HEATR1虚寒通过上调ZNF185和下调SMAD4胰腺癌促进化疗耐药

抽象

目的。要发现与HEATR1的相关基因在调节吉西他滨化疗耐药。方法。基因芯片分析HEATR1-KD与对照组差异基因。对前20个基因进行高含量筛选，并进行功能分析。进行基因表达谱分析，寻找下游靶点。免疫组化和生存分析。结果。ZNF185 fold change(4.5285)在HEATR1-KD组和对照组中最显著。抑制ZNF185可促进化疗敏感性、凋亡和增殖抑制，SMAD4显著上调。高HEATR1和SMAD4或低ZNF185的患者生存率更高。结论。HEATR1、ZNF185、SMAD4可影响吉西他滨的化疗敏感性，可能是胰腺癌化疗中吉西他滨选择的指标。

1.简介

胰腺癌是世界上最严重的胃肠道恶性肿瘤，预后最差。预计到2030年，它将成为美国癌症相关死亡的第二大原因[1]。吉西他滨是过去20年来胰腺癌化疗的基础药物[2]。最近，新的化疗方案包括FOLFIRINOX(氟尿嘧啶、亚叶酸蛋白、伊立替康、奥沙利铂)[3.]或吉西他滨与白蛋白结合的紫杉醇结合[4]似乎改善生存，但只限于患者因FOLFIRINOX或紫杉醇的不可耐受的不良副作用不错的表现。因此，吉西他滨仍然是胰腺癌的一线化疗药物和理解性的机制将提供显著的临床策略。不幸的是，吉西他滨抗性的机理尚未完全阐明，虽然以前的研究集中于分子和细胞的改变，包括吉西他滨的代谢酶，抑制细胞凋亡途径中，癌症干细胞（CSC）的激活，或上皮 - 间间充质转换（EMT）[5]。

加热含有重复蛋白1（HEATR1）包含HEAT重复，在一些蛋白，包括亨廷顿，延伸因子3最初发现，和PR65 /磷酸酶2A的A亚基[6]。该human HEATR1 gene is located on chromosome 1q43 and encodes a high molecular weight (236 KDa) protein with 2144 amino acids. Our team discovered the effect of HEATR1 on the chemosensitivity of gemcitabine and published the original research on癌症研究2016年，解释了HEATR1通过促进AKT和PP2A的相互作用，促进Thr308去磷酸化，增强了对吉西他滨的化学敏感性的可能机制[7]。在这项研究中，我们的团队目的是发现与HEATR1相关的新功能基因的致敏胰腺癌细胞对吉西他滨，这可能有助于寻找新的治疗靶点和改善吉西他滨的疗效胰腺癌。

2.材料和方法

2.1。伦理声明

该研究方案由复旦大学中山医院独立伦理委员会批准。所有参与患者均签署书面知情同意书，所有实验均按照2013年修订的赫尔辛基宣言进行[8]。

2.2。细胞系

人胰腺癌细胞株pan-1、SW 1990、mirna - paca2、Patu-8988、Capan-1均购自ATCC，所有细胞株均由GeneChem公司(中国上海)STR图谱鉴定。将panci -1和mirna - paca2培养在含有杜贝可改良Eagle培养基(DMEM)(美国纽约大岛Gibco)的培养基中，添加10%胎牛血清(Gibco)、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素(Gibco)，在37℃和5% CO的湿化环境中₂培养箱，而帕图-8988，CAPAN-1，和SW 1990细胞系用在RPMI-1640培养基（Gibco）代替DMEM培养。

2.3。定量实时PCR

使用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从人胰腺癌细胞株中分离总RNA。标准cDNA合成反应使用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega, USA)按照说明执行[9]。对于qRT-PCR分析，逆转录产物使用SYBR预混实施例的Taq（TaKaRa公司，日本）进行扩增。PCR反应进行了使用ABI 7500实时PCR仪（Applied Biosystems，CA，USA），并重复三次。相对mRNA水平归一化至GAPDH，并通过使用该2分析转录物的相对表达^−△△Ct方法。下列引物：人类HEATR1（基因登录号NM_018072）：5- TTCACTTGTCGCCTTACTTCC-3（正向）和5- CCAGAACCATCTGTGCTTTGA-3（反向）;人类ZNF185（基因登录号NM_007150）：5- GATCCGAGACTGTCCAAAGAT-3（正向）和5- AATGGTGTCACGGTGAATGA-3（反向）;人类SMAD4（基因登录号NM_005359）：5- ACGAACGAGTTGTATCACCTGG-3（正向）和5- TGCACGATTACTTGGTGGATG-3（反向）;人GAPDH：5- TGACTTCAACAGCGACACCCA-3（正向）和5- CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3（反向）。

