甜菜碱和/或c -藻青素对肺癌A549细胞生长影响的研究在体外和在活的有机体内

摘要

我们研究了甜菜碱、c -藻青素(C-PC)及其联合应用对A549肺癌生长的影响体外和体内。当细胞与甜菜碱和C-PC共孵育时，观察到高达60%的存活率下降，这与甜菜碱（50%）或C-PC单独处理（无下降）相比是显著的。联合处理减少了NF的刺激-κb表达tnf-α增加促凋亡p38 MAPK的数量。有趣的是，联合治疗可诱导G细胞周期阻滞₂/M期为~60%的细胞。在活的有机体内在右侧注射A549细胞的无病原体雄性裸鼠身上进行研究。他们的日常食物中添加甜菜碱、C-PC或两者都添加，或两者都不添加。与对照组相比，甜菜碱或C-PC治疗组的肿瘤重量和体积均显著减少，并且没有额外的减少该数据表明，C-PC和甜菜碱单独可有效抑制大鼠肿瘤生长。观察到甜菜碱和C-PC对A549细胞生长的协同作用体外有待进一步确认体内。他们相互作用的本质背后的原因还有待探索。

1.介绍

肺癌导致全球28%的癌症相关死亡和15%的诊断癌症[1]．它可以细分为两大类，小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，后者是最常见的类型[2]．NSCLC的治疗包括手术，放射治疗，酪氨酸激酶抑制剂，免疫疗法和基于铂类化疗[3.]．就化疗而言，天然植物产品似乎发挥着重要作用，大约60%的可用化疗癌症药物都是由天然植物产品贡献的[4]．

癌症的发展和进展涉及DNA甲基化的异常变化，导致某些原癌基因(如c-Myc)的激活，以及某些肿瘤抑制因子(如p16)的失活[5]．似乎某些膳食成分通过DNA甲基化影响致癌的过程。事实上，已经显示叶酸，作为甲基供体，和核黄素，维生素B.₆，以及维生素B₁₂，作为单碳代谢的辅助因子，与DNA合成和甲基化有关，因此，可能在致癌和癌症风险中发挥作用;DNA整体低甲基化与肺癌有关[6，7]．甜菜碱(B)是另一种主要的甲基供体[8，维持正常的DNA甲基化模式[9]．它自然存在于多种食物中，包括甜菜、麦麸、菠菜、虾和其他许多食物[10]．人类也从膳食中的胆碱中获得甜菜碱，因为肝脏和肾脏能够通过两步酶依赖反应将胆碱氧化成甜菜碱[10，11]．甜菜碱参与了蛋氨酸的合成，蛋氨酸是细胞半胱氨酸的主要供应商，通过硫转化途径合成还原型谷胱甘肽，保护细胞免受活性氧的侵害[12]．它在胆碱介导的单碳代谢、细胞膜结构完整性和信号传导功能以及神经递质合成中发挥着核心作用。甜菜碱每天摄入9-15克是安全的[12]．亚急性和亚慢性大鼠研究确定，在研究的所有剂量(饮食的0-5%)甜菜碱都是无毒的[13]．甜菜碱与乳腺癌风险呈负相关[14]，鼻咽癌[15，以及结直肠癌[16也能降低患肺癌的风险[8]．此外，补充甜菜碱似乎可以减轻氧化应激[17]，并通过NF-具有抗炎作用κB调节和抗血管生成作用[18]一些文章表明甜菜碱能够抑制癌细胞的生长体外［19，20.通过稳定原癌基因和肿瘤抑制基因的甲基化模式来调节它们的表达[5]．Kim等人[21最近也有报道称甜菜碱的作用与NF-的抑制有关κB和Akt信号通路体外和在活的有机体内．

在活的有机体内， Basaran-Küçükgergin等人也发现氧化应激标志物(硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)、丙二醛(MDA)、共轭二烯、羰基蛋白和硝基酪氨酸)降低。[22]在6周龄甜菜碱补充（含量的2.5％）。在肝癌中，通过限制抗氧化酶（谷胱甘肽二硫化物还原酶，谷胱甘肽过氧化物酶，过氧化物酶，过氧化物酶和超氧化物歧化酶和超氧化物歧化酶），通过消除TBAR浓度的增加，并通过消除TBAR浓度的增加以及通过减少促炎和凋亡调解员[23]．

除了甜菜碱，藻蓝蛋白(C-PC)是一种来自藻蓝蛋白家族的蛋白质，其特征是其呈深蓝色，其结构由一种称为藻蓝蛋白的蛋白质和非蛋白成分组成。由于富含蛋白质、脂类、维生素、矿物质、叶绿素、β-胡萝卜素、多糖含量。C-PC可以安全地添加到食品、化妆品和药品中，越来越多的研究证实C-PC具有多种生物活性，如抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗病毒活性、免疫刺激、肝保护、抗血小板、神经保护特性和清除自由基[24，25]．根据来源不同，C-PC分为三大类:C-PC(来自蓝藻)、R-PC(来自红藻)和r - pci(来自蓝藻)聚球藻属物种)[26]．

C-PC似乎抑制了海拉细胞的生长体外，以剂量依赖的方式防止DNA复制[27]．C-PC可能诱导结肠癌细胞SW480和喉癌细胞HEP-2凋亡，但其机制尚不清楚[28，29]李等人[30.]已经报道C-PC是一种理想的癌症预防药物，因为它可能抑制癌细胞的生长在活的有机体内和体外．因此，C-PC在未来可能成为高毒性常规化疗抗癌药物的良好替代品[31]．

据我们所知，目前还没有研究表明甜菜碱和C-PC对A549细胞(来源于肺腺癌的人肺上皮细胞)的生长、细胞周期分布或凋亡的影响体外和在活的有机体内的方法。因此，我们研究了甜菜碱和C-PC单独或联合处理是否会通过降低细胞活力对A549细胞株的生长产生抑制作用，以及这种处理是否会对炎性NF-产生影响κB通路。其次，我们想评估C-PC与甜菜碱的结合是否会影响p38 MAPK通路或细胞周期，正如之前对每个化合物分别进行的研究所报道的那样[18，32，33]最后，我们评估了甜菜碱和C-PC对A549肿瘤生长的影响在活的有机体内口服补充裸鼠4周后(在注射A549细胞和肿瘤建立后)。

