全基因组测序为特征的体细胞突变和途径的景观大肠癌肝转移

摘要

目的。肝转移仍是结直肠癌癌症相关死亡的主要原因。结直肠癌肝转移发生发展的机制尚不清楚。方法。收集8例结直肠癌肝转移患者的原发肿瘤组织和血样，进行核酸提取和文库构建。进行全外显子组测序以检测基因组变异。利用生物信息学对这些样本的测序数据进行综合分析，包括肿瘤突变负担的差异、基因突变的特征、信号通路等。结果。结果表明，突变频率最高的前3个基因为TP53,APC,喀斯特。本研究的肿瘤突变负担中位值为每MB 8.34个突变，与癌症基因组图谱数据库有显著差异。分子功能和信号通路分析表明，突变基因可分为5大类39条信号通路，涉及Wnt、血管生成、P53、阿尔茨海默病早衰素通路、notch、cadherin信号通路。结论。综上所述，我们发现了结肠直肠癌肝转移过程中广泛的基因和通路改变，这将有助于设计个体化药物的临床治疗。

1.介绍

结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是全球第三大常见恶性肿瘤，也是导致癌症相关死亡的主要原因[1]。转移仍然是癌症相关发病率的主要原因，并且由于肝转移结直肠癌死亡率占约25％[2]。虽然早期发现和预防原发性和转移病灶或手术切除可降低CRC发生风险，提高CRC生存率[3.- - - - - -5]，转移性CRC仍然是癌症相关死亡的首要原因，治疗方法都没有选择性。

先前的研究表明，基因突变，如频率率喀斯特,NRAS,BRAF,PIK3CA在CRC人群不同[6]。AMER1是553例CRC中常见的突变基因[7]。TMEM9作为一种新的人跨膜蛋白，反式激活由β联蛋白的功能在CRC和mTOR信号信令WNT的正反馈调节器，已经提出了参与肿瘤发生的重要因素[8,9]。因此，更好地了解CRC的生物学和表型进化及其在转移过程中的分子和遗传机制至关重要。

为了进一步研究结直肠癌肝转移(CRLM)的遗传特征，我们对8例CRLM患者进行了全外显子组测序(WES)。分析了体细胞突变、肿瘤突变负荷(TMB)、突变基因的分子功能和信号通路。以期为结直肠癌肝转移患者的治疗提供临床帮助。

2.病人和方法

2.1。病人标本采集

血液和原发性CRC肿瘤组织标本8例五一期间2018厦门大学附属第一医院肿瘤科CRLM收集到十一月2018年纳入研究之前，所有患者的书面知情同意书。相应的肿瘤组织样品，其通过用纳入标准匹配的两种分子病理学家一个组织学证实腺癌。这项研究是在按照赫尔辛基宣言进行，并批准了厦门大学附属第一医院的伦理委员会[10]。

2.2。DNA提取

从肿瘤样本和匹配的外周血白细胞的连续切片中提取DNA作为种系DNA对照。病理医师对肿瘤细胞群进行估计，确保70%以上的细胞为肿瘤细胞。使用DNeasy blood and Tissue试剂盒(69504,QIAGEN, Venlo, Netherlands)按照说明书从FFPE和血液样本中分离DNA。采用安捷伦生物分析仪(美国)测定DNA含量。

2.3。全外显子组测序和数据处理

从基因组DNA靶捕获下拉和外显子 - 宽文库通过xGen®外显子组研究小组（集成DNA技术公司，伊利诺伊州，美国）和TruePrep DNA文库制备试剂盒V2为Illumina公司（＃TD501，Vazyme，南京生成，中国）。作为一对端上的Illumina HiSeq 2500平台上的序列读取进行捕获文库的序列。测序读数进行处理，并映射到参考GRCH37 / hg19人类基因组组装和到所识别的种系变异。进行进一步本地重排以改善对准的个别读取[11]。

2.4。变异注释和变异签名分析

体细胞突变鉴定和插入缺失是通过Mutect [注解12和体细胞Indel检测器[13]。所述变体数据用ANNOVAR [注释14]及致癌者[15]，并由MAF工具转换为MAF档案[16]。使用Intogen分析癌症驱动基因[17，包括致癌驱动FM和致癌驱动CLUST。这两种工具都检测了阳性选择的信号，这些信号出现在肿瘤发展过程中被选择的基因中，因此可能是驱动因素。通过R脚本将Intogen预测的肿瘤顶级驱动突变谱可视化，包括突变率和突变亚类/亚型(过滤截止，致癌驱动FM)value ≤ 0.1).

