的频率bcr - abl叙利亚CML患者的记录类型

文摘

背景。在叙利亚,CML患者开始酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和监控,直到完成分子反应。bcr - abl信使rna转录类型不经常发现,相反的建议。在这项研究中我们旨在识别不同的频率bcr - abl成绩单在叙利亚CML患者并强调意义监测和治疗方案。方法。CML患者阳性bcr - abl成绩单由定量rt - pcr被录取。bcr - abl记录类型进行了使用自制的PCR方法是改编自出版协议和优化。记录类型被证实使用商用研究工具。结果。24记录中发现了21个病人。b2a2最常见,其次是b3a2, b3a3,和e1a3仅仅在12个(57.1%),3例(14.3%),2例(9.5%),1例(4.8%),分别为。三个样品(14.3%)包含双记录。虽然b3a2成绩单显然与警告伊马替尼治疗,分子反应b2a2,否则b3a3,集体e1a3成绩单证明()。结论。识别可能是明智的bcr - abl记录类型在CML患者诊断,使用一个实际验证方法,以链接检测记录与临床发现,可能抵抗治疗,和合适的监测方法。

1。介绍

费城(Ph)染色体(衍生染色体22),造成之间的易位染色体9日和22日是第一个针对疾病的染色体异常与恶性肿瘤相关,也就是说,慢性粒细胞白血病(CML) [1]。细胞遗传学和分子方法的发展导致鉴定的基因参与了t (9;22)断点,ABL1和BCR,分别。这两个基因导致的加入bcr - abl融合致癌基因转录成一个混合的信使核糖核酸(mRNA) [2,3]。这个信使rna是翻译成一个嵌合蛋白本构酪氨酸激酶活性,激活细胞周期相关通路和诱发的恶性增殖CML的慢性阶段。酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)合理设计针对这种融合蛋白及其酶行动特别块,导致高频CML患者的缓解和更好的存活率(4,5]。

由于这种层次的因果关系,嵌合的结构bcr - abl信使rna将根据断点在相应的不同基因,随后也会由此产生的蛋白质的结构。内的断点ABL1在第二个外显子基因几乎总是(a2),而的断点BCR基因变化之间的不同病人和恶性肿瘤,可以本地化的三个地区之一,专业BCR(M -bcr),小BCR(m -bcr),微BCR(μ- - - - - -bcr)[3]。在CML的大多数情况下,bcr - abl在M -融合结包含一个断点bcr地区外显子e13 (b2)或外显子e14灯头(b3)和癌基因翻译成两个210 kda蛋白质(p210之一^{bcr - abl})25个氨基酸根据不同外显子。e13和e14灯头可以看到融合连接在同一病人通常由于可变剪接。一些CML患者bcr - abl连接在m -包含断点bcr地区外显子e1和致癌基因翻译成蛋白质(p190 190 kda^{bcr - abl})。很少,患者表现为bcr - abl致癌基因内包含一个断点μ- - - - - -bcr地区外显子e19产生230 kda酪氨酸激酶()[6]。

因此,bcr - abl融合基因和其相应的mRNA转录和蛋白质形式已经被一些研究的主题和患者之间的显著差异被发现b2a2, b3a2,少见的成绩单,或结合两个或两个以上的记录关于白血病的临床方面和发展以及对治疗的反应(7- - - - - -11]。人口也显示不同比例的两种最常见的成绩单b2a2 b3a2,和罕见的成绩单CML患者(12- - - - - -24),指出患者罕见的成绩单是另一个挑战的分子诊断和监测自成绩单可能检测不到的定量逆转录聚合酶链反应(存在)监测化验,因此产生假阴性的结果(25]。

在叙利亚,染色体显带在CML患者的诊断确认执行Ph值+状态;他们开始在第一行TKI甲磺酸伊马替尼,然后每个月监测血液。也进一步监测患者细胞遗传学的每六个月,直到完全细胞遗传学反应(CCyR)实现或使用中存在分子,根据血液学家的偏好。如果细胞遗传学的监控病人达到CCyR,监控每半年地使用中存在微小残留病的检测。在抵抗治疗的情况下,高剂量的甲磺酸伊马替尼或不同TKI管理和病人监控使用相同的协议。与当前的建议(26),bcr - abl通常mRNA转录类型是不确定的。在这项研究中我们旨在识别不同的频率bcr - abl成绩单在叙利亚CML患者和强调对病人护理的意义为了达成更好的监控方法和治疗。