2.材料和方法

2．1.在体外学习

2．1．1．治疗物质

C-PC来自美国platensis(来自Greentech SA, Clermont-Ferrand的礼物)粉末储存在4°C避光下。甜菜碱(B2754, Sigma-Aldrich)和C-PC原液在磷酸盐缓冲盐水(PBS) (Sigma-Aldrich)中制备，通过0.2μM孔过滤器，在无菌环境下操作。10%的甜菜碱原液(840 mM)保存在4℃，而C- pc原液保存在−20℃，避光保存。

2.1.2。细胞培养

A549 (ECACC细胞系)和A549/NF-κB-Luc (Panomics (ref RC0002))细胞系(带NF-的A549细胞系κ人非小细胞肺腺癌荧光素酶B诱导启动子)在Dulbecco 's Modified Eagle培养基(Sigma- aldrich)中培养，添加10%胎牛血清(FCS) (PAA实验室)，1%谷氨酰胺(Gibco)和1%青霉素/链霉素(Sigma)，在+37℃，5% CO₂的气氛。

2.1.3。样品制备

细胞（10⁴96孔板细胞/孔，用于细胞活力测定，6·10⁴24孔板上的细胞/孔，用于所有其他分析，2·10⁵细胞/T25瓶，或用于细胞周期分析和western blot的6孔板)分别接种于100、400、5000和3000μl分别和培养过夜。然后将培养基除去，并将不同的浓度和C-PC和甜菜碱溶液的组合加入细胞中，并在5％CO中孵育24小时和48小时+ 37℃₂的气氛。

2.1.4。细胞生存能力分析

在甜菜碱和/或C-PC处理后，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化铵(MTT;20μL/5 mg·mL⁻¹将PBS中的溶液添加到每个含有100%溶液的孔中 μL的媒介。然后细胞在+37°C孵育4 h [34]．以酸性异丙醇为增溶剂，将MTT转化为福马赞。用Victor分光光度计(Victor 3V Multilabel Plate Reader, Perkin-Elmer)在562 nm处测量吸光度。

2.1.5节讨论。免疫印迹

细胞清洗3次，持续5天 冷PBS时的最小值；50 μ每孔中加入RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich)和磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)。将培养皿在+4°C下摇匀30分钟。洗涤细胞，两孔内容物混合并离心(10 min, 3000 ×g, 4℃)。上清保存在−20℃。在分析当天，样品被解冻;大约20μg的每个样品(蛋白定量试剂盒- bc测定，Interchim, Montluçon Cedex，法国)用Laemmli 5x(10分钟，85°C)变性，加载在12%聚丙烯酰胺凝胶上，并在130 V (SDS-PAGE)下迁移(Mini-PROTEAN®Tetra Cell Systems, Bio-Rad)。在90 V (Bio-Rad PowerPac HC Power)下转移到硝化纤维素膜上80分钟。转移后，在TBST (Tween 20的三缓冲盐水)中洗涤一次，并在TBST中5%的牛血清白蛋白(BSA) (Sigma)溶液中封闭1小时。用TBST洗涤3次，共5 min，用5% BSA溶液稀释一抗，4℃搅拌过夜。孵育后，在TBST中洗3次5分钟，然后在室温下与辣根过氧化物酶(HRP)偶联二抗在TBST中1%的脱水牛奶溶液中孵育1小时。然后在TBST和TBS中分别洗涤3次5 min和2次。3 mL ECL™将Prime Western Blotting System (Sigma-Aldrich)加入到膜中并孵育5分钟。这些印迹由ChemiDoc可视化™XRS+系统与图像实验室™软件(Bio-Rad)。p38 MAPK显示后，用内部去杂交缓冲液孵育两次10分钟，用PBS孵育两次10分钟，用TBST孵育两次5分钟，之后，从膜的阻塞重新启动方案，以最终检测β-actin(与一抗在+4°C孵育6h)。

在与p38 MAPK相同的膜上检测到肌动蛋白条带。利用Image J软件对信号进行量化。主要使用的抗体为p38 MAPK兔抗人多克隆抗体(ADI-KAS-MA009-E, Enzo Life Sciences) 1:500和beta-actin兔抗人多克隆抗体(PA1-183, Thermo Scientific) 1/1000。使用的二抗为山羊抗兔IgG (H+L)， HRP结合物(#32460,Thermo Scientific) 1/1000。

2.1.6。RLU(相对光单位)测量

A549 / NF -κ用甜菜碱和/或C-PC处理24小时的B-Luc细胞用PBS (Sigma-Aldrich)冲洗三次，并将不含胎牛血清的DMEM与人TNF一起加入α(Miltenyi Biotec)最终浓度为25 ng·mL⁻¹作为NF-的电感κB通路。孵育9 h后，细胞在PBS中洗涤一次，胰酶化，与完全培养基混合，在1500 ×g离心7分钟，干燥的颗粒在−80°C保存，直到分析当天。样品解冻后用500洗涤μL PBS (5 min, 1500 ×g)。小球在300毫升重悬μL细胞培养裂解液(Promega)与TritonX-100，涡旋30 s，室温孵育10 min。3000 ×g, 60离心10分钟μ取上清液L放入冰封的光度计管中，取100μ每管加入含有10 mM ATP的L型裂解缓冲液混合物。使用发光仪(LUMAT LB 9507)测量荧光素酶活性，使用BCA蛋白检测试剂盒(protein quantitative kit - bc assays, Interchim, Montluçon Cedex，法国)归一化至总细胞蛋白，并以每mg蛋白的相对光单位(RLU)表达。

2.1.7。细胞周期分析

G组A549同步₁剥夺FBS后的第二阶段，随后胸腺嘧啶核苷抑制DNA合成。细胞首先孵育24小时 在无FBS的DMEM中为h，其次为24 在完全培养基中加入5 在这一点上，细胞在G₁然后与C-PC和/或甜菜碱孵育。24 h后，用胰蛋白酶收集细胞，从每种条件中取等量的细胞离心(5 min 3000 ×g)，小球在300中轻轻重悬μL PBS，与700μL预冷100%乙醇，轻轻倒转试管，在−20°C保存。分析当天，细胞成球(10 min, 5000 ×g)，去除乙醇，500μL PBS加20μ碘化丙啶(50 mg·mL⁻¹1 .詹妮弗?劳伦斯μ100 mg·mL⁻¹)，添加0.01% TritonX-100。悬浮液转移到FACS管(Falcon)中，在室温避光孵育30分钟。采用流式细胞仪(Becton Dickinson FACSort)对样品进行分析。