2.5。统计分析

所有相关成分的临床和生物变量使用SPSS统计22.0包装和ggpubr包[使用18[题意]19在必要时，用费雪检验或非参数检验。采用Kruskal-Wallis检验分析不同数据集之间TMB是否存在差异。

3.结果

3.1。患者特征

我们收集了8例诊断时患有CRLM的患者的肿瘤组织和匹配的血液，其中男5例，女3例，平均年龄66.6岁(46-83岁)。其中一名患者曾吸烟，另外七名患者不吸烟。此外，一名男性患者也是酗酒者。根据解剖分类系统，75.0%(6/8)的标本分为左半结肠癌，2例为右半结肠癌。所有患者均为IV期，接受化疗。37.5%(3/8)患者有糖尿病、高血压、冠心病、高尿酸血症等慢性病史。没有患者在手术前接受过放疗。患者的详细临床特征见表1和补充表1。

3.2。全基因组测序和体细胞突变的鉴定

我们与血液匹配一起进行WES上DNA从8个肿瘤组织，然后用244x平均深度成功分析。体细胞突变通过比较在非引用等位基因在肿瘤组和对照组显著的变化确定。总体而言，1151种非同义单核苷酸变体（SNV）被确定（补充表2)。的全基因组测序结果和算法生成的臂长度的拷贝数改变的概述显示在图1。每个非同义SNV基因与已知的突变在之前的研究中鉴定并进行Mutsig分析。如图所示1， S02有最多的snv，其次是S03。我们根据突变频率列出了前75个基因。其中,TP53（100％），APC（75％），和喀斯特(62%)是突变率最高的基因。错义突变是最常见的突变类型，此外还有帧移位del、帧ins、帧del等(图)1)。

我们还利用WES测序的体细胞非同义突变来计算TMB。整体来看，我们发现不同样本的TMBs存在显著差异，中位值为8.34突变/MB(范围为2.79-17.04突变/MB)(图)2)。

为了比较在CRLM和TCGA数据库（COAD和READ）之间TMB的差异，我们使用秩和检验非参数检验方差齐性检验之后测试多组数据的方差分析（因此，ANOVA不能使用），并多个数据库之间的同伙发现显著差异（= 5.9Ë−(图5)3.)。

3.3。突变签名的景观

原则上，突变的所有类型（如取代，缺失或插入，和重排）和任何附件的突变特性，例如，突变或突变发生在转录链的序列上下文中，可掺入到由该组特征其中突变特征被定义。

We extracted mutational signatures using base substitutions, and six classes of substitutions (C > A, C > G, C > T, T > C, T > A, and T > G) were referred to by the pyrimidine of the mutated Watson–Crick base pair. In this study, the six mutation types were compared with the TCGA database, and it was found that the proportion of these six mutation replacement types was roughly the same. The mutation percent of C > T was the highest in all substitutions, and this study has no significant difference with COAD and READ in this substitution. T > G substitution have significant difference between CRLM with COAD and READ (Figures4(一)和4 (b))。

3.4。CRLM相关基因的分子功能和途径分析

为了进一步描述突变基因的功能及其所涉及的调控途径，我们使用了黑豹分类系统[20.]，一个基于本体的路径数据库加上数据分析工具。结果表明，分子功能可分为结合活性、催化活性、分子功能调节活性、分子换能器活性和转录调节活性五大类。其中结合活性类(40)和催化活性类(32)的功能命中最多(图)5)。

