Gelsolin促进癌症发展通过调节Epithelial-Mesenchymal过渡在肝细胞癌和与不良预后相关

文摘

Gelsolin (GSN),细胞骨架蛋白,经常在不同的癌症,促进细胞的能动性。内脏大神经生物功能的肝细胞癌(HCC)及其机制尚不清楚。内脏大神经的表达是一群188名肝癌患者的评估。内脏大神经的影响肿瘤细胞的迁移和入侵检测。然后,扣在肿瘤生长的作用在活的有机体内确定使用癌症转移分析。内脏大神经促进肝癌进展的可能机制探索。因此,扣在肝癌组织中。内脏高表达与埃德蒙森末成绩显著相关,封装,和多个肿瘤。高患者内脏大神经表达更糟糕的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)比那些低扣的表情。内脏大神经表达被确认为一个独立的危险因素在两个操作系统(危害风险(人力资源)= 1.620,95%可信区间(CI) = 1.105 - -2.373, )和DFS (HR = 1.744, 95% CI -2.523 = 1.205, )。此外,扣可拆卸的明显抑制肝癌肿瘤细胞的迁移和入侵,而内脏大神经超表达减弱这些影响通过调节epithelial-mesenchymal过渡(EMT)总之,内脏大神经促进癌症发展,与肝细胞癌患者的不良预后有关。内脏大神经调节EMT促进肝癌进展。

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是最常见的癌症之一,全世界癌症死亡的第四大原因(1]。百分之七十的肝癌患者患有肿瘤复发。转移复发主要有助于导致HCC患者的高死亡率(2]。然而,肝细胞癌转移的分子机制仍不清楚。因此,了解肝癌发展的潜在机制是一个重要的第一步小说的发现有效的治疗方法。

癌症的传播在很大程度上是与细胞迁移和入侵。Gelsolin (GSN)是一种actin-binding蛋白质和肌动蛋白丝的关键调节器装配和拆卸,促进细胞的能动性。它位于细胞质中,线粒体和等离子体(3]。内脏大神经被报道与板状伪足的形成内皮细胞(4]。然而,内脏大神经之间的关系表达式和转移仍然是有争议的。内脏大神经最初被认为是一个肿瘤抑制基因,下调在某些类型的癌症,包括人类乳腺癌、大肠癌、胃、膀胱、和非小细胞肺癌(5- - - - - -9]。相反,一些报告发现内脏大神经调节在胰腺和妇科的癌症的一个子集,作为癌基因(10,11]。

据报道,内脏大神经调节在人类肝细胞癌组织和肝细胞细胞系Hca-F, lymphogenous高转移潜能(12,13]。一些研究表明,内脏大神经与epithelial-mesenchymal过渡的过程(EMT)在乳腺癌和胃肿瘤(8,14,15]。然而,内脏大神经介导肝细胞癌的转移的机制并不明确。

在肝细胞癌进一步阐明内脏大神经的作用,我们研究了内脏大神经表达在人类肝细胞癌和相邻的非癌变组织和内脏大神经的影响在肝癌细胞入侵和迁移。我们发现内脏大神经在肝癌组织中表达高于在邻近的肝组织,而内脏转移性肝肿瘤组织中的表达高于在nonmetastatic肝癌肿瘤组织。此外,我们的研究结果表明,内脏大神经促进肝癌细胞迁移和入侵在体外的可拆卸的内脏大神经变弱肝癌转移在活的有机体内,有可能通过影响EMT过程。

进一步阐明内脏大神经在肝癌的作用,我们在肝癌研究内脏大神经表达,它对患者生存的影响,及其与肿瘤的关系阶段。我们还研究了GSN调节癌症的分子机制。我们的研究结果显示,内脏大神经促进肝癌细胞的迁移和入侵在体外的可拆卸的内脏大神经变弱肝癌转移在活的有机体内通过影响EMT过程。

2。方法

2.1。肝癌患者数据和组织标本

共有188名肝癌组织标本来自接受肝切除术的患者在第一附属医院,中山大学(广州)2006年1月至2008年12月。另一个40对匹配的肝细胞癌和相邻的非癌变肝脏组织样本中获得2009年1月至2013年5月之间的操作。样品在液氮快速冻结并存储在一个冰箱−80°C的后续实验,如RNA提取和福尔马林固定和石蜡包埋免疫组织化学。无病生存期(DFS)和总生存期(OS)被用来评估疗效。中描述的随访的病人进行了我们的以前的工作16]。后续的最后期限是2015年10月31日。我们收集病人的完整的临床和病理特征。研究1975年赫尔辛基宣言的伦理指南,2013年修订。所有患者知情同意使用他们的临床标本进行医学研究。人体的使用材料是经伦理委员会批准的中山大学第一附属医院。