2。材料和方法

病人诊断为Ph值+ CML至少一年,称阿萨德医院之前,大马士革大学,定期监测的t (9;22)中存在后被招募了2012年1月至2014年11月获得批准,大马士革大学伦理委员会和知情同意。3毫升的全血被撤回从每个病人EDTA。总RNA提取,存在使用高纯RNA进行了隔离设备和LightCycler-t (9;22)量化工具(罗氏诊断、德国),分别根据制造商的指示。合成rna和互补dna质量评估使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(美国NanoDrop Technologies, Inc .)。有效的coamplificationGlucose-6-Phosphate脱氢酶(G6PDH)看家基因的互补也认为评估RNA提取的质量和效率的互补脱氧核糖核酸的合成。互补脱氧核糖核酸阳性样本bcr - abl成绩单是完全包含在我们的下游分析,imatinib-treated患者bcr - abl记录相对含量≤0.1%被归类为一个主要的分子响应(MMR)组(27]。

自制方法调查bcr - abl记录类型包括各种底漆组合:ABL-a2 M-BCR, M-BCR和/或μbcr [15,20.,24](TIB MOLBIOL、德国;表1)。引物序列被验证使用爆炸NCBI核苷酸(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。5日pcr进行了优化μL积极控制用0.1,0.25,0.5,或1μ米的每个引物;1、2、3或4毫米MgCl₂;200年μM核苷酸;1.25 U AmpliTaq®黄金DNA聚合酶(美国应用生物系统公司)在最后一卷50μl .热循环启动MasterCycler®Pro年代(埃普多夫,德国)酶激活在95°C 5分钟,其次是45周期在95°C的变性15秒,退火在50°C, 55°C, 56°C, 58°C,或60°C 15秒,在72°C 2分钟和扩展,最终在72°C扩展了7分钟。然后采用调查为催化剂的最佳反应条件bcr - abl互补脱氧核糖核酸样品记录类型。PCR产品在2.5%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色。

互补脱氧核糖核酸样品也进行确认测试bcr - abl记录类型使用Seeplex®白血病BCR / ABL研究工具(Seegene说,韩国)根据制造商的指示。

确切概率法被用来研究的独立性bcr - abl记录类型患者人群使用GraphPad QuickCalcs软件(http://graphpad.com/quickcalcs/)。值< 0.05被认为是显著的。

3所示。结果

22患者阳性bcr - abl由中存在记录,包括九imatinib-treated患者达到MMR,七imatinib-treated病人没有达到MMR,六不合规的病人在抽样之前停顿了一下伊马替尼至少1.5年。在所有治疗伊马替尼治疗的病人是我们研究发起了至少一年时间。

自制方法的优化过程中,PCR产品只有放大使用ABL-a2 / M-BCR引物组合,相反ABL-a2 / M-BCR ABL-a2 /μbcr和ABL-a2 / M-BCR / M-BCR /μbcr引物组合。然而,最优的反应条件MgCl ABL-a2 / M-BCR底漆组合(4毫米₂,0.25μM每个引物退火温度55°C)产生一个微弱的乐队只有10的22个样本。

使用Seeplex白血病BCR / ABL研究装备,一个记录在M -一个断点bcr地区,一个记录在m -一个断点bcr地区,双成绩单与M -一个断点bcr地区,和双成绩单在M -一个断点bcr在m -地区其他bcr地区被确定在十七岁,一个,两个,和一个病人,分别;这相当于总共24成绩单。PCR中遇到失败是22个样本之一。最常见的成绩单是b2a2,其次是b3a2, b3a3,和e1a3仅仅在12个(57.1%),3例(14.3%),2例(9.5%),和1(4.8%)的21个病人,分别。三个(14.3%)样品含有双成绩单显示三种不同组合的b2a2 / b3a2 b3a2 / b3a3, b2a2 / e1a3。