通过豹分类系统通路分析,发现74年pathway-related基因参与共有39个主要信号通路,其中Wnt信号通路途径与更高的频率(P00057),血管生成(P00005) P53通路(P00059),老年痴呆症disease-presenilin通路(P00004),切口信号通路(P00045)和钙粘蛋白信号通路(P00012)。其他涉及的通路和每个通路涉及的基因见图6和补充表3.。

4.讨论

CRC是许多国家第三大常见恶性肿瘤，也是癌症死亡的第二大原因。由良性腺瘤性息肉发展为侵袭性肿瘤，近50%的CRC患者发展为CRLM [21]。如果不进行治疗，大肠癌患者肝转移的中位生存期为只有5-10个月，5年以上生存率小于0.5％[22]。

CRC的分子发病机制与多种基因改变有关，这些基因改变导致原癌基因异常激活和抑癌基因失活[23]。我们通过WES简要描述了CRLM的特点，对癌症发生发展的基因和机制有重要的了解。我们发现1151个snv，主要的突变是APC,喀斯特,TP53（数字1，补充表2)，是根据癌症基因组图谱网络所呈报的数据[24]。目前，与检查点抑制剂相关的生物标志物有数十种，其中TMB、PD-L1、MSI/dMMR等已被III期临床试验验证并广泛应用于临床实践。肿瘤突变负荷(Tumor mutation load, TMB)是一种新的预测PD-1/PD-L1免疫应答的生物标志物[25]。尽管已有研究报道TMB≥20突变/Mb (TMB- h)单独不适用于预测各实体肿瘤类型的免疫治疗效果[26，我们发现CRLM与结肠和直肠之间的TMB有显著差异，但TMB不超过每MB 20个突变(平均值8.34)(图)2和3.)。对于不同类型的癌症，高TMB阈值的设定可能需要更多的临床研究和大量的病人信息的统计。

签名可以被理解为不同的突变过程经常产生突变类型的不同组合。成千上万的体细胞突变可以在单个癌症样品中被识别，从而可以破译突变签名，即使几个突变是手术[27]。C >是一种突变特征，与吸烟和咀嚼烟草有关。提取了6类替代，CRLM和结肠与直肠组之间的突变率没有显著差异(图)4)。肝转移瘤的遗传特征可能与原发肿瘤更相似，治疗策略应与原发肿瘤结直肠癌更相似。

通过路径分析，我们发现代表癌基因喀斯特,PIK3CA,AKT1,PIK3R和肿瘤抑制基因通过表示TP53,APC,EP300,CREBBP,PIK3R1被突变，这可能导致在血管生成，TGF-变化β、Wnt信号通路、notch信号通路等通路(图)6，补充表3.)。途径复杂，主要表现为一个突变基因参与多条途径[28，各种途径也交叉调节，如血管生成和notch信号通路。

5.结论

虽然我们的研究有一定的局限性，如样本量小，缺乏匹配的CRC肝转移样本，但我们的研究发现CRC肝转移中驱动基因突变、TMB和base Ti/Tv比值与直肠癌或结肠癌相比的变化。综上所述，目前的发现有助于确定CRLM的基因组景观，并识别经常改变的特定通路，为针对这些肿瘤的靶向治疗研究提供方向。

数据可用性

所有用于支持本研究结果的相关软件和脚本均可从通信作者处获得。

的利益冲突

该作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

冯刘星、洪师傅、高进对这项工作都有贡献。冯刘星、洪世福、高进、李佳宜设计了这个项目并设计了实验。冯刘星、洪世福、高金进行了实验，并提供了肿瘤标本和临床资料。李佳一处理数据，编写主要手稿。所有的作者都参与了讨论和手稿的准备。

致谢

感谢上海桐树生物科技有限公司的支持。

补充材料

补充表1:患者的临床特征。补充表2:CRLM样品中SNV的数量。补充表3:CRLM通路基因列表。(补充材料)

参考文献

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