FAM64A促进骨肉瘤的生长和转移，并介导的miR-493

抽象

FAM64A的异常表达与多种癌症的细胞增殖相关。我们检测了FAM64A和上游基因miR-493在OS中的表达。通过大量的实验揭示了miR-493的功能。我们发现OS组织中FAM64A基因和蛋白增加。过表达FAM64A可促进肿瘤增殖、迁移和侵袭。miR-493靶向并负调控FAM64A。我们的数据显示，OS中FAM64A的上调与不良预后相关。

1.简介

骨肉瘤是来源于原始间充质细胞和定义为骨的最普遍的主实体瘤。由于骨肉瘤的异质性，OS的大多数患者的病因仍不清楚。弗莱彻等人。确定在具有改变的肿瘤抑制基因的情况下[增加OS的发病率1]。例如，猫(FAM64A)被证实在白血病、淋巴瘤和一系列肿瘤细胞系中高表达。此外，有报道称其蛋白水平与肿瘤细胞和非恶性细胞的增殖均有密切关系。FAM64A的沉默导致造血细胞增殖和细胞周期进程的下降[2]。但是，FAM64A的研究还不够充分;因此，FAM64A在OS细胞中的作用仍然知之甚少。

胞内信号传导途径，如Notch1的，AKT，Wnt途径，和JAK2的失调/ STAT3被报道参与OS [发展3.- - - - - -6]。Xu等人发现FAM64A是STAT3的积极调节因子，STAT3与多种癌症相关[7]。在这里，我们试图找到一个新的机制，与FAM64A交互的操作系统。在这项研究中，我们提供了一个深入的基因表达模式在OS和控制样本。我们鉴定了与OS相关的基因组畸变和分子机制。我们发现肿瘤来源的miR-493靶向FAM64A并调控OS的细胞生长和转移。

2.材料和方法

2.1。OS的基因组数据

从基因表达综合（GEO;可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的数据库里检索到的基因表达图谱的OS。关键字包括智人使用了OS。在癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库中对OS中FAM64A水平进行信息学分析。

2.2。临床标本

从2016年5月至五月2019年，30例患者中共有包括17名男性和13位女性（平均年龄29岁，范围：19至46岁）确诊为骨肉瘤脊柱纳入本研究在我院（中国）。所有患者在这项研究中，术前没有接受过任何类型的治疗。肿瘤组织和来自患者的相邻正常组织储存在-80℃。这项研究的协议，在我们当地机构批准伦理委员会。

2.3。细胞系

人骨肉瘤MG63、u -20细胞和293T细胞购自中国上海富恒细胞中心。在含10%胎牛血清(Gibco, Life Technologies)的DMEM (Dulbecco 's modified Eagle’s medium, Gibco, Life Technologies)中培养细胞，温度37℃，湿度为5% CO₂。

2.4。肿瘤异种移植模型

异种移植瘤模型为1×10⁷U937 MG-63-争夺/ MG-63-siFAM64A转染的细胞注入到12周龄的C57BL / 6小鼠。后的肿瘤细胞注射2周，之后测量肿瘤。

2.5。细胞转染

所用质粒为pcdh - cmv - mc - ef1 - puro。miR-493模拟物和阴性对照(miR-NC)购自上海基因制药(中国)。将肿瘤细胞培养至6孔板75% confluence后，利用Lipofectamine 2000 (Invitrogen;热费希尔科学)。

2.6。细胞生存能力分析

OS细胞活力用CCK-8测定（同仁分子技术，日本）测量的。具体而言，与7000个细胞的密度细胞/孔首先，在96孔板中接种。一个fter 6 h of culture, cells were transfected with MG-63-NC, MG-63-FAM64, U-2 OS-NC, and U-2 OS-FAM64A, respectively, and then incubated at 37°C with 5% CO₂分别为0,24,48和72 h。在每个时间点，CCK-8试剂为10μl加入到每孔中，随后在37℃下延长孵育2小时。用微型阅读器(Bio-Rad，美国)在450 nm处测定各孔的吸光度。

2.7。细胞入侵检测

OS细胞的侵袭使用Transwell小室（8 Transwell小测定测量 μm，康宁公司)preburden Matrigel (BD，美国)。首先收集细胞，然后在无fbs培养基中重悬，密度为2×10⁵细胞/ ml。在此之后，上室，然后用200接种 μ升细胞悬浮液，而下腔室充满了600 μl含10%胎牛血清的DMEM。在37℃进一步孵育48小时后，用棉签拭子去除非侵入性细胞。在尼康日蚀TS100 (Nikon ECLIPSE TS100)放大倍数为100的条件下拍摄浸润细胞图像，计数细胞数量。