2.2。细胞系,细胞培养

人类肝癌细胞株HepG2从美国购买类型文化收集(写明ATCC;美国马里兰州罗克维尔市)。人类肝癌细胞系HepG3B HCCLM3, smmc - 7721和Bel7402正常L02肝细胞细胞系都从生物化学和细胞生物学研究所获得中国科学院和验证。

细胞系培养在低糖杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)含10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素和链霉素0.1毫克/毫升在37°C和5%的公司₂。

2.3。免疫组织化学分析Gelsolin

使用Gelsolin抗体进行免疫组织化学(包含IHC) (G4896σ)中描述我们的以前的工作17]。免疫组织化学分析是由两个独立的研究人员对病人数据也不清楚。清水正孝的标准(18)被用来分数的表达Gelsolin蛋白在肝癌标本从0到3 +。患者得分为0或1 +被定义为低表达组,而那些得分2分或3 +被定义为高表达组。

2.4。生产高和Low-GSN-Expressing肝癌细胞系

我们购买了内脏大神经超表达质粒从Forevergen生物科学(广州)。的顺序GSN-specific反义寡核苷酸是5′-UUCAGAACAAAGGCAUCGdTdT-3′。寡核苷酸的顺序控制5′-UUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′。HCCLM3细胞转染内脏大神经小发夹RNA(成分)或争夺成分,如前所述,smmc - 7721细胞转染与内脏大神经超表达质粒或一个矢量控制(19]。接下来,0.5毫克/毫升purinomycin被用来选择转染细胞。定量实时聚合酶链反应(存在)和免疫印迹(WB)分析被用来确认稳定转染克隆。

2.5。存在和白平衡分析

存在和世行分析进行如前所述[20.]。存在被用来分析的记录β肌动蛋白(控制)和内脏。引物被从英杰公司购买(热费希尔科学,Inc .)。引物序列如下:β肌动蛋白,向前5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′和反向5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′内脏大神经,向前5′-GGTGTGGCATCAGGATTCAAG-3′和反向5′-TTTCATACCGATTGCTGTTGGA-3′。

2.6。Transwell迁移和入侵检测

transwell迁移试验,无血清DMEM包含5×10⁴细胞接种到8的参议院μm transwell插入(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西),和DMEM含有10%牛血清白蛋白(BSA)添加到众议院。在37°C 24小时孵化后,细胞在参议院小心被移除,和细胞连接到低transwell膜固定在20%的甲醇结晶紫染色和0.1%。一个倒置显微镜(日本尼康、Chiyoda-Ku)被用来研究细胞的数量。transwell入侵检测,所有程序都是一样的那些描述transwell迁移试验,除了参议院是涂层与基底膜基质(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)。

2.7。在活的有机体内肺转移模型

在活的有机体内转移决心执行在雄性BALB / c裸小鼠移植瘤模型thymus-free(3 - 4周)从动物中心获得广东省(广州)。老鼠随机nonblinded方式和治疗。实验动物的使用是基于从美国国立卫生研究院的指导方针。对于肺转移模型,肝癌细胞(1×10⁶200年)暂停μL的磷酸盐(PBS)通过尾静脉注射静脉注射(每组5只老鼠)。终止的时候,老鼠被安乐死。证实了肺切除,转移haematoxylin-eosin(他)染色。动物实验是生命的动物使用委员会批准的中山大学第一附属医院。

2.8。统计分析

SPSS软件(19.0;SPSS, Inc .,芝加哥,IL)是用于统计分析。测量数据表示为平均值±标准偏差(SD)。学生的学习任务用于组间比较。分类数据分析的卡方检验或者确切概率法。使用kaplan - meier法和对数秩测试分析存活率。Cox回归模型多元竞争的风险被用来进一步分析确认为重要因素( )在单变量分析来识别重要的肝细胞癌患者的DFS和操作系统的独立预测指标。向前一步一步的计划被用于变量选择和最终的多变量模型。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。内脏大神经在肝癌组织中

调查的潜在临床意义内脏大神经和HCC进展,内脏大神经信使rna和蛋白质含量在肝细胞癌标本配对和相邻的非癌变肝脏组织测量。内脏大神经信使rna和蛋白质水平显著调节肝细胞癌组织中与相邻正常肝组织(数字1(一)和1 (b))。免疫组织化学分析表明内脏大神经主要定位在细胞质中肝细胞癌组织,符合之前的报道,而GSN-positive染色强度明显增加的价格相比在肝细胞癌组织非癌变组织(图1 (c))。我们也评估内脏大神经表达的差异之间的转移性肝癌组织和肝癌组织原位(图1 (d))。因为内脏大神经更高在肝癌组织中表达,IHC的涂颜色的开发时间是20分钟如图1 (c)。为了显示转移和nonmetastatic组织之间的区别,IHC检测图1 (d)中,我们使用一个包含IHC显色时间短(5分钟),所以IHC结果nonmetastatic组低,染色很浅。