２.２.在活的有机体内研究:肿瘤大鼠模型

2.2.1。细胞培养

A549细胞(ATCC®CCL185™在DMEM环境下，10%胎牛血清(FBS)， 5 mM l -谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素培养。A549细胞被培养到80%的汇合。注射时，A549细胞悬浮在基质中(50:50)。

2.２.２.研究设计

对于本研究，共有三十四个无病原体雄性裸鼠（Charles River，France），重量为239.8±6克。所有的动物工作程序都被制度动物护理和Maisons-Atfort（法国）的使用委员会批准。

在开始研究之前将动物适应一周。每日光循环从上午7点到下午7点延伸到下午7点。和室温保持在21.6±0.5℃。在整个研究中，允许大鼠消耗食物和水域。食物含有4％的蛋白质和3.9％的脂肪，其余的碳水化合物（A03，社会安全饮食，Augy，France）。大鼠被居住在各个笼子里。

驯化后,10⁷大鼠右侧皮下注射A549细胞。

肿瘤植入后10天，一次平均肿瘤体积（MTV）达到500 嗯^3.，所有动物都被随机分配给不合控对照组（；MTV: 568.8±98.9 mm^3.)、甜菜碱治疗组(；MTV：568.5±133.8毫米^3.)、C-PC治疗组(; 597.0 ± 136.4 嗯^3.)，甜菜碱+ C-PC治疗组(；MTV: 703.4±111.3 mm^3.)．

2.2.3。甜菜碱治疗

在饮用水中添加甜菜碱，占日摄食量的4%(2.93±0.3 g / kg体重)。每两天根据每只大鼠的食物和水摄入量调整甜菜碱的补充量。对每只大鼠每日的食物、水和甜菜碱摄入量进行评估。

2.2.4。C-PC治疗

C-PC处理在饮用水中进行，对应370.0±0.03 mg / kg体重。根据每只大鼠的食物和水摄入量，每两天调整一次C-PC补充。对每只大鼠每日的食物、水和C-PC摄入量进行评估。

2.2.5。C-PC和甜菜碱治疗

在饮用水中添加甜菜碱和C-PC，甜菜碱占日摄食量的4%，藻青素为370.0±0.03 mg / kg体重。对每只大鼠每日的食物、水、甜菜碱和C-PC摄入量进行评估。

2.2.6。肿瘤生长评价

每周两次用外卡钳测量肿瘤生长(肿瘤的长度、宽度和体积)。肿瘤体积计算公式如下:=长×宽²/ 2。每组的平均肿瘤体积(MTV)被估计并在图中给出。记录每只单独识别的大鼠的肿瘤生长数据。

观察期28 d。如果在此期间肿瘤体积达到4000毫米，则对所有实验动物实施安乐死^3.，根据机构指导方针的要求。

第29天，将大鼠从笼子中移出，带到相邻的房间，并在移出笼子30秒内使用麻醉剂(氯胺酮:75 mg·kg)实施安乐死⁻¹+ Xylazine: 8 mg·kg⁻¹)和主动脉穿刺。在安乐死后，肿瘤立即被切除，称重，并迅速在液氮中冷冻并保存在−80°C。

3.统计分析

的所有统计检验在活的有机体内实验使用统计软件包程序SPSS 19 (SPSS Inc.， Chicago, IL)进行。所有值均表示为平均值±SE。

非参数分析（Kruskall-Wallis检验和Mann-Whitney(检验)用于肿瘤体重、肿瘤生长、食物摄入和体重的统计计算。

组间差异有统计学意义体外研究由两组学生评估以及()或重复测量单因素方差分析，然后进行Tukey的后测(GraphPad Prism, San Diego, California, USA)。在以下情况下，差异被认为具有统计学意义．

4.结果

4.1。在体外学习

4.1.1。A549细胞的可生存能力

将A549细胞用甜菜碱、C-PC和这两种物质的组合处理48小时，然后通过MTT法评价其活力。经过48 h的观察，4%的甜菜碱处理效果最好，可使细胞活力降低50%，因此我们选择此处理进行进一步应用。在任何剂量或时间依赖性下，单独使用测试浓度的C-PC治疗均未产生显著的生存能力下降。与此相反，4%的甜菜碱与不同浓度的C-PC混合后，其活力又降低了10-20%(图)1)．图中未显示的C-PC浓度也观察到了同样的效果(数据未显示)。

4.1.2。C-PC和甜菜碱对炎症NF-的影响κB通路

研究甜菜碱和C-PC的影响及其对NF的影响κB通路在肺癌中的作用，我们使用了A549/NF-κB-LUC细胞(图2)．在这些细胞中，荧光素酶的表达是由NF-诱导的κB启动子通过激活NF-κB通路。作为NF-的阳性对照和诱导剂κB启动子活化，A549/NF-κ用25 ng·mL处理B-LUC细胞⁻¹肿瘤坏死因子α9 h。

当首先用C-PC和/或甜菜碱处理细胞24小时，然后用TNF进一步温育9小时α，用4％甜菜碱的治疗似乎升高了NF-的活化κB. C-PC单独治疗没有任何显著效果，但显著降低()的激活，只有当细胞处理两20μ克·升⁻¹C-PC和4%的甜菜碱(图2)．

4.1.3。C-PC和Betaine对P38 MAPK的影响

Western blot检测p38 MAPK在4%甜菜碱和/或20的A549细胞中表达μ克·升⁻¹C-PC。通过测量24h和48h后的总p38 MAPK含量，并将其归一化，来评估p38 MAPK的表达β肌动蛋白。根据各自的对照，处理的值用相对密度表示。

孵育24 h后，任何治疗组均无显著差异(图)3（b）-条件B，灰色条)。另一方面，在48 h后，在所有条件下都可以看到表达增加。虽然单独使用甜菜碱和单独使用C-PC处理增加了1.5倍，这是轻微但不显著的，但两者联合使用时，p38 MAPK总表达量增加了约2.5倍(图)3（b）-condition B + C-PC黑条)。这种增加与24 h B + C-PC处理和48 h对照MAPK表达都有显著关系。