表2演示的分布bcr - abl记录类型imatinib-treated患者根据其分子反应以及不合规的病人。被更频繁地观察到在病人没有达到MMR b3a2bcr - abl记录类型显然是相关的预警分子对伊马替尼治疗()。相反,b2a2、b3a3 e1a3bcr - abl记录类型没有显著相关的分子响应伊马替尼治疗()。

4所示。讨论

bcr - abl信使rna转录类型研究工具是相对昂贵的检测和可能缺乏能够检测未知的成绩单。这使我们调查更多的经济全面自制的常规PCR方法集成到常规监控协议。类型的十个检测记录用我们自制的方法与研究工具的结果是一致的;然而,PCR失败是经常遇到失去58%的预期记录在我们已知的阳性样本。微弱的M -bcr断点反应产物以及m -的故障bcr断点反应和M -bcr/ m -bcr/μ- - - - - -bcr复合反应可以归因于底漆损耗的反应混合,引物二聚体带的出现证明了这一点。这些令人失望的结果是尽管我们仔细选择和彻底优化引物出版。尽管先前所描述的几个研究小组(15,20.,24从早期的工作]适应他们2),这表明再现性,这些引物证明并非如此。自发表可能不可靠的可再生的方法,实证验证集成到常规使用之前是至关重要的。

结果使用的研究工具与存在的一致bcr - abl成绩单积极性,PCR失败只显示22个样本之一。尽管存在量化的、低层次的记录类型有限,可能已经错过了常规PCR的灵敏度。然而,装备有识别力的显示国米,intrasample记录类型的变化。显然,b2a2bcr - abl记录占三分之二的多数都记录在叙利亚发现CML患者,而四分之一的病人表示b3a2成绩单完全或除了另一个成绩单。这正好与之前估计患病率在其他国家b2a2成绩单是最常见的12- - - - - -15),但与其他报告b3a2成绩单是最普遍的16- - - - - -24]。似乎每个的频率bcr - abl成绩单,是否常见或罕见,患者的百分比显示coexpression不同记录的不同区域之间差别很大。

尽管我们小样本大小,本研究证明一个明显b3a2之间的关联bcr - abl成绩单和一个贫穷的结果。与先前的研究表明这种他b3a2比b2a2成绩单与预后差相关记录。四分之一的患者b3a2成绩单因此应该更加严格和频繁的监测,在二线TKIs可能建议克服潜在的阻力。虽然并没有很显著的关联性与MMR伊马替尼治疗,据说由于小样本大小,b2a2, b3a3, e1a3成绩单是集体与MMR有关。这是强调通过之前报道的证据更好的预后与这样的成绩单(7,25,27]。

四分之一的患者罕见b3a3和e1a3记录代表一个挑战的分子诊断和监测自成绩单可能检测不到的许多商用和经常利用中存在化验(25]。研究工具我们用于存在足够的量化检测记录,但其他产品可能没有这种多功能性。因此,诊断方法只能检测两种最常见的成绩单b2a2和b3a2将错过量化五分之一的记录出现在我们的病人,产生误导的结果。因此,它可能是必须确定每个CML患者记录的类型和选择合适的监控协议,众所周知,检测记录类型标识,以避免随后的假阴性结果中存在。

5。结论

总之,我们建议识别bcr - abl记录类型在每个CML患者诊断和细胞遗传学研究中,使用可靠的可再生的和实际验证方法。我们提出一个商用设备像本研究中使用的一个或更成功自制的PCR方法利用不同的引物。连接的检测记录病人的临床表现,可能抵抗第一行治疗,和适当的监测方法最终可能有助于建立更有效的治疗方案基于普遍的疾病表型在我们的人口。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Sulaf Farhat-Maghribi和Fawza Monem设计研究。Sulaf Farhat-Maghribi和瓦Habbal进行了分子生物学的研究。瓦法Habbal Sulaf Farhat-Maghribi, Fawza Monem分析数据。Sulaf Farhat-Maghribi起草。瓦法Habbal和Fawza Monem修订。所有作者阅读和批准了期末论文。

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