文摘
我们RNA-seq Illumina公司执行的平台为7 endometrioid子宫内膜癌患者肿瘤组织和邻近的非癌组织。总共有66个基因差异表达与显著性水平调整值< 0.01。大卫使用基因功能分类工具在美国国立卫生研究院生物信息学资源,5个基因被发现是唯一丰富组织的基因列表。的基因IGSF9被选作进一步鉴定,免疫组织化学染色的大群人类endometrioid癌组织。IGSF9癌症细胞的表达水平显著高于控制腺体细胞配对组织样本来自同一患者( )或在整体比较癌症和控制( )。IGSF9表达较高患者子宫肌层相对于那些没有入侵入侵( )。再分析RNA-seq数据集的癌症基因组图谱显示更高的IGSF9表达在子宫内膜癌与正常控制和表达与预后不良相关。这些结果表明IGSF9作为一种新的生物标志物在子宫内膜癌和值得进一步研究其功能、作用机制和潜在临床效用。
1。介绍
精密医学要求更好的疾病在分子水平表征。作为新一代测序的成本(上天)技术变得越来越便宜,越来越多的努力一直在投资基因组广泛观察癌症的基因变化和基因表达谱。NGS-based RNA-sequencing (RNA-seq)是一种建立和有效的新标志物的筛选方法和更好地理解癌症生物学(1]。全国和国际财团像癌症基因组图谱(TCGA),国际癌症基因组协会(ICGC)生成大量的新数据和新见解关于分子的许多主要景观类型的癌症使用各种高通量分析技术包括RNA-seq [2- - - - - -4]。
子宫子宫内膜癌每年造成大约74000人死亡的女性世界(5,6]。它是最常见的妇科恶性肿瘤在美国和其他西方国家。在组织学亚型,endometrioid癌是最普遍的,占所有患者的75% - -85%。其他类型,如浆液,粘液,透明细胞和鳞状细胞癌,不太常见。根据数据从SEER(监测、流行病学、最终结果)计划在美国国家癌症研究所(https://seer.cancer.gov/),尽管当前的女性子宫内膜癌存活率高达81%,每年死于子宫内膜癌仍然编号超过10000病人仅在美国。此外,在过去的三十年中,子宫内膜癌的年龄调整死亡率一般人群并没有减少。因此,当务之急是更好地描述子宫内膜癌的分子细节使用最新的高通量分析技术来识别新的生物标志物,可能会增强我们对疾病进展的理解和可能影响癌症的临床管理。
最大的努力询问TCGA的子宫内膜癌是转录组(7];TCGA然而初始的综合报告从子宫内膜癌和后续报告,那些关注TCGA的子宫内膜癌RNA-seq数据没有提供transcriptome-wide信息差异表达基因在子宫内膜癌的场景与正常子宫内膜组织(7,8]。另一个努力熊等人研究了子宫内膜癌的转录组的概要文件和相邻的非癌组织,但仅有3例(9]。在当前的研究中,我们筛选成对人类endometrioid癌组织和邻nontumor组织从7病人使用RNA-seq技术和比较他们的基因表达谱。进一步验证是由定量PCR和免疫组织化学。关注过表达基因IGSF9,我们探索其对endometrioid子宫内膜癌临床病理的特点。
2。材料和方法
2.1。人体组织标本
两种不同的方法被用于人体组织标本采购。刚收获,RNA-seq RNAlater-preserved癌症和相邻的非癌组织获得7例通过医学基金会的冰冻切片室(南本德,)。后续的免疫组织化学研究中,formalin-fixed和石蜡包埋(FFPE)块的56例患者获得医疗基金会的手术档案。所有标本收集从2013年到2015年期间通过哈珀癌症研究所组织Biorepository项目。所有收集的人体组织手术切除子宫子宫内膜癌标本病理学家进行的医学基础。病理诊断和分类最初由病理学家值班,进一步审核具备医师资格认证的病理学家。从所有患者知情同意了。协议是圣母大学的机构审查委员会批准(IRB)和当地医院审查委员。
2.2。RNA-Sequencing和数据处理
RNA制备,从每个标本均质~ 30毫克组织使用一个Omni-TH组织均质器(泛光灯国际,肯尼索,GA) prechilled裂解缓冲AllPrep RNA / DNA /蛋白质的迷你包(试剂盒,日耳曼敦,MD)根据制造商的指示。RNA洗脱当时量化Nanodrop分光光度计(热费希尔),并进一步分析了生物分析仪(安捷伦)质量控制。和样品 被用于RNA-seq图书馆准备的巴黎圣母院基因组学的核心设备。RNA-seq图书馆准备nonstranded TruSeq RNA设备从Illumina公司(CA)圣地亚哥和测序HiSeq 4000音序器华大基因研究院(香港)。读取生成paired-end,长度100 - nt。生读被BGI清理SOAPnuke移除适配器和低质量的读取。所有其他命令行软件工具安装和使用在高性能计算机集群圣母大学研究中心的计算。FastQC(0.11.2版)被用来检查阅读质量。没有进一步读修剪或过滤。拼接知道映射工具,明星(版本2.4.2a)用于对齐2-pass模式。由此产生的BAM文件检查Qualimap(2.2版本),然后用于计算读取每个基因htseq-count函数从HTSeq软件(版本0.6.1)。