2.8。双荧光素酶活性测定

使用PCR扩增含有miR-493潜在结合位点的FAM64A的3'UTR。然后用NC/494 mimics和psiCHECK2-FAM64A3-UTR WT/psiCHECK2-FAM64A3-UTR MT共转染293T细胞。然后使用双荧光素酶报告基因实验(Promega)测定荧光素酶的相对活性。

2.9。Q-RTPCR

使用TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.)从组织和细胞中分离出总RNA。在miR-493方面，我们使用U6作为内参。使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒合成cDNA(应用生物系统;然后使用TaqMan MicroRNA PCR试剂盒(Applied Biosystems;赛默费希尔科学公司)。本研究中使用的引物如下:miR-493正向、5 ' - ttgtacatggtaggctttctt -3 '和反向5 ' - aaccatttttctcccgacc -3;U6向前，5 ' -GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '和反向5 ' -CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3 ';FAM64A前锋，5 ' -CCTGGAAACGCCTGGAAAC-3 '和倒车5 ' - caaagcactcttagagctgagcg -3 '。2^-ΔΔCq方法测定miR-493和FAM64A的表达水平。

2.10。免疫印迹分析

细胞裂解物在10% SDS-PAGE凝胶中电泳，然后转移到硝酸纤维素膜(GE Healthcare)上。一抗猫2C4(1:10 00)和GAPDH购自Abcam。膜用TBS (Tris-Buffered Saline)和Tween (Sigma-Aldrich)冲洗两次，然后与山羊Antimouse IgG H&L (HRP)在室温下黑暗中孵育1小时。然后使用Bio-Rad ChemiDoc™XRS系统进行膜可视化。

2.11。伤口愈合分析

The cells with a density of 8 × 10⁴细胞/孔被接种在24‐孔板中。在达到约80%的融合度后，用无菌吸管尖在它们之间画一条垂线。然后用温暖的PBS冲洗掉表面悬浮的单细胞。将含10%胎牛血清的新鲜DMEM加入板中，在37℃、5% CO的培养箱中培养₂。细胞分别于0、24、48 h在相差光镜下成像。然后用Image J(美国国立卫生研究院)测量细胞的迁移能力。

2.12。统计分析

本研究所有数据均采用均数±标准差表示。本研究使用SPSS 22.0进行统计分析，采用单向方差分析进行比较。本研究采用Kaplan-Meier法测定小鼠存活率。一个被指定为统计学显著。

3.结果

3.1。OS组织中过表达FAM64A预测不良预后

如图所示1(一)，GSE12865和GSE28425选择上GEO选择差异表达基因，用和logFC绝对值> 1.5。有1504个GSE28425差异筛选基因GSE12865和617点的交点，并得到一个总的147个基因（图1 (b))。在OS组织和邻近的非肿瘤组织FAM64A的表达水平进行分析。如图所示1 (c)和1 (d)，FAM64A和其在肿瘤组织中蛋白质的基因表达水平显著提高与对照样品相比（ )。为了注释这147个基因，我们把重点放在FAM64A上。GO: 0009987细胞过程。在线软件(http://www.oncolnc.org）用于分析TCGA的SARC数据，它被发现患者该基因的高表达和低表达之间KM曲线对数秩分析，表明患者FAM64A的更高表达的差异有不良结果（图1 (e))。

3.2。FAM64A的表达促进OS细胞的增殖，迁移和侵袭

为了进一步研究FAM64A在OS中的作用，我们将质粒转染OS细胞。western blot数据证实，FAM64A在MG-63和U-2 OS细胞中显著上调(图)2(一个)和2 (b), )。通过CCK-8实验和Transwell侵袭实验验证过表达FAM64A对OS细胞增殖和侵袭的影响。如图所示2 (c)和2 (d)，转染FAM64A的MG-63和U-2 OS细胞的增殖率明显高于载体( )。迁移实验显示，转染FAM64A的MG-63和U2OS细胞的迁移数量明显高于转染vector的细胞(图)2 (e)和2 (f); )。此外，侵袭实验表明，侵袭能力均显着提高在MG-63，并用质粒FAM64A（图转染的U2OS细胞2（G）和2（H）; )。