4.1.4。细胞周期分析

为了研究C-PC和甜菜碱及其联合作用对细胞周期的影响，在G₀/ G₁通过血清剥夺循环，然后进行胸苷过量（图4)．用碘化丙啶测定DNA含量，用流式细胞仪监测细胞周期分布。

异步A549显示细胞在不同细胞周期阶段的标准分布，其中G₀/ G₁最丰富(56.42%)，分布大致均匀₂/M相(分别为21.77%和20.92%)(图4(一)异步交流)。同步协议导致91%的细胞在G₀/ G₁有丝分裂几乎完全阻断(1.20%)，7%的细胞处于S期(图4(一)同步)。G₀/ G₁然后将同步细胞未经处理或用甜菜碱，C-PC或两种治疗组合治疗18小时（图4 (b))．

18 h后，未处理细胞恢复了与异步细胞相似的细胞周期分布(图)4 (b)未经处理的)。4%的甜菜碱处理(图4 (b)-甜菜碱)18 h后诱导细胞在G₂/M阶段(59.50% vs 17.54%)和sub-G阶段₀(10.97%对0.72%)。80的治疗μ克·升⁻¹C-PC的S期细胞百分率(14.90% vs 21.64%)明显高于G₁阶段增长4%(图4 (b)-C-PC)。尽管C-PC似乎增强了G₂/M降低5%，S相降低可能是由甜菜碱引起的(图4 (b)甜菜碱+ C-PC)。此外，虽然未处理细胞和C-PC处理细胞中处于子go期的细胞数量仍然可以忽略(<1%)，但甜菜碱处理的细胞数量占亚g期的10.97%₀细胞凋亡或坏死。当甜菜碱与C-PC联合使用时，这一数字降至6.71%。综上所述，4%的甜菜碱可以诱导细胞周期阻滞₂/ m相，预防癌细胞的进一步增殖，如hela细胞中类似地观察到的[35]．80年μ克·升⁻¹G对C-PC细胞周期的影响较小₁［36， S相细胞减少。有趣的是，它与甜菜碱结合，提高了甜菜碱的效果。

4．2．在活的有机体内学习

大鼠体质量在372.1±40.2 g ~ 350.8±42.8 g之间，经处理后无明显变化。所有组的食物摄入量都是一样的，这表明治疗没有毒性作用。

4.2.1。准备甜菜碱对肿瘤重量和体积的影响

表格1呈现肿瘤体积和重量每组在安乐死的日子。与对照组相比，甜菜碱、C-PC和甜菜碱+ C-PC治疗组肿瘤重量显著降低。与甜菜碱治疗相比，C-PC治疗引起的肿瘤重量下降更高。联合治疗组(甜菜碱+ C-PC)没有进一步的下降。

与对照组相比，肿瘤体积有显著差异(图)5)，并持续到实验结束。

在甜菜碱治疗4周后，与对照组相比，甜菜碱组肿瘤体积降低了50%，C-PC组降低了88.2%，甜菜碱+ C-PC组降低了86.8%。

5.讨论

癌症，又称恶性肿瘤，是一种严重损害健康和生命的疾病。最近，由于营养物质的安全性和普遍接受性，科学家们开始对其潜在的抗肿瘤作用感兴趣。一些数据表明，大量的天然化合物，包括药物营养素，对选定的癌症类型显示出抗肿瘤活性[37，38]．其中包括C-PC，一种可食用的天然成分美国Platensis无毒副作用，被广泛用作人类饮食的一种极好的补充[39]．它可以抑制癌细胞的生长在活的有机体内和体外．另一方面，以前的研究报告称，补充甜菜碱具有抗炎和抗血管生成作用[18，以及一种可能通过稳定原癌基因和肿瘤抑制基因的甲基化模式来调节其表达来解释的抗癌作用[40]．

我们表明,体外4%甜菜碱可有效降低A549肺癌细胞的生存能力，与C-PC联合使用效果更佳。用甜菜碱观察到的效果与之前的一项研究相关，该研究报告了在2%和4%的甜菜碱治疗Hepa1-6细胞(肝癌)和HepG2细胞(人肝母细胞瘤)后存活率下降[41]．尽管已有迹象表明单独使用C-PC可以通过诱导细胞凋亡以不同浓度和剂量依赖的方式抑制癌细胞生长[36，42，43，我们没有观察到这一点。一种可能的解释是产品的有效性，它高度依赖于来源的生物体、提取和纯化方法以及储存[44，45]．

凋亡可以通过两种不同的细胞内途径诱导，要么由死亡受体介导，要么由线粒体激活介导，后者是对环境压力和抗癌药物的反应触发的[46]．虽然JNK和p38 MAPK被生长因子微弱激活，但它们对应激信号的反应强烈[47，48]和化疗药物，它们的激活被证明是药物诱导凋亡所必需的[49]．p38 MAPK参与线粒体介导的凋亡过程，并通过影响Bax易位在线粒体功能障碍和caspase激活之前起作用[50]．其活化已被证明在诱导非小肺癌细胞凋亡中起重要作用[51]．我们的western blot结果支持MTT联合B + C-PC处理效果增强的研究结果，表明两种物质联合使用对p38 MAPK的表达有更大的影响，可能会激活凋亡，降低细胞活力。相反，尽管单独使用甜菜碱能显著降低存活率，但MAPK的表达没有显著升高，从而可能影响其他细胞途径。c - pc诱导细胞凋亡的分子机制尚未完全阐明，可能的机制有抑制COX-2活性、降低Bcl-2表达、增强CD59表达、激活半胱氨酸蛋白酶家族蛋白等[52]．最近，Pan等人[53]报道C-PC可能调控SKOV-3卵巢癌细胞中多种蛋白的表达，从而影响细胞凋亡、氧化应激、脂质转运和离子转运过程，最终抑制肿瘤细胞的生长。虽然使用的浓度可能过低，不足以显示单独给药后的效果，但不能排除这仍然足以增加甜菜碱的效果，通过影响上述途径之一。