2.4。免疫印迹分析

用细胞裂解液缓冲液和蛋白酶抑制剂提取的总蛋白用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并电转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore, Billerica, MA, USA)。膜是孵化与主抗体:HEATR1(1: 10000年,ab241610 Abcam, CA,美国),国旗(美国F1804 1: 2000年,σ),SMAD4 (AF2097 1: 1000年,研发系统、锰、美国),和GAPDH (sc - 32233 1: 2000年,圣克鲁斯,德克萨斯州,美国)在一夜之间被屏蔽后TBS-T 5%的脱脂牛奶。使用Tanon 5200 (Tanon，上海，中国)图像系统检测蛋白表达。

2.5。稳定敲除HEATR1和ZNF185

GV115 puromycin慢病毒载体由GeneChem公司(中国上海)设计构建。人HEATR1 siRNA靶序列为GCTGAACAAGTCCGAATAGAA。以GV115嘌呤霉素慢病毒载体作为对照。western免疫印迹分析验证了稳定转染的HEATR1克隆。人ZNF185 siRNA的靶标序列为TCCAAAGATTACCCTAGAA，将靶标序列克隆到GV115慢病毒载体上。在pan -1细胞中通过qPCR验证ZNF185敲除的效率，在表达3×FLAG-ZNF185融合蛋白的293T细胞中进行western blot验证。验证敲除效率后，将稳定的shHEATR1细胞转染shZNF185慢病毒，安排功能实验。

2.6。细胞增殖分析

在细胞增殖实验中，每5000个细胞以100个为单位均匀分配µl aliquots接种于96孔板，在吉西他滨处理72小时后计数活细胞(10)µM).细胞在10% CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD, USA)中孵育，在正常培养基中稀释2小时。为了估计活细胞和IC50值，每孔测量450 nm波长的吸光度。最后1%多聚甲醛固定30分钟，0.1% (w/v)结晶紫染色30分钟[10]。使用Image-Pro的加5.0软件（Media Cyber​​netics，贝塞斯达，MD，USA）的细胞集落数进行计数。

2.7。细胞凋亡检测

使用Annexin V-APC试剂盒(BD Bioscience)检测吉西他滨治疗72小时后细胞凋亡(10)µM）。Briefly speaking, the cells were harvested with trypsin, washed twice with ice-cold PBS, and resuspended 1 × binding buffer. Then, 10 ul of annexin V-APC was added into 200 ul of cell suspensions. After incubation for 15 mins, the population study of the target cohort was performed by a FACS Aria II flow cytometer (BD Bioscience) [11]。

2.8。基因芯片分析

提取细胞总rna，进行基因芯片分析，找出差异表达基因(DEGs) (fold change >1.5 and)两组间(HEATR1-KD vs NC)值< 0.05。对DEGs进行进一步分析，筛选出30个基因。选择原则如下:(1)进行文献复习，确保所选的DEGs未见既往在胰腺癌中具有功能的报道;(2)跨膜蛋白编码基因因敲低效率被排除;(3)选择的DEGs fold change大于2.4。通过定量PCR检测这30个基因在HEATR1-KD pan- 1细胞中的表达水平。

2.9。高含量的筛选

高含量筛选(HCS)是按以往报告所述的方法进行的[12]。简言之，PANC-1细胞用HEATR1击倒慢病毒（HEATR1-KD细胞）转染。然后，靶向20个基因不同RNAi序列转染到使用含有GFP标记来监测细胞生存力的慢病毒载体HEATR1-KD细胞。GFP阳性细胞进行培养，并持续5天观察到的。活细胞计数和使用HCS仪器软件（CQ1，横河）5天分析。从HCS筛选差异表达的基因被上传到独创性途径分析（IPA，独创性系统）的通路分析和分子鉴定途径。

