CD40呈正相关的表达式Nucleophosmin在有顺铂耐药性膀胱癌

文摘

客观的。验证和评估的价值作为非侵入性的生物标志物有顺铂耐药性CD40膀胱癌,我们研究的表达CD40和相关性nucleophosmin (NPM1)和CD40在有顺铂耐药性膀胱癌。方法。三个有顺铂耐药性膀胱癌细胞株(T24/0.8DDP、BIU87/0.3DDP PUMC-91/0.6DDP)进行了研究,和慢病毒用于沉默NPM1表达式。的表达CD40和NPM1三NPM1沉默膀胱癌细胞系被荧光显微镜和免疫印迹检测。NPM1基因敲除的效果和蛋白质组生物信息学有顺铂耐药性膀胱癌细胞分析液相色谱-光谱法(质)和基因本体分析(分析)。结果。的NPM1在三耐药基因被成功沉默膀胱癌细胞系通过慢病毒感染。可拆卸的效率为70%。NPM1基因敲除后,492个差异蛋白质检测到质褶皱的变化是超过1.5 。总共57022肽,54347独特的缩氨酸,和6686蛋白质组中确定测试的所有蛋白质细胞(罗斯福< 0.01)。层次聚类和主成分分析表明,264功能蛋白表达下调和228年相比,功能性蛋白质调节基因沉默组与消极的控制。通过去分析,受NPM1覆盖大量的蛋白质与生物功能的蛋白质,这可能发挥重要作用的发展492年肿瘤差异蛋白质。CD40是最重要的表达下调蛋白质NPM1沉默后,不同的2.6倍丰度的变化。结论。之间存在着正相关CD40蛋白质和NPM1蛋白在膀胱癌耐药。因为NPM1可以反映膀胱癌的特点,CD40可能是一个更敏感的标志监测膀胱癌症的预后。

1。介绍

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,是最常见的男性泌尿系统肿瘤(1]。目前,主要的临床治疗膀胱癌的手术结合术后化疗。然而,膀胱癌是容易耐药复发,这使得膀胱癌的治疗更加困难。早期发现和及时干预可以显著提高膀胱癌患者的存活率。及时监测膀胱癌耐药的进展有助于早期有针对性治疗膀胱癌复发的2]。

目前,膀胱癌的诊断和监测方法主要是尿液细胞学和膀胱镜检查。膀胱镜检查是膀胱癌的入侵检测方法,很容易导致焦虑和不适的患者(3]。此外,膀胱镜检查的敏感性膀胱癌原位(TIS)很低。尿液细胞学是一种非侵入性的诊断方法,该方法不太敏感的小乳突瘤,卫星病灶,独联体在最初的诊断和复发的监测。膀胱镜检查的敏感性较低,低至28%,中值为44% (4]。此外,细胞学结果还受很多因素的影响,如低脱落细胞的生产,尿路感染,和微积分,这将影响临床解释(5]。

尿液生物标志物检测可以极大地提高膀胱癌的敏感性和特异性检测,这是一个有价值的选择。理想的生物标志物的膀胱癌的定义是一个客观的和非侵入性标记具有高敏感性和特异性5尿液),但是在现有的肿瘤标志物,假阳性结果是非常普遍的。在血尿、炎症或感染,通常是无法准确判断膀胱肿瘤(3,6- - - - - -9]。

Nucleophosmin 1 (NPM1)是一种蛋白质,主要位于细胞核和核仁和细胞质之间的航天飞机。在我们实验室之前的研究已经表明,NPM1可以反映特定的生物行为在膀胱癌复发和耐药等。NPM1在膀胱癌细胞的表达增加当浸润性膀胱癌的复发和耐药细胞增加,表明NPM1膀胱癌细胞的可能是一个重要预后指标(10]。然而,随着蛋白质只存在于细胞,NPM1灵敏度有限作为膀胱癌的早期监测。因此,迫切需要找到一个实时和有效的方法监控进展和膀胱癌治疗后的复发。