R / Bioconductor包包括DESeq2被用于基因表达分析(10- - - - - -12]。处理成对样本中,我们使用一个多因素设计包括样本信息通过将感兴趣的条件(癌或癌)的设计。当数据被视为两个独立的团体,只有单因素设计使用。相比之下,我们也下载并重新分析原始RNA-seq数据发布的熊et al。9从SRA (NIH序列读取存档)与我们自己的数据处理协议如上所述。识别最过多生物和基因方面,我们利用基因的分类工具从大卫生物信息学资源6.8 [13)(https://david.ncifcrf.gov)。高分类严格使用。
肿瘤组基因表达和生存数据的访问在癌症基因组图谱(TCGA)项目中,我们使用web界面UALCAN [14),从UALCAN处理数据的一部分。UALCAN TCGA使用三级RNA-seq从33个癌症类型和临床数据。表达水平被规范化为每百万读取记录(TMP)在团体和个人进行比较。
2.3。定量聚合酶链反应
Taqman®基因表达分析被用于定量PCR。的引物和探针IGSF9基因和参考控制基因ACTB都是从生活买技术(CA)卡尔斯巴德。RNA样品制备和互补脱氧核糖核酸合成使用试剂盒试剂和二上标试剂,分别从生活的技术。q-PCR反应是运行在ABI StepOnePlus实时热循环(生命技术)。量化计算ΔΔCt方法使用控制样品和参考基因的表达ACTB为归一化(15]。
2.4。免疫组织化学
免疫组织化学过程是如前所述16]。FFPE组织部分(5μ米厚)是在二甲苯脱蜡,然后水化。热诱导抗原决定基检索了与柠檬酸缓冲(pH值6.0)。主要抗体IGSF9(产品目录号:nbp1 - 93676, 1: 200稀释)和Ki67(产品目录号:ab15580, 1: 500稀释)是从罗福斯买了生物制剂(利特尔顿有限公司)和Abcam (Cambridge, MA),分别。聚合物基发色体可视化系统使用ImmPRESS™合anti-rabbit免疫球蛋白g产品从向量实验室(伯林盖姆,CA)。
2.5。图像分析和量化
所有免疫组织化学幻灯片与数字病理系统进行扫描和分析,包括Aperio ScanScope CS, eSlide经理,和图像分析工具,由徕卡生物系统(芝加哥,伊利诺斯州)。量化的IGSF9宏观由像素计数算法(版本1),该报告的积极彩色像素总数的百分比超过总数的像素进行了分析。核染色细胞量化算法(版本9)被用于制造一个宏计算阳性细胞的肿瘤细胞总数的百分比分析Ki67应用。
2.6。统计分析
Rstudio和相关R包被用来执行所有的下游处理涉及RNA-seq数据的统计分析,临床病理数据,包含IHC结果。显著性水平是设定在值< 0.05,而在筛选从RNA-seq长基因列表,调整值描述的结果。主成分分析用于分析总体RNA-seq数方差。瓦尔德测试时使用的基因差异表达比较DESeq2包中实现。当比较两组在临床和包含IHC,非参数方法Wilcoxon等级测试(也称为Mann-Whitney求和使用测试)。皮尔森相关测试使用的方法实现R和基础心理包中。生存分析使用kaplan meier方法和生存率较。
3所示。结果
3.1。基因表达谱的Endometrioid通过RNA-seq子宫内膜癌和良性邻近组织
RNA-seq总共7执行两个癌症患者组织和邻近良性子宫内膜组织。患者年龄从48到78不等。所有标本来自相同的主要组织学类型,endometrioid子宫内膜癌;两个患者组织学年级我和五年级二世,在临床阶段我(菲戈,2009)。平均1720万从每个读取生产14库。测序读FastQC质量检查,所有phr得分高于20。对齐或映射质量指标由Qualimap BAM的输出文件从符合星5中列出。表1。