干扰癌细胞周期是开发新的抗癌药物的治疗靶点之一[4]．细胞周期调控在细胞增殖、分化和凋亡中发挥着重要作用。近年来，细胞周期调节功能障碍似乎与肿瘤的发生和发展密切相关。G₂/ m检查点允许细胞在进入有丝分裂之前修复DNA损伤，并且是许多抗癌药物通过诱导细胞凋亡引起细胞死亡的最显着的目标[54]．在本研究中，4%的甜菜碱处理诱导G₂/M期，防止癌细胞进一步增殖，类似于在HeLa细胞中观察到的[35，与MTT法观察到的细胞活力下降相关。11%的细胞分布在亚g中₁期表示细胞核DNA片段呈凋亡或坏死的细胞群[55]．一个成功的抗癌化合物应该杀死或使癌细胞丧失能力，而不会对周围的正常细胞造成过度损害。通过诱导细胞周期阻滞，细胞更有可能进入凋亡，一种“干净”的死亡，而不会通过坏死死亡导致过度炎症细胞聚集到周围组织，避免进一步损害组织[56]．C-PC培养的细胞增加了G₁阶段，如前所述[36，57]．Wang等[58]也证明C-PC能抑制肿瘤细胞增殖并诱导G₂/M期阻滞在HepG-2细胞中。应等人[54报道C-PC对人卵巢癌细胞SKOV-3的增殖有明显的抑制作用体外这是多种途径和信号分子相互作用的结果。对这些作者来说，干扰了一系列信号途径，包括癌症中的蛋白多糖、神经营养素信号途径、VEGF信号途径、癌症中的中心碳代谢、p53途径和许多末端执行因子，如细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白依赖性激酶2（Cdc2）、Cdc25C和C-PC影响癌细胞的增殖和凋亡₂/M相细胞和G₁阶段的细胞。在这里是子g₁与单独使用甜菜碱相比，其数量减少了4%。自从sub-G₁细胞群中既有坏死细胞，也有凋亡细胞，增加周期阻滞中更容易引导凋亡的细胞数量比增加亚g的数量更有益处₁期细胞，坏死细胞是炎症的潜在触发因素，尤其是在在活的有机体内上下文。控制G的分子事件₁细胞周期的阶段由一系列通过表达特异性细胞周期司，依赖性激酶（CDK）和CDK抑制剂的表达调节的一系列磷酸化事件来确定[59]．据报道，p38 MAPK的激活可导致G₂通过磷酸酶CDC25抑制CDC2抑制/M细胞周期[60，这可能是治疗后观察到的p38 MAPK表达增加与细胞周期阻滞之间的联系。

NF -κB，虽然普遍认为与TNF一样是抗凋亡和促炎介质α在细胞信号传递中起着复杂的作用，但这种作用相当模糊[61]．我们已经知道，在结合其受体TNF后α引起几种反应[62]．除了促进我的退化κB和释放NF-κB转录因子，它能激活JNK和p38介导的两个应激激活的MAPK通路。两者都具有促凋亡作用[63通过激活凋亡通路中的caspase-3，直接从NF-中切割一些蛋白κB通路，包括NF-κB (64]与预期结果相反，A549/NF中的荧光素酶报告系统-κB-Luc细胞显示4%的甜菜碱增强了TNFα激活NF -κB.然而，重要的是要记住，该系统只报告TNF的一面α信号通路(仅测量NF-的启动子活性κB基因而不是细胞中蛋白质或mRNA的真实含量），并且MTT测定中的这些相同的条件显示细胞活力降低。这可能导致假设，在这种情况下，TNF的“死亡”途径α是更经常被激活的还是NF-κB在这里起促凋亡作用。与以前的研究结果相反[65]，单独应用C-PC无任何抑制作用。原因可能是不同的，例如C-PC纯化方法，这影响了蛋白质的性质，如前所述，也可能是由于应用的浓度不同。相反，当C-PC与4%的甜菜碱结合时，NF-的活化降低κB启动子(与阳性对照比较)。未来的目标是进一步研究甜菜碱和C-PC这两个分子在何种情况下以何种方式干扰复杂TNF的途径α信号。

总而言之,体外其中，单独使用甜菜碱能抑制肿瘤细胞的生长，而甜菜碱与C-PC联合使用则表现出协同作用。然而，C-PC和甜菜碱对肺癌肿瘤的影响在活的有机体内需要进一步的研究。本研究以NU/NU大鼠为动物模型，探讨两种物质的作用在活的有机体内．肿瘤形成后，在补充期间监测各组大鼠的重量和体积。与对照组相比，C-PC组和甜菜碱治疗组肿瘤重量和体积均显著减少(见表)1和图5)，且联合用药组无进一步下降。在本病例中，我们观察到联合治疗没有协同作用，而单独使用C-PC有很强的抑制作用。甜菜碱的有益作用有几个原因。它的抗氧化特性被报道在许多疾病和条件中，包括由乙醇引起的氧化应激[17，克制压力[12和帕金森病的治疗[66]．在结肠肿瘤小鼠中，甜菜碱特异性地抑制ROS的生成并降低GSSG的浓度[21]．甜菜碱的另一个重要作用是作为甲基供体，通过靶向不同的表观遗传机制元件来调节基因表达[67]．Esteller等人。［6]发现在非小细胞肺癌的各个阶段都发现了异常的启动子DNA甲基化，从而使甜菜碱及其功能成为人们关注的焦点。此外,李32]研究了用甜菜碱孵育的小鼠肝细胞H2.35细胞，表明甜菜碱处理可导致线粒体呼吸和细胞色素c氧化酶活性的上调。他认为甜菜碱对癌细胞的抗增殖作用可能是由于增强了线粒体功能，从而逆转了Warburg效应已知Akt信号通路与促进线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）有关[32和线粒体呼吸。相反，另一项研究表明，抑制血红素合成和线粒体呼吸功能可以阻止肺癌细胞的进展[68]．即使线粒体呼吸的作用是有争议的，在任何情况下，也是肺癌进展的关键因素之一。考虑到获得的在活的有机体内C-PC效果，我们可以在早期的出版物中找到支持，这些出版物报道了它有益的抗肿瘤作用，如清除自由基[26]或者不同肿瘤细胞系中的具体生长抑制，表明各种机制和细胞途径的影响[27- - - - - -30.]．一个可能的解释是为什么我们没有观察到C-PC的同样抑制作用体外可能是藻蓝蛋白的确切代谢尚不清楚。考虑到这一点，我们的体外C-PC的浓度太低，单独给药无法产生效果。

