞培养条件下,细胞生长在多孔透水聚碳酸酯膜可以融合并分化成肠道上皮细胞,形成一个连续的单层,counterdifferentiated从正常小肠上皮细胞在体外培养成熟。情况是不同的。细胞sub-microstructure研究表明Caco-2细胞形态类似于人类小肠上皮细胞,用相同的细胞极性和紧密连接。尽管Caco-2细胞类似于人类小肠上皮细胞自Caco-2细胞是来源于人类结肠,及其交通特性,酶表达,和跨膜电阻相对比小肠反射结肠细胞的细胞。与此同时,我们将添加细胞系具有不同特点在未来的研究。

总之,EMT在结直肠癌细胞是一个协同过程涉及多个因素。EGF可以诱导这些细胞中EMT,激酶FAK也参与其中。这个过程涉及到绑定的具体机制EGF表皮生长因子受体,导致FAK磷酸化,upregulation mir - 217的表达,以上的差别,对这些钙粘蛋白;这导致EMT和提高结直肠癌细胞的迁移能力。结果表明,upregulation钙粘蛋白的表达波形蛋白表达的差别,对这些基因通过EGF被FAK激酶抑制剂抑制,pf - 228。然而,目前尚不清楚这些pf - 228规范分子表达式通过转录或posttranslation修改机制。所以,明确的机制对这些pf - 228规范因素可能在我们未来的探索工作。此外,它可能需要进一步探索pf - 228产生的抑制是否迁移和入侵通过其他信号通路。这个澄清机制结肠直肠癌的转移提供了一个理论依据确定合适的目标治疗结直肠癌。然而,明确的分子机制对EGF / FAK EMT将探索在未来。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前的研究可从相应的作者。

伦理批准

这项研究是伦理委员会批准中国医科大学第一附属医院(沈阳、中国)。

同意

书面知情同意被病人或监护人签署。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Xuemei王的构思和设计实验;政法与Donglin扁进行实验;七夕节翟和杨Puxu分析数据;李Mingwei贡献试剂、材料和分析工具;黄库恩写道。