CD40,一个跨膜糖蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族。研究表明CD40分子被发现表面的抗原呈递细胞(APC) (11),正常膀胱癌症(12),胃癌13],结肠癌[14),和其他实体肿瘤和血液肿瘤细胞。CD40分子差异表达的过程中肿瘤发生、肿瘤发展。CD40一直被视为一个重要的生物标志物预测发展在许多癌症,如卵巢癌(5),肝细胞癌(6),和其他肿瘤。Ghamade等人证明了重组CD40配体治疗有显著的抗肿瘤效应CD40-positive小鼠的卵巢肿瘤,和CD40作对可能增强顺铂的作用[8),这意味着CD40具有很高的诊断和治疗价值7]。

CD40在肿瘤各种肿瘤的活动,为未来的临床应用提供一个有吸引力的选择。作为细胞表面分泌分子CD40有高灵敏度反映细胞的生理变化,可以预测肿瘤细胞的生物学行为的早期阶段。然而,到目前为止,CD40的微分表达式和预测价值还没有被验证在膀胱癌耐药。

因为NPM1膀胱癌耐药密切相关,本研究拟探讨CD40的微分表达式在膀胱癌耐药质谱和分析NPM1之间的相关性和CD40在膀胱癌耐药,从而确定CD40是一种非侵入性生物标志物,可以预测膀胱癌的进步。

2。材料和方法

2.1。主题和组

2.1.1。耐药细胞组

有顺铂耐药性膀胱癌细胞株(T24/0.8DDP、BIU87/0.3DDP PUMC-91/0.6DDP)被从北京购买Shijitan医院隶属于首都医科大学。

2.1.2。NPM1微分表达细胞组

NPM1沉默膀胱癌细胞株(T24/0.8DDP Lv-NPM1, BIU87/0.3DDP Lv-NPM1,和PUMC-91/0.6DDP Lv-NPM1): NPM1-silenced稳定感染细胞系是由包含NPM1 shRNA慢病毒感染。

NPM1沉默负对照组(T24/0.8DDP Lv-NC, BIU87/0.3DDP Lv-NC,和PUMC-91/0.6DDP Lv-NC):细胞系是包含NPM1-negative成分由慢病毒感染。

2.2。材料

美国Gibco公司0.25%的胰蛋白酶(17518012),RPMI 1640(美国Hyclone公司AE244464298),胎牛血清(美国Gibco公司1861242)、顺铂(美国σ公司P4394)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ISEQ00010,σ公司、美国),鼠标anti-nucleophosmin抗体(美国Abcam公司ab10530),兔子anti-CD40抗体(美国Abcam公司ab224639),山羊anti-Mouse免疫球蛋白g h和l(合)(美国Abcam公司ab205719)和NPM1-silencing NPM1 overexpressing负控制慢病毒(GenePharma,中国)。

2.3。方法

2.3.1。慢病毒感染和建立稳定的细胞系

T24/0.8DDP、PUMC-91/0.6DDP BIU-87/0.3DDP细胞感染了慢病毒包含NPM1成分(NPM1干预组)和消极控制成分(NPM1负对照组),分别。相关的蛋白质功能验证和实验进行了72小时后感染病例。稳定感染细胞被单细胞克隆筛选。克隆分离和筛选稳定的文化。分离克隆被放大和培养建立稳定的细胞系。

2.3.2。细胞培养

(1)耐药膀胱癌细胞组。T24/0.8DDP、BIU-87/0.3DDP PUMC-91/0.6DDP培养在RPM I1640中含有20%的边后卫和0.8μ0.3 g / ml DDP,μ0.6 g / ml DDP,或μg / ml DDP和保持在37°C的5%的股份有限公司₂饱和湿度孵化器。当细胞生长融合成一个单一的层,细胞与0.25%胰蛋白酶消化和亚文化。