3.3。沉默FAM64A可以抑制OS的增殖、迁移和入侵

为了验证FAM64A的作用模式，我们利用siRNA下调其在mg-63和U-2 OS细胞中的表达(图)3(一个)和3 (b), )。将FAM64A siRNA导入MG-63和U-2 OS细胞，导致肿瘤细胞增殖受阻(图)3 (c)和3（d）; ),迁移(数据图3（e）和图3（f）; ),和入侵(数据图3（g）和3（H）; ),与争夺组相比。

3.4。沉默FAM64A对小鼠OS肿瘤生长有抑制作用

我们在体内探索了FAM64A的调控作用。如图所示图4（a）和图4（b）与对照组相比，si-FAM64A组肿瘤体积及重量明显降低( )。的卡普兰 - 迈耶存活功能显示，沉默FAM64A显著改善荷瘤小鼠的存活（图图4（c）, )。

3.5。FAM64A是miR-493的目标

通过生物信息学分析，我们发现许多miRNAs可能调控FAM64A。MiR-493已被证实在骨原性肉瘤中发挥抑癌基因的作用，抑制骨原性肉瘤的细胞生物学过程，与FAM64A发挥相反的作用[8,9]。所以，我们选择的miR-493，以研究其对FAM64A表达调控。我们的数据显示，包含的miR-493-3'UTR内FAM64A（图潜在的互补结​​合位点图5（a）)。图中显示了miR-493可能参与FAM64A通路图5（b）。荧光素酶活性数据显示，转染psiCHECK2-FAM64A 3’-UTR WT和miR-493模拟物后，293T细胞的荧光素酶活性明显下降(图)图5（c）, )。我们还分析了转染miR-493模拟物、inhibitor或NC的MG-63和U-2 OS细胞中FAM64A的水平。转染48 h后，real-time PCR检测基因mRNA水平的表达。如图所示5 (d)和5 (e)，模拟物中FAM64A mRNA水平明显降低，负荷抑制剂时(均为)FAM64A mRNA水平升高 )。模拟物的作用被MT抑制，表明miR-493靶向FAM64A 3 ' -UTR。我们还发现miR-493在OS组织中表达下调，并与FAM64A mRNA表达负相关(图)5 (f)和5 (g), )。

3.6。MiR-493通过调控FAM64A抑制OS细胞的增殖、迁移和侵袭

为了研究miR-493/FAM64A在OS中的作用，我们用带有FAM64A质粒和FAM64A sirna的miR-493模拟物和miR-493抑制剂转染OS细胞。用CCK-8实验、创面愈合实验和Transwell侵袭实验观察其增殖、迁移和侵袭情况。结果表明，miR-493显著影响细胞增殖(图)6(一)- - - - - -6 (d)），迁移（图6 (e)- - - - - -6 (j))和入侵(数字如图6（k）的- - - - - -图6（p）的）MG-63和U-2 OS细胞的，而FAM64A质粒和siRNA的FAM64A可以分别衰减的miR-493模拟物和miR-493抑制剂，的图的影响（6(一)- - - - - -图6（p）的)。这些实验表明，miR-493通过调节FAM64A抑制OS细胞的增殖、迁移和侵袭。

4。讨论

最近的研究表明，FAM64A，又称恶性转化猫PIMREG，参与[10- - - - - -13]。FAM64A最早在血液癌，这被称为CALM / AF10相互作用的蛋白质的研究。据报道，FAM64A的更高水平与肿瘤增殖过程相关联。然而，FAM64A的实体肿瘤中的作用仍然是少数。在这里，我们评估了基因表达数据库OS的剖析，发现FAM64A。基于从GEO数据，我们选择FAM64A和肿瘤样品中评估了其表达。我们发现相比于非肿瘤组织中的肿瘤组织FAM64A的升高的表达。

此外，我们通过建立过表达FAM64A OS细胞模型，这表明潜在的的miR-493如何参与上调迁移和肿瘤细胞的侵袭分子机制确定促进致瘤性。以前的证据表明了miR-493抑制肺肿瘤的生物学行为[14]。同时，miR-493还通过多种细胞内信号通路在结肠癌、膀胱癌、卵巢癌等多种癌症中发挥抑制作用[15- - - - - -17]。

接下来，我们建立了肿瘤异种移植模型，进一步研究了FAM64A在小鼠中的预后作用。我们发现转染sirna的小鼠肿瘤体积和肿瘤重量急剧下降，表明沉默FAM64A抑制了肿瘤的生长。OS的Kaplan-Meier曲线在活的有机体内发现FAM64A表达上调呈正与更坏的结果相关。为了证实FAM64A和miR-439的作用，我们进行了荧光素酶报告基因检测。FAM64A敲低对OS细胞的作用模仿那些受miR-493模拟物诱导受miR-493抑制剂被颠倒。