2.10。免疫组化分析

组织微阵列构建按照标准组织协议如先前所述[13]。Primary antibodies were HEATR1 (rabbit monoclonal; 1 : 500; Abcam, USA), ZNF185 (rabbit polyclonal; 1 : 1000: Invitrogen, USA), and SMAD4 (rabbit monoclonal; 1 : 100; Abcam, USA) followed by incubation with the secondary antibody. The positive staining was measured by a computerized image system including a Leica-CCD camera connected to a Leica-DM-IRE2 microscope. Pictures of representative fields were captured by the Leica QWin Plus v3 software. The specimens with negative or weak intensity (±) of HEART1, ZNF185, and SMAD4 were graded as low expression, while those with moderate or strong (++/+++) were graded as high expression.

2.11。患者的标本和后续

从2012年1月12日至2017年3月3日，在本院同一胰腺手术组连续80例患者进行根治性切除的胰腺癌。总生存期（OS）被定义为手术的日期和死亡或末次随访日之间的时间间隔。在末次随访日为11月1日2019年无的患者接受任何术前治疗，所有患者接受标准吉西他滨的六个周期的化疗手术方案[14]。临床病理特征是根据2002年的国际抗癌联盟的肿瘤 - 淋巴结 - 转移（TNM）分类系统[上演15]。

2.12。统计分析

采用SPSS 20.0(芝加哥，IL, USA)进行统计分析。定性变量采用Pearson进行比较χ²检验或Fisher精确检验。Quantitative data were recorded as mean ± SD and compared using thet- 试验或单因素方差分析。显着性是确定 。采用Kaplan-Meier分析和log-rank检验比较生存率。多因素生存分析采用Cox回归模型。

3.结果

3.1。HEATR1促进铂化疗敏感性的吉西他滨在胰腺癌细胞系

在检测了5个胰腺癌细胞株的HEATR1 mRNA水平后，我们首先利用RNA干扰技术，通过慢病毒载体(shHEATR1)下调胰腺癌细胞株pan -1的HEATR1表达，并打乱打乱的序列作为阴性对照(shCtrl)(图)1(一))。我们发现胰腺癌对吉西他滨的化疗耐药性在HEATR1抑制后更为显著(图)1 (b))，凋亡百分比下降(图1 (c)）时的增殖显着增加（图1 (d)热过后的第5天，r1筋疲力尽。

3.2。差异表达基因芯片分析及HEATR1敲低后HCS筛选

前20出来的具有高表达水平的30个选择的基因进行在HEATR1-KD细胞中的高含量筛选（HCS）作证敲低时，他们的表现形式，有或没有吉西他滨治疗他们是否能影响细胞增殖活性，分别。从基因芯片和生物信息学分析选择后，我们发现ZNF185，其倍数变化（4.5285）是在HEATR1之间这20个基因敲除和对照组中最显著（图2(一个))。然后，我们测试了在使用定量PCR HEATR1-KD PANC-1细胞中的这些30个选定的基因的表达水平（图2 (b))。高内涵筛选（HCS），我们证实，在胰腺癌细胞撞倒ZNF185可以促进吉西他滨化疗敏感性（图2 (c))。

3.3。ZNF185增强了化疗耐药到吉西他滨在HEATR1敲低胰腺癌细胞

我们通过观察细胞凋亡率的升高（图证实ZNF185的化学敏感功能2 (d))和增殖抑制(图2 (e))，在同时抑制HEATR1和ZNF185并使用吉西他滨治疗后，胰腺癌细胞的凋亡。此外，我们发现，在敲除ZNF185后，胰腺癌细胞中年代相和G2 / M期增加，而在G1期的细胞减少（图图2（f）），两者都表明细胞增殖是在抑制年代相。

3.4。在ZNF185基因敲低的胰腺癌细胞中，SMAD4表达增加

为了确定ZNF185可能的下游基因靶点，我们对对照组和shZNF185慢病毒介导的pan -1细胞进行了基因表达谱分析。基因被上调和下调;红色表示上调的基因，绿色表示下调的基因(补充材料(可用)这里））。使用IPA（独创性途径分析）丰富了经典途径进行了分析。我们发现，SMAD4显著上升。定量RT-PCR的表达（图3(一个)和3 (b)）和蛋白质印迹（图图3（c）），用于ZNF185和SMAD4均与基因表达谱数据一致。