观察获得的结果体外显然，C-PC和甜菜碱之间存在某种未知的相互作用。由于甜菜碱转运体属于pH敏感的质子耦合氨基酸转运体SLC36组[69]， C-PC作为富含半胱氨酸/蛋氨酸的蛋白质[70]通过其氨基酸侧链的酸碱特性来调节pH值，从而影响甜菜碱进入细胞的吸收。当C-PC与甜菜碱联合使用时，细胞内C-PC荧光减弱(流式细胞仪分析显示，数据未显示)，可能是由于C-PC通过提供/接受H改变其氨基酸电荷后，其构象略有改变⁺离子。此外，由于甜菜碱是一种类似氨基酸的化合物，C-PC可能与甜菜碱本身相互作用，而改变其电荷会影响其在细胞膜上的运输或细胞内的相互作用。然而，需要进一步的研究来证实这一假设。

6.结论

总之，甜菜碱和C-PC证明是易于应用的A549细胞系生长的有效抑制剂。而在体外在试验中，C-PC的作用很小或没有作用，与甜菜碱联合使用似乎增强了本已很强的甜菜碱作用。因此，这种联合治疗通过抑制细胞周期的进展，降低细胞活力，或增强促凋亡途径，被证明是一种有效的抑制A549细胞生长的方法。然而,在活的有机体内，单独使用C-PC和甜菜碱均能成功抑制大鼠肿瘤的生长，联合用药组肿瘤抑制效果并不明显。分析处理后的甲基化模式，细胞和生物体的氧化状态，涉及的其他细胞途径，阐明物质代谢，甜菜碱和C-PC之间相互作用的性质，所有这些都必须回答，以帮助我们理解潜在的故事。