(2)NPM1沉默膀胱癌细胞组。T24/0.8DDP Lv-NPM1, BIU-87/0.3DDP Lv-NPM1, PUMC-91/0.6DDP Lv-NPM1培养在RPM I1640中含有20%的边后卫和保持在37°C公司5%₂饱和湿度孵化器。当细胞生长融合成一个单一的层,细胞与0.25%胰蛋白酶消化和亚文化。

(3)相应的负控制细胞组。人类膀胱癌细胞系T24/0.8DDP Lv-NC, BIU-87/0.3DDP Lv-NC,和PUMC-91/0.6DDP Lv-NC培养的RPMI 1640中含有15%的边后卫和保持在37°C公司5%₂饱和湿度孵化器。当细胞生长融合成一个单一的层,细胞与0.25%胰蛋白酶消化和亚文化。

2.3.3。免疫印迹

里帕总蛋白提取的蛋白质溶解产物。蛋白质是由sds - page electrophoretized 120°V。然后,蛋白质转移到硝化纤维过滤膜。在一夜之间,硝基过滤膜被孵化1:1000年anti-NPM1抗体,anti-CD40抗体和抗β肌动蛋白抗体。膜在4°C的环境。PBST缓冲区用于冲洗膜三次,每次20分钟,1:1000增加了第二个抗体和孵化在室温下为90分钟。硝化纤维过滤膜被PBST冲洗和民建联工具开发的。所有的实验都重复三次。

2.3.4。质谱分析

细胞样本转移到1.5毫升microcentrifugal管。然后,溶解缓冲区(7 M尿素,2 M硫脲,0.1%的家伙们)被添加到每个样本,和总蛋白提取超声磨削。上层清液离心机30分钟在14000 g进行进一步的实验。蛋白质含量是由布拉德福德的方法。适量的蛋白质(100µl)电泳。凝胶染色和染色进行直到结果很明显。实验重复三次。

肽是由热科学EASY-nLC 1000系统。肽混合物被分组根据实验要求与TMT试剂标签。肽的混合物是溶解在溶液中(DDH 98%和2%乙腈,pH = 10)。然后,梯度溶液B (DDH 2%和98%乙腈,pH = 10)中分离Durashell-C18列(4.6×250,5µ米,100)的流量0.7毫升/ m。分离梯度表所示1。孤立的肽被Q-Exactive质谱仪检测(热科学)。喷雾离子源的电压设置为2.1 kV。完全扫描分辨率70000女士与女士获得了超过350 - 1800年的一项决议米/z。HCD是17500年《男人帮》的光谱分辨率。标准化的碰撞能量设置为29%。

2.3.5。蛋白质组生物信息学分析

蛋白质组发现者软件被用来处理原始质谱数据。女士资料搜索根据人类基因组数据库和Uniprot网站。MaxQuant搜索的参数设置如表所示2。

生物过程、分子功能和细胞蛋白质成分分析基因本体分析(分析)。此外,基因和基因组的京都百科全书(KEGG)是用于研究蛋白质物种为了地图KEGG通路系统的功能性生物学解释(http://www.genome.jp/kegg/)。蛋白质相互作用从一个搜索工具,检索获得基因/蛋白相互作用(String)数据库(http://string-db.org/),其中包含已知的和预测的物理和功能蛋白质的相互作用。

2.4。统计分析

独立的实验数据都表示为平均值±标准偏差(SD)。统计分析是由使用Graphpad prism 6.0统计软件有限公司(美国Lajolla)。p值的计算是通过方差分析和Bonferroni测试(两组以上)或t以及(两组)。当 ,被认为是统计的结果。

3所示。结果

3.1。建立NPM1沉默稳定的细胞系

我们成功建立了稳定的NPM1沉默膀胱癌耐药细胞系:绿色荧光蛋白的荧光效率在六种细胞(T24/0.8DDP Lv-NPM1, BIU-87/0.3DDP Lv-NPM1, PUMC-91/0.6DDP Lv-NPM1,和相应的消极控制)由荧光显微镜观察,达到80%以上。采用免疫印迹检测NPM1表达式。免疫印迹分析,NPM1蛋白质水平T24/0.8DDP Lv-NPM1细胞系是高达0.05倍,在T24/0.8DDP Lv-NC 。NPM1蛋白质水平BIU-87/0.3DDP Lv-NPM1细胞系高达0.35倍,在相应的负控制BIU-87/0.3DDP Lv-NC 。NPM1蛋白质水平PUMC-91/0.6DDP Lv-NPM1细胞系高达0.20倍,在相应的负控制PUMC-91/0.6DDP Lv-NC 。实验结果如图所示1。