3.5。胰腺癌组织中HEATR1、ZNF185、SMAD4的表达及与生存的关系

我们对胰腺癌和正常胰腺组织的分析表达水平。HEATR1，ZNF185，和SMAD4的代表性IHC显示在图4。HEATR1在肿瘤中主要低表达80%(64/80)，在正常胰腺中主要高表达65%(52/80)(图)图4（a）和图4（b）)。我们还观察到，ZNF185在正常胰腺中以低(56.3%，45/80)为主，在癌症中以高(51.2%，41/80)为主(图)图4（c）和图4（d）)。SMAD4是在癌症中的正常胰腺低（50％，40/80）和主要是低（73.8％，59/80）（图4 (e)和4 (f))。该χ²在HEATR1的表达试验显示显著差异（χ²= 37.143, ）ZNF185（χ² = 20.077, ）和Smad4（χ² = 23.309, )所述癌症和正常胰腺之间。

当分析HEATR1，ZNF185，和SMAD4表达分级和临床病理因素之间的关系（表1），我们发现，较高的HEATR1表达分级显示出与正常CA19-9一个显著相关（χ²= 9.879, )和更高的分化（χ² = 9.135, ）而较高ZNF185表达与较高的CA19-9（相关χ² = 4.121, )和较差的分化（χ² = 31.223, ）较高的SMAD4与正常的CA19-9相关(χ² = 7.944, )和更高的分化（χ² = 9.399, )。

队列的中位生存时间为12个月。患者接受吉西他滨化疗后，热r1升高( )和Smad4（ )染色或降低ZNF185（ )染色具有更好的总生存期（图5)。从多变量生存分析，我们观察到高TNM分期，较差分化，HEATR1的更高的染色，或降低在胰腺癌ZNF185的染色物胰腺癌患者的独立预后因素（表2)。

4。讨论

吉西他滨一直是胰腺癌的一线化疗药物在过去20年，但临床反应而总是不尽人意主要是由几个星期内开始化疗治疗[后16]。在之前的研究中，化疗耐药性的可能机制包括由于血管供应不足导致药剂的跨膜运输不足[17，抗凋亡途径[18]和上皮 - 间充质转换[19]。在我们以前的研究中，我们发现HEATR1在胰腺癌是下调导致吉西他滨的阻力。我们假设HEATR1通过抑制Akt磷酸化促进吉西他滨疗效[7]。但是，HEATR1是否有任何功能的下游基因协同调节吉西他滨的化学敏感性仍是一个有趣的进一步目标。

在这里，我们发现敲除ZNF185可以协同促进吉西他滨在胰腺癌细胞中的化疗敏感性。ZNF185属于ZNF家族，位于Xq28染色体长臂DXS52区域，是一种含有肌动素细胞骨架相关Lin-l 1、isl1和mec3 (LIM)域的蛋白[20]。目前对ZNF185的功能尚缺乏了解，但已有研究显示其在前列腺、肺、头颈部鳞状细胞癌中参与细胞增殖、分化和凋亡[21]。我们的观察是第一个确定ZNF185调控和胰腺癌的吉西他滨化疗敏感性之间的关系。此外，我们还初步发现，撞倒ZNF185担任增加胰腺癌其中被证实通过SMAD4的敏感性在体外和体内分析。抑癌基因SMAD4首次被称为胰腺癌缺失基因4 (DPC4)，因为其表达缺陷最先在胰腺癌中被发现[22]。有研究表明SMAD4基因的改变或纯合缺失可以影响TGF-的正常信号β途径和不受控制的细胞生长及胰腺肿瘤发生[23SMAD4的]，低表达与胰腺癌不良预后相关，但也有极少数的研究上SMAD4与胰腺癌吉西他滨化疗敏感性[24]。此外，我们研究的相关证实胰腺癌患者的样本中，我们证明了HEATR1，ZNF185，和Smad4表达的显著与吉西他滨化疗治疗的患者胰腺癌的预后相关。因此，可能的是，患者的高IHC染色HEATR1或ZNF185，这表明化学敏感标记物的低染色，适合于吉西他滨治疗，并且可以具有更好的预后。