而探索基因计数数据,绘制两个组件从主成分分析并没有透露任何聚类趋势(图7癌症样本与7控制1(一))。使用DESeq2作为主要工具,我们试图找到基因在癌症的微分表达式和控制两种不同的方法:(1)利用配对样本中的信息,(2)不考虑搭配信息。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
对于第一种方法,当比较癌与非癌组织控制,共有665个基因(357和308)确认为差异表达的统计显著性水平调整(多重比较)值< 0.05。差异表达基因的完整列表5中给出。表2。在基因列表排名提升调整价值有EGR1、FOSB PTPRT,希利,”丛书,ENPP2, TFPI, ZFP36,和其他人。那些有调整值< 0.01和log2褶皱变化(L2FC) > 2标记在火山情节图1 (b)。TUBB3是最增加(L2FC = 2.177)。在调整截止值< 0.01,我们获得的66个基因(图的列表2),它被用于分析与NIH大卫如下所述。
使用第二种方法,14个样本被视为两个独立的团体,癌症与控制,与配对信息忽略,那么只有4基因被发现在调整差异表达值< 0.05,包括IGSF9, c10orf35,ZNF710基因过表达和HHATL在癌症和控制基因表达下调。这四个基因的归一化计算在数据绘制1 (c)- - - - - -1 (f)和基因在增刊的完整列表。表3。再分析RNA-seq研究熊等人在配对3子宫内膜癌患者癌和正常组织差异表达基因的另一个列表(增刊。表4)[9]。
上述名单的前66个基因的差异表达基因在调整截止值< 0.01,我们进行了分析与基因功能分类工具从NIH大卫17),有能力解决丰富和冗余many-genes-to-many-terms之间的关系,可以降低基因的复杂性。的66个基因,5个基因,也就是说,VSIG2、PTPRT PRTG IGSF9,PTPRF(图3),发现分享功能相似,只形成了丰富集群,0.96的浓缩痛。其中,IGSF9是增加大多数log2折叠。这个结果从基因功能分类分析与大卫+差异表达基因的名单时,我们获得治疗的样品2独立组织促使我们进一步评估IGSF9的表达与免疫组织化学对人类子宫内膜癌组织。
3.2。IGSF9表达在子宫内膜组织和Endometrioid癌
第一个研究IGSF9表达式在老鼠和人类对发育中的神经系统(18];然而到目前为止没有公布的数据详细IGSF9表达在子宫内膜组织。我们第一次执行的微分表达式定量PCR证实IGSF9癌症和癌子宫内膜组织。3配对RNA样本RNA-seq项目相对表达癌组织被发现比相邻的组织(图6折4(一))。IGSF9也是被我们的差异表达基因RNA-seq数据的再分析从熊等。并排比较,我们策划他们的归一化(图4 (b))。
(一)
(b)
(c)
进一步描述IGSF9表达式与癌症的微观特性需要免疫组织化学,我们评估IGSF9 FFPE材料在蛋白质表达水平来自56个病人。正常子宫内膜基质和腺体通常染色负染色较强或弱而endometrioid癌(图4 (c))。膜和胞质染色模式,但不是整个膜,在不均匀的分布在细胞内部,通常集中在染色细胞的一端。某些标本显示点状的和颗粒细胞核周围的染色模式。
3.3。IGSF9表达与临床病理特征的相关性
协会IGSF9表达与患者临床病理的特点,系统的研究在我们收集56子宫内膜癌患者,39 - 94岁,中位数为64。所有患者被诊断为endometrioid癌,在年级我28,28日在组织学分级(表II级1,数据5(一个)- - - - - -5 (b))[19]。随着临床阶段,46名患者在舞台上我,三个阶段II, III期7。肿瘤大小、子宫肌层的深度入侵,肿瘤细胞增殖标记Ki67的标签(数字5 (c)- - - - - -5 (d)),存在与否lymphovascular入侵记录的临床和病理资料。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
IGSF9表达的积极性取决于免疫组织化学(数字5 (e)- - - - - -5 (f))提出了以十进制格式。情况下评估中有八个病人癌症和控制(正常/非癌变)组织。成对比较的相对IGSF9表达式显示显著提高染色在癌症组织相对于控件值为0.448和0.200,分别为(值= 0.008 Wilcoxon测试)(图6(一))。比较所有的癌症组织与8控制的组织表现出类似的趋势(图6 (b))和统计学意义(由Wilcoxon测试值= 0.002)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