3.2。可拆卸的NPM1基因导致膀胱癌耐药细胞的重要蛋白质组的变化

NPM1基因敲除的影响有顺铂耐药性膀胱癌细胞被质谱分析。共有492个差异蛋白质被主成分分析确定。确定蛋白质遇到下列条件:褶皱变化> 1.5 ,如图2(一个)。

细胞蛋白质组的变化是由串联质量定量记录标记(TMT)技术。总共57022肽,54347独特的缩氨酸,和6686蛋白质组中确定测试的所有蛋白质细胞(罗斯福< 0.01)。层次聚类和主成分分析表明,蛋白质有显著差异基因沉默组和阴性对照组,如图2 (b)。264功能蛋白表达下调,228功能蛋白质调节基因沉默组与消极的控制。我们进一步分析了492个差异蛋白质的生物功能的分析,如图2 (c)。这些结果证实,受NPM1覆盖大量的蛋白质与生物功能的蛋白质。我们具体分析了微分蛋白质的信号转导蛋白在膀胱癌耐药,如表所示3。

3.3。CD40 NPM1沉默后最重要的是表达下调的蛋白质在有顺铂耐药性膀胱癌细胞

NPM1沉默后,蛋白质的微分表达式从高到低排名有顺铂耐药性膀胱癌细胞CD40表达的差别,发现对这些最明显(褶皱变化:−2.66),如表所示4。

免疫印迹显示的表达CD40在三NPM1沉默膀胱癌细胞系表达下调。免疫印迹分析,CD40蛋白质水平T24/0.8DDP Lv-NPM1细胞系是高达0.61倍,在T24/0.8DDP Lv-NC 。CD40蛋白质水平BIU-87/0.3DDP Lv-NPM1细胞系高达0.65倍,在相应的负控制BIU-87/0.3DDP Lv-NC 。CD40蛋白质水平PUMC-91/0.6DDP Lv-NPM1细胞系高达0.56倍,在相应的负控制PUMC-91/0.6DDP Lv-NC 。这与质谱分析的结果一致,如图3。

这与质谱分析的结果是一致的。这个结果证实了免疫印迹在三NPM1沉默膀胱癌细胞株(T24/0.8DDP Lv-NPM1, BIU87/0.3DDP Lv-NPM1,和PUMC-91/0.6DDP Lv-NPM1)。

4所示。讨论

因为膀胱癌是容易耐药复发,这很难一个合理的、有针对性的治疗策略。及时检查或监视可以帮助医生尽快预防和治疗这种疾病。

为了提高早期诊断的敏感性,减轻病人的痛苦,研究人员正试图找到一些侵入性生物标志物的膀胱癌临床实践。患膀胱癌的非侵入性生物标志物发现监控正常膀胱癌症的预后(15),如细胞角蛋白18蛋白质片段(16]。但没有发现敏感和特定的生物标志物可以耐药膀胱癌的早期监测进展。

Nucleophosmin (NPM1)是一种蛋白质生物标志物能反映化疗的治疗效果(17],它的功能不仅监控血液疾病进展(18,19),但也有微分表达式在某些实体肿瘤如结肠癌(20.和肺腺癌21]。在蛋白质组学分析膀胱癌耐药,该表达式NPM1已经证明是明显不同的22]。它也被报道,NPM1可以用作宝贵的疾病预后标记(23,24]。