相互竞争的利益

作者宣称，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可以被解释为潜在的竞争利益。

致谢

这项研究得到了《癌症防治法》的支持。

参考文献

1. M. D. Swartz, C. B. Peterson, P. J. Lupo等，“研究叶酸代谢途径中的多种候选基因和营养素，以检测肺癌的遗传和营养风险因素，”《公共科学图书馆•综合》，第8卷，第2期1、文章ID e53475, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. E. Filaire, C. Dupuis, G. Galvaing等，“肺癌:与氧化应激、身体活动和营养有什么联系?”肺癌，第82卷，第2期3, pp. 383-389, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. Xu j, Zhang X.，“持续或转换策略在晚期非小细胞肺癌中的维持治疗:一项系统综述和荟萃分析，”胸部，第140卷，第1期，第117-126页，2011年。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. S. Rupachandra和D. V. L. Sarada，“从Borreria hispida种子中提取的抗增殖蛋白对肺癌(A549)和宫颈癌(HeLa)细胞系的凋亡作用的诱导”，生物医学研究的国际，卷。2014年，第179836号，8页，2014年。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. Y.-P。杜,js。彭安，孙正华。唐,W.-H。凌,H.-L。Zhu，“评估甜菜碱对化学诱导大鼠肝癌模型中p16和c-myc DNA甲基化和mRNA表达的影响”，BMC癌症， 2009年第9卷第261条。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. M. Esteller, M. Sanchez-Cespedes, R. Resell, D. Sidransky, S. B. Baylin, and J. G. Herman，“检测非小细胞肺癌患者血清DNA中肿瘤抑制基因异常启动子高甲基化”，癌症研究，第59卷，第1期，第67-701999页。视图:谷歌学者
7. 高田，蔡秋生，A. beegly - fadiel等，“中国从不吸烟女性的维生素B和蛋氨酸摄入量与肺癌风险”，癌症的成因与控制，第23卷，第2期。第12页，1965-1975,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. J. Ying, M. H. Rahbar, D. M. Hallman等人，“饮食中胆碱和甜菜碱的摄入量与肺癌风险之间的关系”，《公共科学图书馆•综合》，第8卷，第2期2, article e54561, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. P. M. Ueland, P. I. Holm, S. Hustad，《甜菜碱:单碳代谢和同型半胱氨酸状态的关键调节器》，临床化学与实验室医学，第43卷，第10期，第1069-1075页，2005年。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. s·a·s·克雷格，《人类营养中的甜菜碱》美国临床营养学杂志，卷。80，不。3，pp。539-549，2004。视图:谷歌学者
11. P. M. Ueland， "胆碱和甜菜碱对健康和疾病的影响"遗传代谢疾病杂志，卷。34，没有。1，pp。3-15，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. B.Ganesan，R. Anandan和P.T. Lakshmanan，“甜菜碱对韦尔葡萄球大鼠在实验诱导的抑制胁迫下对氧化损伤的保护作用的研究”细胞应激与伴侣，第16卷，第6期，第641-652页，2011年。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. K. C. Hayes, A. Pronczuk, M. W. Cook, M. C. Robbins，“甜菜碱在亚急性和亚慢性大鼠研究中的应用”，食品和化学毒理学号，第41卷。12，页1685 - 1700,2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. 张春霞，潘美霞，李斌等，“胆碱和甜菜碱摄入与乳腺癌风险呈负相关：中国的一项两阶段病例对照研究，”癌症科学，第104卷，第104号2, pp. 250-258, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. 之。曾,学术界。徐,Y.-T。Liu等人，“胆碱和甜菜碱的摄入与成人鼻咽癌风险的降低有关:一项病例对照研究。”英国癌症杂志号，第110卷。3、2014年。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. J. E. Lee, E. Giovannucci, C. S. Fuchs, W. C. Willett, S. H. Zeisel，和E. Cho，“胆碱和甜菜碱的摄入量与男性结直肠癌的风险，”癌症流行病学、生物标记和预防第19卷第2期3，页884-887,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. J. Oliva, F. bardago - gorce, B. Tillman, S. W. French，“槲皮素、EGCG、儿茶素和甜菜碱对体外乙醇诱导的氧化应激的保护作用”，实验与分子病理学，第90卷，第5期。3，页295-299,2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. e y。易和Y.-J。Kim说:“甜菜碱通过抑制NF-来抑制体外和体内的血管生成κB和Akt信号通路国际肿瘤学杂志号，第41卷。5，第1879-1885页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. F. H. T. Duong, V. Christen, M. Filipowicz, and M. H. Heim，“s -腺苷蛋氨酸和甜菜碱纠正丙型肝炎病毒诱导的干扰素信号抑制体外”,肝脏学，卷。43，不。4，pp。796-806，2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. Gerile, C. Sogawa, K. Ohyama等，“抗抑郁药对细胞培养中异源表达的小鼠甜菜碱/GABA转运体(BGT1)的抑制作用”，国际分子科学杂志，第13卷，第2期3, pp. 2578-2589, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. D. H. Kim, B. Sung, Y. J. Kang等，“甜菜碱对AOM/ dss诱导的ICR雄性小鼠结肠肿瘤发生的抗炎作用”，国际肿瘤学杂志第45卷第5期3, pp. 1250-1256, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. C. Basaran-Küçükgergin, I. Bingül, M. S. Tekkesin等，“肌肽、牛磺酸和甜菜碱预处理对二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝脏氧化应激和组织损伤的影响”，毒理学与工业卫生，第32卷，第2期8、pp. 1405-1413, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. H. Hagar, A. El Medany, R. Salam, G. El Medany, O. A. na雅尔，“补充甜菜碱通过消除大鼠氧化/亚硝化应激和抑制炎症和凋亡，减轻顺铂诱导的肾毒性，”实验和毒理病理学，第67卷，第5期2, pp. 133-141, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. a . Ramos, F. G. Acién, J. M. Fernández-Sevilla, C. V. González，和R. Bermejo，“利用扩展床吸附色谱法从水聚囊藻中大规模纯化c -藻青素的工艺开发”，色谱学报B:生物医学和生命科学中的分析技术第879卷，第879号7-8，第511-519页，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. B. Fernández-Rojas, O. N. Medina-Campos, R. Hernández-Pando, M. Negrette-Guzmán, S. Huerta-Yepez，和J. Pedraza-Chaverri，“c -藻蓝蛋白通过抑制氧化应激防止顺铂诱导的肾毒性，”食品与函数，第5卷，第5期。3, pp. 480-490, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. M. Kuddus, P. Singh, G. Thomas和A. Al-Hazimi，“c -藻蓝蛋白生产和生物技术应用的最新进展”，生物医学研究的国际， vol. 2013, no . 742859, 9页，2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. 杨伟，冯庆，强东，“藻青素的抗癌活性”，浙江大学学报(工学版)，第35卷，第672-675页，2000。视图:谷歌学者
28. 王敏等，“藻蓝蛋白对人喉癌HEP-2细胞凋亡的影响”，中国病理生理学杂志，第31卷，第7期，第1189-1196页，2015年。视图:谷歌学者
29. Zhang C.， R. W. Pan, K. P. Li et al.，“藻蓝蛋白对结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用:一项初步研究，”中国微生态学杂志， vol. 27, pp. 146-150, 2015。视图:谷歌学者
30. B.Li，X.Chu，M.Gao和W.Li，“C-藻蓝蛋白光动力疗法在体内和体外诱导MCF-7乳腺细胞凋亡的机制，”生物化学与生物物理学报，第42卷，第2期1，页80-89,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
31. B.Li，M.Gao，C.Lv，P.Yang和Q.Yin，“全反式维甲酸和C-藻蓝蛋白对A549细胞生长和凋亡的协同效应研究，”欧洲癌症预防杂志，第25卷，第2期2, pp. 97-101, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
32. I. Lee， "甜菜碱是线粒体呼吸的正调控因子"生物化学与生物物理研究通讯，第456卷，第2期。2, pp. 621-625, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
33. L.-C。吴,y y。林,S.-Y。杨,Y.-T。翁,Y.-T。通过上调ERK和下调p38 MAPK信号通路来调节酪氨酸酶表达的c-藻蓝蛋白的抗黑色素生成作用生物医学科学杂志第18卷第2期2011年第74条第1款。视图:出版商的网站|谷歌学者
34. T. Mosmann，“细胞生长和存活的快速比色法:在增殖和细胞毒性测定中的应用”免疫学方法杂志，第65卷，第5期1-2，页55-63,1983。视图:出版商的网站|谷歌学者