3.2。内脏高表达与肝细胞癌患者的预后不良

我们评估是否内脏大神经表达与肝细胞癌患者的临床病理因素。188例肝细胞癌患者分为两组根据IHC结果:内脏大神经高表达组(n= 95)和内脏大神经低表达组(n= 93)。结果表明,高内脏大神经表达在HCC呈正相关,一个先进的埃德蒙森年级( ),封装( ),和多个肿瘤病变( );然而,高内脏大神经表达肝细胞没有明显与年龄、性别、家族肝癌史,甲胎蛋白(AFP)、肝硬化、肿瘤大小( )(表1)。

此外,我们探讨内脏大神经的预后价值的表达式。我们发现3年期和5年期的DFS率(15.8%,11.6%与48.4%和46.2%, )和操作系统率(40.0%,27.4%与61.3%和57.0%, )肝癌患者的内脏大神经高表达组比低的内脏大神经表达组(数字2(一个)和2 (b))。kaplan meier分析表明,法新社,埃德蒙森年级,肿瘤大小,信封,肿瘤,血管侵犯,GSN表达式,并且tumour-node-metastasis DFS (TNM)阶段风险因素和操作系统(表2)。从多变量Cox回归分析、高内脏大神经表达被发现是一个独立的预后因素,较低的DFS(危害风险(人力资源)= 1.744,95%可信区间[CI]: 1.205 - -2.523, )和操作系统(人力资源)= 1.620,95%置信区间CI: 1.105 - -2.373, )(表3)。这些结果表明,高内脏大神经表达与预后不良相关显著,表明肝脏tumourigenesis内脏大神经的潜在作用。

3.3。内脏大神经与肝癌有关迁移和入侵

检查内脏大神经在肝癌细胞中表达,存在和世行分析在五肝癌细胞株进行,即SMMC7721, HepG2, HCCLM3, HepG3B, Bel7402 L02肝细胞行作为一个正常的控制。内脏大神经的mRNA水平HCCLM3和HepG2细胞高于L02细胞,而其他三个细胞系的内脏大神经水平较低(图3(一个))。共的蛋白表达水平与mRNA水平(图一致3 (b))。

据报道内脏大神经经常细胞迁移和入侵的关键8,19,21,22]。考虑到内脏大神经表达和转移之间的关系,我们执行一个免疫组织化学分析,调查扣作为一个潜在的调制器在肝癌细胞活性。来确定内脏大神经影响肝癌细胞的能动性,我们在SMMC7721细胞过表达内脏大神经,撞倒在HCCLM3内脏大神经细胞(图3 (c))。然后,我们测量的迁移和入侵能力这两个新的细胞系。vector-transfected细胞相比,相对数量的迁移和入侵SMMC7721细胞转染与内脏大神经显著高于(数字3 (d)和3 (e))。相比之下,内脏大神经导致的可拆卸的已故HCCLM3细胞(数据迁移和入侵3 (f)和3 (g))。这些结果表明,内脏大神经功能作为一个积极的调制器肝癌转移,促进肝癌细胞的迁移和入侵。

3.4。内脏大神经促进EMT在肝癌细胞

肿瘤转移,包括肿瘤细胞的迁移和入侵,总是与EMT有关。我们接下来想确定内脏大神经影响肝癌细胞运动性调制EMT和免疫印迹分析执行后内脏大神经过度和GSN击倒。的差别在GSN-overexpressing SMMC7721细胞,我们观察到对这些钙上皮标记,和upregulation N-cadherin,间充质标记。波形蛋白也是调节(图4(一))。相比之下,钙粘蛋白增加,N-cadherin减少GSN-knockdown HCCLM3细胞。波形蛋白表达下调(图4 (c))。基质金属蛋白酶(MMP) - 2和MMP9,这被称为zinc-dependent肽链内切酶,与tumourigenesis紧密相关,转移和间充质细胞入侵至关重要。我们发现,MMP2和MMP9 mrna在SMMC7721细胞显著调节内脏大神经过度HCCLM3细胞中表达下调与内脏大神经击倒(数字4 (b)和4 (d))。这些结果表明,内脏大神经促进EMT在肝癌细胞中,从而提高细胞迁移和入侵。