我们的研究也有一定的局限性。首先，所有的功能试验在HEATR1-KD细胞来实现，而我们没有，因为HEATR1的大分子量的执行HEATR1的表达。其次，在过去5年中，有用于胰腺癌，包括吉西他滨单一疗法或与其他试剂组合（例如，奥沙利铂和白蛋白结合的紫杉醇），或甚至FOLFIRINOX的更毒的方案增加了不同的化疗方案的数目。虽然这些方案显示出令人鼓舞的美国或欧洲患者预后的好处[25]，大多数中国患者仍不能忍受的，因为副作用，如腹泻或FOLFIRINOX的Abraxane的毒性[26]。此外，根据2019年NCCN指南，没有明确的标准已经建立了胰腺癌的辅助治疗至今。与吉西他滨（1类），5-FU单独化疗/亚叶酸（1类），吉西他滨/希罗达（第1类），或连续输注5-FU在指南作为辅助治疗选项列出。因此，吉西他滨仍然是在东亚胰腺癌，尤其是中国胰腺癌患者的基石化疗药物。无论HEATR1-ZNF185-SMAD4途径发挥在这些药物的化学敏感性相同的机制都需要进一步研究。

总之，这是首次揭示HEATR1，ZNF185，和Smad4在吉西他滨在胰腺癌化疗敏感性有关。这些结果需要进一步的研究具有较大的病人队列，以确认和耐药机制胰腺癌。更好地了解吉西他滨化疗耐药的原因是新颖的综合治疗战略的发展胰腺癌的关键。

数据可用性

支持本研究结果的数据可从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

Yuan Fang, Xu Han, and Jianang Li对这篇文章同样有贡献。

致谢

本研究得到国家自然科学基金(no.)的资助。81702964)。

补充材料

对照组和shZNF-185慢病毒介导的pan -1细胞基因表达谱分析基因被上调，基因被下调;红色表示上调基因，绿色表示下调基因。H3608-1、H3608-2、H3608-3在shCtrl慢病毒转导后重复3次。H3609-1、H3609-2、H3609-3转染ShZNF185后重复3次。(补充材料)