35. 郭y, L.-S。Xu, D. Zhang等，“甜菜碱对体外hela宫颈癌细胞形态、增殖和p53诱导凋亡的影响”，亚太癌症预防杂志，第16卷，第5期。8, pp. 3195-3201, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
36. R. Thangam, V. Suresh, W. Asenath Princy et al.，“产自振荡藤的c -藻青素通过诱导凋亡和G0/G1细胞周期阻滞表现出抗氧化和体外抗增殖活性，”食品化学号，第140卷。1-2, pp. 262-272, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
37. A. B. da Rocha, R. M. Lopes，和G. Schwartsmann，《抗癌治疗中的天然产物》，《药理学最新观点》， vol. 1, no. 14，页364-369,2001。视图:出版商的网站|谷歌学者
38. V. Granci, Y. M. Dupertuis，和C. Pichard，“血管生成作为药物营养素在癌症治疗中的潜在靶点”，临床营养与代谢护理的现状，第13卷，第2期4，页417-422,2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
39. B. Fernández-Rojas, J. Hernández-Juárez，和J. Pedraza-Chaverri，《藻青素的营养价值》，功能食品杂志， vol. 11, pp. 375-392, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
40. M. Alirezaei, Z. Khoshdel, O. Dezfoulian, M. Rashidipour，和V. Taghadosi，“甜菜碱对大鼠大脑中左旋多巴/苯丝肼介导的氧化应激的有益抗氧化特性，”生理科学杂志，第65卷，第5期3, pp. 243-252, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
41. J. Oliva, J. Zhong, V. S. Buslon, S. W. French，“SAMe和甜菜碱对Hepa 1-6, C34和E47肝细胞体外存活的影响”，实验与分子病理学，第92卷，第2期1, pp. 126-130, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
42. B. Li，M.-h。高，X.-M.Chu等，“全反式视黄酸和C-浮蛋白的协同抗肿瘤作用在体外和体内肺癌A549细胞中的肺癌A549细胞”欧洲药理学杂志， vol. 749, pp. 107-114, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
43. M. C. Reddy, J. Subhashini, S. V. K. Mahipal et al.，“C-Phycocyanin，一种选择性环氧合酶-2抑制剂，诱导脂多糖刺激RAW 264.7巨噬细胞凋亡，”生物化学与生物物理研究通讯第304卷2，页385-392,2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
44. R. Chaiklahan，N.Chirasuwan，V.Loha，S. Tia和B. Bunnag，“植物植物的分离和纯化来自螺旋藻使用膜工艺，"生物资源技术第102卷第1期14, pp. 7159-7164, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
45. M.Gantar，D.Imović，S. Djilas，W.W.Gonzalez和J.Miksovska，来自Limnothrix SP的C-植物植物的分离，表征和抗氧化活性。拉紧37-2-1，“生物技术杂志第159卷第1期1-2，页21-26,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
46. d·r·格林，《死亡骗子》自然，第396卷，第2期1998年。视图:出版商的网站|谷歌学者
47. I. Dolado, A. Swat, N. Ajenjo, G. De Vita, A. Cuadrado, and A. R. Nebreda， "第38页αMAP激酶作为肿瘤发生中活性氧物种的传感器，”癌症细胞，第11卷，第5期。2，页191-205,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
48. A. Cuenda和S. Rosouseau，“P38地图 - 激酶途径调节，功能和在人类疾病中的作用”生物化学与生物物理学报-分子细胞研究，第1773卷，第8期，第1358-13752007页。视图:出版商的网站|谷歌学者
49. M. Benhar, I. Dalyot, D. Engelberg, and A. Levitzki，“致癌转化细胞中ROS的增加增强了c-Jun n端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的激活和对基因毒性应激的敏感性”分子与细胞生物学第21卷第2期20，页6913-6926,2001。视图:出版商的网站|谷歌学者
50. M.-T。公园,大学。崔蔡明俊。Kim等人，“细胞外信号相关激酶的抑制和p38 MAPK的激活是导致植物鞘氨酸处理的人类癌细胞中caspase-8和线粒体介导的细胞死亡的两个关键事件，”生物化学杂志第278期50, pp. 50624-50634, 2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
51. “苦参碱诱导的活性氧激活p38导致非小细胞肺癌细胞caspase依赖的细胞凋亡，”肿瘤的报道，第30卷，第2期5, pp. 2529-2535, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
52. J. Subhashini, S. V. K. Mahipal, M. C. Reddy, M. M. Reddy, A. Rachamallu, P. Reddanna，“c -藻蓝素诱导人慢性髓系白血病细胞系k562凋亡的分子机制”，生物化学药理学第68卷第2期3，页453-462,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
53. Pan R.， R. Lu, Y. Zhang et al.，”螺旋藻藻青素诱导SKOV-3细胞差异蛋白表达和凋亡国际生物大分子杂志，第81卷，第951-959页，2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
54. “藻蓝蛋白对SKOV-3细胞增殖抑制作用的转录组分析”基因(第585卷)1, pp. 58-64, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
55. C. Riccardi和I. Nicoletti，“用碘化丙啶染色和流式细胞术分析细胞凋亡”，自然的协议， vol. 1, no. 13, pp. 1458-1461, 2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
56. A. M. VanHook，《免疫学:在细胞凋亡期间避免炎症》科学的信号，第7卷，第5期3、《中国科学院院刊》，2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
57. M. Ravi, S. Tentu, G. Baskar等，“藻青素在三阴性乳腺癌细胞中抗癌活性的分子机制”，BMC癌症，第15卷，第5期。1、2015年第768条。视图:出版商的网站|谷歌学者
58. 彭译葶。王学军，王学军等，“藻青素的光敏作用微胞藻属在人肝癌细胞中:线粒体依赖性凋亡的意义光化学和光生物学杂志B:生物学，第117卷，第70-79页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
59. B. Yu, M. E. Lane, R. G. Pestell, C. Albanese, S. Wadler，“细胞周期蛋白D1下调改变视网膜母细胞瘤蛋白cdk4 -和cdk2特异性磷酸化”分子细胞生物学研究通讯，第3卷，第2期。6，页352-359,2000。视图:出版商的网站|谷歌学者
60. D. V. Bulavin, Y. Higashimoto, I. J. Popoff等，“紫外线照射后启动G2/M检查点需要p38激酶，”自然第411卷第4期6833页，102-107页，2001。视图:出版商的网站|谷歌学者
61. Lin B.， C. Williams-Skipp, Tao Y. et al.， " NF-κ在单个细胞类型中，B既是促凋亡的调节因子，也是抗凋亡的调节因子。细胞死亡与分化，第6卷，第2期6、1999年。视图:出版商的网站|谷歌学者
62. G. Chen和D. V. Goeddel，《TNF-R1信号:一个美丽的途径》，科学，第296卷，第2期。2002年。视图:出版商的网站|谷歌学者
63. A. Porras, S. Zuluaga, E. Black et al.，”p38α丝裂原活化蛋白激酶可使细胞对不同刺激诱导的凋亡敏感。细胞分子生物学，第15卷，第5期。2, 2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
64. M.Karin和A.Lin，“NF-κB在生死的十字路口"自然免疫学，第3卷，第2期。3，页221 - 227,2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
65. 研究所。Cherng S.-N。Cheng, A. Tarn和t - c。c-藻青素在脂多糖刺激RAW 264.7巨噬细胞中的抗炎活性生命科学第81卷第1期19-20，第1431-1435页，2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
66. M. Alirezaei，“在给大鼠服用左旋多巴和苯丝肼后，甜菜碱可以保护小脑免受氧化应激，”伊朗基础医学科学杂志第18卷第2期10, pp. 950-957, 2015。视图:谷歌学者
67. B. Stefanska, H. Karlic, F. Varga, K. Fabianowska-Majewska，和A. G. Haslberger，“生物活性食品成分抗癌作用的表观遗传机制——在癌症预防中的意义”英国药理学杂志号，第167卷。2, pp. 279-297, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
68. J. Hooda, D. Cadinu, M. M. Alam等，“增强的血红素功能和线粒体呼吸促进肺癌细胞的进展，”《公共科学图书馆•综合》，第8卷，第2期5，2013年e63402，2013年。视图:出版商的网站|谷歌学者
69. E. S. Schweikhard和C. M. Ziegler，《氨基酸二级转运体:走向共同转运机制》，膜的当前主题，第70卷，第1-28页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
70. 黄志强，郭伯杰，黄瑞南，蒋耀华，“从钝顶螺旋藻中分离的含硒藻蓝蛋白的特性和抗氧化活性，”食品化学号，第100卷。3，页1137-1143,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2016 Rea Bingula et al。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是原作被正确引用。