3.5。击倒的内脏大神经变弱肝癌转移在活的有机体内

此外,探索生物内脏大神经在肝癌中的重要性,我们检查了在异种移植肿瘤的生长实验。人类肿瘤细胞被注入裸鼠尾静脉注入,监测肿瘤的生长。8周后,这一事件率和肺转移性结节的数量显著降低sh-GSN组相比sh-NC组。代表histomorphological总值和他染色图像数据所示5(一个)和5 (b)。这些结果表明,扣可拆卸的有效降低了转移性肺肿瘤负担。针对内脏大神经能有效地降低肝癌转移在活的有机体内。

4所示。讨论

癌症转移是极其复杂的,可以影响成千上万的因素。异常的细胞活性和肿瘤微环境的失调都是癌转移的重要原因(23]。肿瘤细胞的迁移和入侵组织障碍需要特定的降解细胞外基质的组成部分。内脏大神经最初报道减少在许多癌症,包括胃、乳腺癌、结肠直肠癌,被认为是一种肿瘤抑制基因(6- - - - - -8,24]。然而,据报道,内脏大神经移植和促进细胞迁移和入侵10,11]。以前的研究也表明,内脏大神经参与肿瘤转移的规定(8,15协会),但目前还不清楚。内脏大神经的作用在不同类型的癌症是有争议的。

在这项研究中,我们在188年首次检测到内脏大神经的表达肝细胞癌组织和5细胞株和发现内脏大神经调节在组织和细胞。第二,我们探讨是否内脏大神经表达与肝细胞癌患者手术后的预后有关。进一步的实验后,我们确认内脏大神经可能是肝细胞癌患者术后预后的独立因素。这些结果表明,内脏大神经可能在HCC进展起着重要的作用。因此,我们研究了内脏大神经促进肝癌的进展。

肿瘤入侵往往伴有上皮标记的损失和间叶细胞标记的收购,包括移民和能动的行为,称为EMT。EMT的概念提供了一种新的方式来识别基因重要的癌肉瘤和恶性的发展状态。越来越多的证据表明转化生长因子- 1 (TGF -β1)触发上皮间充质转变(EMT)。陈等人。14)发现,在TGF -β1-enriched细胞信使rna表达水平间充质细胞的标记(即。,N-cadherin and vimentin) were found to be increased in concomitance with the increased expression for GSN. This study indicated that GSN may involve in the EMT process of tumour cells. We found that GSN plays an inhibitory role in HCC metastasis by modulating EMT. We first measured the migration and invasion abilities of GSN-overexpressing or GSN-knockdown HCC cells and revealed that GSN promotes cell migration and invasion.在活的有机体内,我们建立了小鼠肝细胞癌肺转移模型,发现的可拆卸的内脏大神经显著降低肺转移性结节的数量。从力学上看,我们knockeddown内脏大神经和发现调节钙粘蛋白表达下调N-cadherin和波形蛋白。在以前的研究中,MMP2和MMP9确定扮演一个角色在促进和增强转移(24]。我们发现减少MMP2和MMP9信使rna,而内脏大神经过度产生了相反的结果。然而,内脏大神经的具体机制和交互影响EMT仍有待确定。

固体肿瘤的转移、血管侵犯的一个重要组成部分新创肿瘤生长。众所周知,可以广泛刺激血管侵犯的目标基因EMT-signalling通路,比如MMP9。MMP9由MDSCs调节肿瘤血管化,从而促进肿瘤进展和转移(25,26]。此外,据报道,内脏大神经表达与血管生成相关的升高在体外VEGF-A-induced血管生成模型(27),这表明内脏大神经可能促进肿瘤组织的血管化。我们的工作表明内脏大神经能促进EMT信号和随后的肿瘤入侵。这些证据提供提示,内脏大神经可能促进肝癌细胞的血管侵犯。

在这项研究中,我们的研究表明,内脏大神经的过度表达与侵略性肿瘤表型和肝切除术后肝细胞癌患者的预后不良。此外,在体外和在活的有机体内测量证实了内脏大神经促进肝癌进展的作用。此外,我们表明,内脏大神经提高肝癌细胞调节EMT能动性和促进转移。因此,我们建议策略旨在表达下调HCC患者的内脏大神经内脏大神经高表达可能会提供一个有前途的方法来减轻肝癌的进展。总之,我们确定的高表达在肝细胞癌组织和内脏大神经还表示内脏大神经在肝细胞癌的致癌作用可能为肝癌的靶向治疗提供新策略overexpressing内脏大神经。

数据可用性

在这项研究中使用的数据和分析可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

林Yixi张,小菁罗和健胃的贡献同样工作。YXZ设计,执行实验,写的手稿。XJL, XJH、XL、JWL执行实验执行和数据分析。科幻、PF和hj键进行修改设计和手稿。WD和KPL负责行政支持,实施实验,工程监理、设计、数据解释和修订手稿。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81401324和81401324)和中国博士后科学基金会(2019 m653189)。

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