在我们先前的实验(10),证实NPM1的微分表达式可以反映有顺铂耐药性膀胱癌的肿瘤特征。Downregulation NPM1可以加快入侵和膀胱癌有顺铂耐药性的增长。此外,NPM1也可以反映膀胱癌有顺铂耐药性的发展。然而,随着蛋白质位于核仁,NPM1很难监控最早被发现为细胞外蛋白质,这限制了其价值的生物标记肿瘤尿液中。

CD40,肿瘤坏死因子受体超家族的一员参与细胞分化[25),已被证明是一种有效的肿瘤标志物在许多肿瘤(26- - - - - -28),特别是non-B-cell-derived实体肿瘤,如鼻咽癌(29日),正常膀胱癌症(12],宫颈癌[30.),和肾癌(11]。此外,CD40已逐渐成为一个有效的目标免疫疗法(31日]。

CD40可以检测到液(32]。一些研究已经证实,CD40早期很容易被监控和与泌尿系统疾病,如肾细胞癌(9]。然而,CD40在膀胱癌耐药的价值尚未评估。如果我们能确定关系CD40和功能蛋白在膀胱癌耐药,我们可以极大地扩大CD40的应用。

评估的价值CD40作为生物标志物在有顺铂耐药性膀胱癌,我们建立了NPM1沉默稳定细胞系通过慢病毒感染三个有顺铂耐药性膀胱癌细胞系。根据这项研究的经验,三种耐药膀胱癌可以更好地说明实验结果(33- - - - - -35]。结果表明,击倒的效率NPM1基因是70%左右,这表明沉默NPM1基因的慢病毒是有效的。最具代表性的T24细胞行这三种细胞系进一步定量分析质谱分析。NPM1基因沉默后,492年微分蛋白质质谱探测到的变化超过1.5倍 。总共57022肽,54347独特的缩氨酸,和6686蛋白质组中确定测试的所有蛋白质细胞(罗斯福< 0.01)。层次聚类和主成分分析表明,264功能蛋白表达下调和228年相比,功能性蛋白质调节基因沉默组与消极的控制。通过去分析,受NPM1覆盖大量的蛋白质与生物功能的蛋白质,这可能发挥重要作用的发展492年肿瘤差异蛋白质。肿瘤的发病机制通常需要解释的信号转导通路中的蛋白质的变化。在MS分析,微分表达式的NPM1导致大量功能蛋白质的变化,他们中的大多数在信号转导蛋白。nf -κB细胞信号通路可能参与细胞响应外部刺激,如顺铂在膀胱癌耐药的影响。有趣的是,NPM1也被证明作为NF-kappaB共激活剂诱导人类基因抗细胞不利因素(36]。已经证明,CD40可以调节nf -κB的表达通过不在经典里的信号通路途径(37,38]。

我们进一步发现CD40是最明显的表达下调蛋白质NPM1沉默后,不同的丰度变化量的2.6倍,其表达呈正相关,NPM1表达式。

结果表明,CD40和NPM1一致的变化特征。根据我们的实验结果和其他研究NPM1 CD40,我们总结了相关通路CD40和NPM1,如图4。CD40相关可以生存,发展,和预后的肿瘤和nf -κB通路的变化反映了NPM1有关。在未来,我们需要进一步的实验,如影响超表达CD40和抑制CD40表达NPM1,支持声称NPM1和CD40变化一致。

5。结论

CD40表达差别的观点对这些NPM1沉默后,在有顺铂耐药性膀胱癌细胞CD40相关可以生存,发展,和预后的肿瘤和nf -κB通路的变化反映了NPM1有关,这表明CD40可以作为生物标志物监测有顺铂耐药性膀胱癌的进展。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

信息披露

Chenshuo罗co-first是这项研究的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者参与设计、解释的研究,分析数据,手稿和审查;Chenshuo罗的主要贡献在于写作手稿。Ting Lei分析和解释实验结果。孟人赵、钱,人张提出想法和辅助实验的进展。

确认

这项工作得到了北京自然科学基金、北京市医院管理局的提升计划(批准号:DFL20150701),增强资金北京尿细胞分子诊断重点实验室(格兰特号码:2019 - js02)。

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