总之，我们的数据表明，miR-493在OS中通过与其3 ' UTR结合负调控FAM64A。我们的研究发现FAM64A表达较高在体外和在活的有机体内与在OS生存不良有关。这是第一次对FAM64A受miR-439在骨肉瘤的恶性程度调节的参与线索。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据和材料都包括在发表的文章中。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

这项工作是由中国国家自然科学基金资助NSFC81300346支持。用来支持这项研究的结果的数据和材料都包括在发表的文章中。

参考

1. 《软组织和骨骼肿瘤的病理学和遗传学》，林嘉欣主编世界卫生组织肿瘤分类张德华主编，国际癌症研究机构出版社，法国里昂，2002年。查看在：谷歌学术搜索
2. I. Barbutti，J.M.泽维尔-Ferrucio，J. A.马查多 - 内托等人，“CATS（FAM64A）异常表达减少的造血细胞集落生成的，”Oncotarget第7卷，no。42，第68385-68396，2016。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
3. 林志宏，纪振福，“骨原性肉瘤中的Wnt信号转导”，陈，黄宝华，《骨原性肉瘤中的Wnt信号转导》。实验医学和生物学的进展卷。804，第33-45，2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
4. J.严，Q.王，K. Zou等人，“在JAK2 / STAT3信号传导途径的抑制施加在骨肉瘤的治疗效果，”分子医学报告第12卷，no。1, 2015年第498-502页。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
5. j . t m m。Jiang, L. Jiang等，“Notch激活作为成骨肉瘤的驱动因素”，癌细胞卷。26，没有。3，第390-401，2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
6. L. Mei, W. Sang, K. Cui, Y. Zhang, F. Chen, and X. Li，“去甲斑虫素通过c‐Met/Akt/mTOR通路抑制人骨肉瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡，”癌症科学第110卷，no。2，第582-595页，2019年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
7. Z.-S。徐,H.-X。张,裴伟伟。Li等人，“FAM64A积极调控STAT3活性，促进Th17分化和大肠杆菌相关癌变，”美国国家科学院院刊第116卷第2期21，页10447-10452,2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
8. Zhang, G. Luo, C. Yu, G. Yu, R. Jiang，和X. Shi，“MicroRNA‐493‐5p通过靶向Kruppel‐样因子5抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移，”杂志细胞生理学第234卷第2期8，第13525-13533页，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
9. Qian M.， H. Gong, X. Yang等，“MicroRNA-493通过直接靶向特异性蛋白1抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭，”肿瘤的信件，第15卷，第8149-8156页，2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
10. Zhang, L. Qian, J. Wu等，“FAM64A上调促进乳腺癌细胞上皮-间质转化并增强stemness特征，”生物化学和生物物理研究通讯，第513卷，no。2，第472-478页，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
11. K.桥本，A.儿玉，T. Honda等人，“Fam64a是缺氧胎儿心肌的小鼠的新型细胞周期启动子，”科学报告第7卷，no。1，第4486页，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
12. L. F. Archangelo, P. a . Greif, a . Maucuer等，" The CATS (FAM64A)蛋白是激酶相互作用Stathmin (KIS)的底物，"生物与生物物理学报(BBA) -分子细胞研究，第1833卷，no。5, 1269-1279, 2013年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
13. L. F. Archangelo, P. a . Greif, M. Holzel等人，“The CALM and CALM/AF10 interactor CATS是增殖的标志，”分子肿瘤学第2卷第1期4，第356-367页，2008。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
14. Gu Y.， Cheng Y.， Song Y.等，“MicroRNA-493通过调控E2F1抑制肺癌肿瘤生长、侵袭和转移”《公共科学图书馆•综合》，第9卷，no。8，文章ID e102602, 2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
15. A. Cui, z.jin, z.gao等，“下调miR-493通过抑制IRS4表达促进黑色素瘤增殖，”肿瘤生物学卷。39，没有。5，2017年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
16. K. Ueno, H. Hirata, S. Majid等，“肿瘤抑制因子MicroRNA-493通过下调RhoC和FZD4降低人膀胱癌细胞的运动和迁移能力”分子癌症治疗卷。11，没有。1，第244-253，2012。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
17. M. Kleemann, H. Schneider, K. Unger等，“miR-493-3p直接靶向AKT2、STK38L、HMGA2、ETS1和E2F5诱导卵巢癌细胞凋亡的研究”细胞和分子生命科学第76卷，no。3，第539-559页，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2020迎江等人。这是下发布的开放式访问文章知识共享署名许可，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。