趋势在组织学观察IGSF9积极性较高的二级(G2)相对于一级(G1)(图6 (c)),但是结果并不显著。没有发现协会与临床分期和lymphovascular入侵(数字6 (d)和6 (e))。然而,有趣的是,统计上的显著差异时获得比较IGSF9积极性之间的病人没有任何程度的子宫肌层的入侵和子宫肌层的入侵(0.151和0.395;值= 0.013 Wilcoxon测试)(图6 (f))。
IGSF9积极性与其他连续变量的相关性,如年龄、肿瘤大小在厘米,深度的子宫肌层侵犯子宫肌层总厚度的百分比,和Ki67标签索引被绘制在图7。IGSF9表达式与Ki67标记指数有一定的相关性,但不显著。然而肿瘤大小的正相关与子宫肌层浸润深度(系数= 0.412,值= 0.002)和Ki67的子宫肌层浸润深度(系数= 0.360,值= 0.006)都具有统计学意义。
3.4。在RNA-seq数据TCGA IGSF9表达状态
作为硅验证的一种方式,我们调查的表达IGSF9在TCGA RNA-seq UALCAN数据集通过门户网站(14]。截至2017年11月,规范化的RNA表达数据来自33个类型的癌症都是可用的,但并不是所有有适量的正常对照组进行比较。IGSF9子宫内膜癌有较高表达在子宫语料库(UCEC)组织和7其他类型的癌症比相应的正常对照组(表吗2)。相比之下,IGSF9表达较低在直肠癌症与正常控制腺癌和结肠癌腺癌(表2)。
UALCAN包含再生RNA-seq数据从546年35 UCEC组织和正常子宫内膜组织。的,23岁的病人提供了癌症和正常组织。IGSF9mRNA表达被发现在所有癌症与正常控制的比较( Wilcoxon测试)和比较的成对的癌症与正常的患者( 通过Wilcoxon测试)(数据8(一个)和8 (b))。
(一)
(b)
(c)
共有543名患者子宫内膜癌RNA-seq和总体结果数据用于kaplan meier生存分析。过度的IGSF9(前25%)与贫穷有关生存(图8 (c)、生存率较 )。统计上显著的关联IGSF9超表达和糟糕的整体存活率也观察到胸腺瘤,皮肤皮肤的黑色素瘤和脑低级别胶质瘤(表2)。
4所示。讨论
发现组间差异表达基因的标本,RNA-seq是一个非常强大的工具,因为它是高吞吐量和可靠的量化(10,20.]。的基因表达分析RNA-seq, TCGA(的患者数量最大的数据2]。TCGA的报告和数据集是一个丰富的资源评价基因变异或子宫内膜癌的分子标记。根据综合研究体细胞拷贝数变化和外显子组测序,提出了一种新的分子分类系统对子宫内膜癌7]。然而,有限的mRNA表达数据的评价提供了(7,8]。通过设计、原始RNA-seq数据和临床病理的特点在所有TCGA项目研究人员感兴趣的是开放的进一步分析。明显,许多次要TCGA在线资源基于数据集(例如,UALCAN网站)最近出现,大大缓解了这些数据的使用14,21]。TCGA粗捷和他的同事利用数据的报告表明,L1CAM穷人生存的独立预测因子在子宫内膜癌22]。
从正常组织缺乏信息或良性病变RNA-seq TCGA数据从最初的子宫内膜癌出版激起了我们的兴趣和其他人。熊和他的同事使用RNA-seq评估mRNA和microRNA表达谱三个病人与癌症和癌组织(9]。除了mRNA和microRNA表达谱,他们的研究也从RNA-seq遗传变异进行调用数据,这是一个可行的但不建立方法(23]。
在当前的研究中,我们与配对RNA-seq癌症和控制组织从7 endometrioid癌患者发现一组独特的差异表达基因。例如,我们再分析熊的数据确定WISP2 (CCN5)(log2褶皱变化−7.12;增刊。表4)作为一个高度差异表达基因。据报道是一种肿瘤抑制;的不足WISP2促进乳腺癌生长(24),WISP2RNA表达减少79%的人类结肠癌(25),但没有研究WISP2已报告在子宫内膜癌。的TUBB3基因是最增加基因的基因列表(图1 (b)从我们自己的病人资料)。TUBB3第三类进行编码β微管蛋白和超表达与耐紫杉醇与穷人生存在卵巢癌,乳腺癌、胃,非小细胞肺癌和未知原发肿瘤(26,27]。这一发现是没有证实子宫内膜癌和第三类β微管蛋白表达与临床病理的特点也没有相关(27,28]。
面临着长串的差异表达基因,工具功能分析常用于从这些数据中提取生物意义。RNA-seq具体分析包GOseq和SeqGSEA是可用的(29日]。我们使用的基因功能分类工具在美国国立卫生研究院大卫包和我们提供的66个基因只有一个集群的基因,和我们的配对样本看成两个独立的团体进一步缩小了基因列表。作为IGSF9是唯一共同的基因分析,我们专注于IGSF9和探索协会IGSF9蛋白表达与临床病理的特点endometrioid子宫内膜癌。