参考

1. A. Stathis和M. J. Moore， <晚期胰腺癌:当前的治疗和未来的挑战>，自然评论：临床肿瘤学第7卷，no。3，第163-172页，2010年。查看在：出版商网站|谷歌学术
2. 《胰腺癌的全身化疗》，胰腺卷。28，没有。3，第301-304，2004。查看在：出版商网站|谷歌学术
3. T.康罗伊，F. Desseigne，M. Ychou等人，“与FOLFIRINOX为吉西他滨转移性胰腺癌，”新英格兰医学杂志卷。364，没有。19，第1817至1825年，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术
4. D. D.冯霍夫，T.欧文，F. P. Arena等人，“与白蛋白结合型紫杉醇+吉西他滨胰腺癌存活率增加，”新英格兰医学杂志，第369卷，no。18, 1691-1703页，2013。查看在：出版商网站|谷歌学术
5. Y.佳和J.解，“有希望的负责癌症吉西他滨抗性的分子机制，”基因与疾病卷。2，没有。4，第299-306，2015。查看在：出版商网站|谷歌学术
6. M. R.格罗夫斯，N.汉隆，P. Turowski，B.A。赫明斯和D.巴福德“的蛋白质的结构磷酸酶2A PR65 / A亚基揭示了其15个串联重复基序HEAT的构象，”细胞卷。96，没有。1，第99-110，1999年。查看在：出版商网站|谷歌学术
7. T.刘，Y.方，H Zhang等人，“HEATR1负Akt的调节，以帮助敏感胰腺癌细胞对化疗，”癌症研究卷。76，没有。3，第572-581，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术
8. 赫尔辛基宣言的修订旨在防止研究参与者的剥削，BMJ卷。347，没有。6，第f6401，2013。查看在：出版商网站|谷歌学术
9. “小鼠中表达的逆转录酶的纯化和特性。大肠杆菌”该生物化学杂志卷。260，没有。16，第9326-9335，1985。查看在：谷歌学术
10. “MTS四氮唑测定法检测20种化学物体外细胞毒性的敏感性和特异性”，国立中山大学化学与化学研究所硕士论文。毒理学卷。124，没有。3，第179-192，1997。查看在：出版商网站|谷歌学术
11. Y.潘，W.单，H. Fang等人，“关于膜联蛋白-V凋亡细胞的敏感和可见光检测使用氨基苯基硼酸改性的金纳米颗粒（APBA-的GNP）标签修饰的底物，”生物传感器和生物电子学第52卷，没有。7, 62-68页，2014。查看在：出版商网站|谷歌学术
12. R. A. Irizarry, B. M. Bolstad, F. Collin等，“Affymetrix基因芯片探针水平数据的总结，”核酸研究卷。31，没有。4，P。E15，2003。查看在：出版商网站|谷歌学术
13. S. O.迪马，C.棚濑，R. Albulescu等人，“炎症性细胞因子如患者导管胰腺癌预后生物标记物的探索性研究，”胰腺第41卷，no。7，第1001至1007年，2012。查看在：出版商网站|谷歌学术
14. M.新芬，M.巴赫拉，T. Liersch等人，“CONKO-005：辅助化疗与吉西他滨联合厄洛替尼吉西他滨与单独在R0切除胰腺癌的患者后的多中心随机化III期临床试验，”临床肿瘤学杂志第35卷，no。第29页，3330-3337,2017。查看在：出版商网站|谷歌学术
15. D. Asano, S. Nara, Y. Kishi等人，“ajcc8对淋巴结分期的单机构验证研究”^日编辑患者胰头癌：细分N2类的建议，”外科肿瘤学年报第26卷，no。7, 2019年第2112-2120页。查看在：出版商网站|谷歌学术
16. M. Amrutkar和I. P. Gladhaug，“胰腺癌化疗吉西他滨，”癌症（巴塞尔），第9卷，no。第11页，2017。查看在：出版商网站|谷歌学术
17. 王建民，“人类胰腺星状细胞分泌蛋白质组的分析”，国立中山大学学报，2002年8月。胰腺卷。40，没有。4，第557-566，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术
18. C.梁，石S.，问：孟等人。“在本质性基质在胰腺癌吉西他滨的复杂角色：我们在哪里和我们要去的地方。”实验与分子医学第49卷，no。12, p. e406, 2017。查看在：出版商网站|谷歌学术
19. T. Arumugam, V. Ramachandran, K. F. Fournier等人，“胰腺癌的上皮细胞向间质转变有助于耐药性，”癌症研究卷。69，没有。14，第5820-5828，2009。查看在：出版商网站|谷歌学术
20. “Xq28中新型LIM结构域基因(ZNF185)的基因组结构及其与同源小鼠转录本的比较”。基因组学卷。43，没有。3，第329-338，1997。查看在：出版商网站|谷歌学术
21. J.-S.张，巩A.和C. Y. F.年轻，“ZNF185，在前列腺癌的肌动蛋白细胞骨架相关生长抑制LIM蛋白”致癌基因第26卷，no。1，第111-122页，2007。查看在：出版商网站|谷歌学术
22. S.琼斯，十张，D·W·帕森斯等人，“在人类胰腺癌的核心信号通路揭示全球基因组分析，”科学，第321卷，no。5897, 2008年1801-1806页。查看在：出版商网站|谷歌学术
23. P. Singh, R. Srinivasan，和J. D. Wig，“SMAD4基因改变预测胰腺导管腺癌患者预后更差，”胰腺第41卷，no。4，第541-546页，2012。查看在：出版商网站|谷歌学术
24. X.疏港，Y.宏发，L.建鹏等人，“在胰腺癌SMAD4的预后价值的meta分析”。平移肿瘤学，第9卷，no。1, 2016年1 - 7页。查看在：出版商网站|谷歌学术
25. C. Nevala-Plagemann，M.伊达尔戈和I.加里多-丽，“从国家的最先进的治疗，以新疗法为晚期胰腺癌，”自然评论：临床肿瘤学卷。17，没有。2，第108-123，2020。查看在：出版商网站|谷歌学术
26. 十，李，D. B.黄，问：Zhang等人，“疗效和化疗的老年晚期胰腺癌的毒性，”Pancreatology卷。20，没有。20，第95-100，2020。查看在：出版商网站|谷歌学术

版权

版权所有©2020元Fang等。这是下发布的开放式访问文章知识共享署名许可，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。