IGSF9首次克隆和特征表达的免疫球蛋白超家族的成员在各种各样的组织在人类和小鼠18]。从结构上讲,它包含五个搞笑领域,两个纤连蛋白三世域,一个跨膜域,一个细胞内的c端,它被发现在大脑中与树突分枝[30.]。到目前为止,没有IGSF9报告发表在任何类型的癌组织。现有研究IGSF9非常有限(10篇论文在PubMed截至2018年1月)。我们的研究是第一个调查与癌症协会的表达,但其表达和突变概要文件可以通过搜索在线数据库评估,如人类蛋白质图谱计划(http://www.proteinatlas.org),GTEx (https://GTExPortal.org),体细胞突变在癌症的目录(宇宙,http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)。
表达模式揭示了我们在endometrioid癌的免疫组织化学分析证实了IGSF9定位在细胞膜和细胞质。我们确认的微分表达式IGSF9癌症和癌组织与材料从一群56患者。IGSF9较高的表达在癌症比正常或良性子宫内膜组织。IGSF9的积极性也更高的癌症与子宫肌层比那些没有入侵,可能癌症侵犯的一个指标。然而,随着这些观察是基于小和回顾性队列的患者,在较大的和潜在人群需要进一步的研究。TCGA表达式的分析数据与UALCAN我们调查提供了必要的支持。这些数据证实,IGSF9是在癌细胞与正常子宫内膜组织以及7其他主要的癌症类型。有趣的是我们在结直肠癌观察到相反的关系,其中IGSF9下级表达在癌症与正常,建议进一步研究主题。
当前研究的一个限制是我们缺乏生存数据为我们本地的56个病人。然而,通过UALCAN TCGA公开RNA-seq数据的分析提供了进一步支持我们最初的发现,使生存分析。过度的IGSF9在子宫内膜癌预后不良的指标。此外,IGSF9超表达也与不良预后相关的其他几个癌症类型,包括大脑低级别胶质瘤,皮肤皮肤的黑色素瘤,胸腺瘤,暗示的意义IGSF9在癌症病理可能不限于子宫内膜癌。
5。结论
我们确定了通过RNA-seq中差异表达基因的列表endometrioid子宫内膜癌与非癌控制。专注于IGSF9粘附分子,没有与癌症有关的病理特征,我们证实IGSF9的过度表达在子宫内膜癌,发现了一个与子宫肌层的入侵和糟糕的结果。这些研究提供初步支持考虑IGSF9作为一种新的生物标志物在诊断子宫内膜癌与潜在效用,预测和治疗。进一步研究IGSF9癌症病理的作用是必要的。
缩写
| IGSF9: | 免疫球蛋白超家族9 |
| 门店: | 新一代测序 |
| RNA-seq: | RNA-sequencing |
| 预言家: | 监测、流行病学、最终结果 |
| ICGC: | 国际癌症基因组协会 |
| TCGA: | 癌症基因组图谱 |
| FFPE: | Formalin-fixed和石蜡包埋 |
| 包含IHC: | 免疫组织化学 |
| Q-PCR: | 定量聚合酶链反应 |
| 宇宙: | 目录的体细胞突变在癌症。 |
伦理批准
协议是圣母大学的机构审查委员会批准(IRB)。
同意
从所有患者知情同意了。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Zonggao史、李小君和m .沙龙堆栈构思,设计,和管理该项目。李春燕,Zonggao史,和劳拉Tarwater进行样本采集、核酸提取、q-PCR,免疫组织化学。威廉•Kaliney春燕李,Zonggao施做病理检查。Zonggao Shi,春燕Li Yang Li m .沙龙堆栈,李小君,沾光s Chandrashekar数据收集和分析。Zonggao史和m .沙龙堆栈写的手稿。所有作者参与的修订手稿提交和批准。
确认
作者感谢以下个人和附属机构的慷慨的帮助:玛吉李首次数据收集和分析;基因组学核心设施RNA-seq圣母大学的图书馆准备和测序合同协调;黛安娜以挪士和清丽博士从TMF FFPE块检索。这项研究是由沃尔特癌症基金会(m .沙龙堆栈)。
补充材料
补充1。补充表 :质量控制和校准结果。
补充2。补充表 :差异表达基因配对组织。
补充3。补充表 :作为独立组织的差异表达基因。
补充4。补充表 :差异表达基因重新分析数据,熊等。