β -2肾上腺素能受体在口腔鳞状细胞癌无瘤手术边缘和侵袭性前缘表达的相关性

摘要

背景．肿瘤细胞表达β -2肾上腺素能受体，并与肿瘤细胞的广泛机制，包括增殖、凋亡、血管生成、迁移和转移相关。目标．本研究旨在分析-2肾上腺素能受体(β2-AR)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)无肿瘤手术边缘和侵袭性前沿。62例经活检确诊的OSCC患者入选本研究。临床病理资料和临床随访资料均来自病历及其相关性β2-AR表达通过卡方检验或Fischer精确检验进行验证β2-AR在无瘤手术切缘和OSCC浸润前沿的表达，采用Pearson相关系数检验。结果.表达β2-AR显示无肿瘤手术边缘与OSCC浸润前缘之间有统计学意义的相关性(；）.免疫组化分布βOSCC侵袭前方2-AR与酒精相关也有统计学意义()，同时饮酒和吸烟()和T阶段(）.结论.两者的相关性β2-AR在OSCC和无肿瘤手术边缘的表达表明该受体在肿瘤进展中的作用，其在正常口腔上皮中的表达似乎是结构性的。

1.背景

慢性应激使下丘脑-垂体-肾上腺轴失调，增加应激相关激素、肾上腺素和去甲肾上腺素的分泌[1]．这些儿茶酚胺似乎增强了恶性肿瘤中血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶(MMPs)的表达，促进了肿瘤的进展[2].众所周知β2-AR是g蛋白偶联受体大家族中的一员，负责儿茶酚胺配体信号转导[3.，4]．一次β2-AR结合儿茶酚胺配体，刺激g蛋白受体，导致腺苷酸环化酶活性，随后，在细胞内产生环状AMP (cAMP)，激活蛋白激酶a (PKA)，调节多种细胞功能[5]．越来越多的科学证据已经证实了这一点β2-AR由恶性肿瘤细胞表达，在慢性心理应激下，通过儿茶酚胺诱导的激活，它可以调控广泛的肿瘤细胞机制，包括增殖、凋亡、血管生成、迁移和转移[1，2，6- - - - - -25]．

特别是对口腔癌细胞系的研究表明β2-AR信号上调白细胞介素-6（IL-6）mRNA，这是一种参与血管生成和肿瘤进展过程的细胞因子，增加肿瘤的增殖和侵袭[16，18]此外，Shang等人也报告说β2-AR在口腔癌中的表达与OSCC患者年龄、肿瘤大小、临床分期、颈部淋巴结转移均有显著相关性，提示在OSCC患者中2-AR表达与年龄、肿瘤大小、临床分期、颈部淋巴结转移均有显著相关性β2-AR在口腔癌转移中的作用[16]．相反，我们组在一项回顾性临床研究中显示，OSCC患者表现出较强的β2-AR在恶性上皮细胞中的表达，与弱/阴性上皮细胞相比，具有更高的存活率β2-AR表达式(21]．

虽然β2-AR存在于正常口腔组织中，两者的确切区别在于β2-AR在正常口腔上皮和口腔癌中的表达水平不太清楚[3.，16，18，21];例如,β与邻近正常口腔粘膜相比，2-AR在口腔鳞状细胞癌组织中高表达[16]．反过来，Bernabé等人的研究表明，两者之间没有显著差异β正常口腔黏膜和OSCC标本中2-AR mRNA水平的变化[18]．

为了对最近的研究做出贡献，并调查β2-AR在OSCC中的表达，本研究旨在分析β2-AR在无肿瘤手术边缘和大样本OSCC浸润前沿，以验证是否β2-AR表达与无瘤手术切缘和口腔鳞状细胞癌浸润前沿相关，并探讨两者之间的相关性β2-AR表达水平和临床病理特征。

2.患者和方法

2．1．患者和肿瘤样本

目前的回顾性研究是基于Bravo-Calderón等人之前研究的62例患者的分析。21]．所有患者均于1970年至2000年在巴西圣保罗A.C. Camargo癌症中心头颈外科和耳鼻喉科接受原发口腔鳞状细胞癌手术治疗。入选标准为(i)经活检证实位于口腔舌、口腔底、臼齿后区或下牙龈的原发性口腔鳞癌;(ii)在接受放射治疗或未接受放射治疗后接受手术的病人;(iii) II、iii和IV期临床;以及(iv)可用于显微镜分析的肿瘤和形态正常/非发育不良无肿瘤的外科边缘组织。同时有其他原发肿瘤或入院时有远处转移、术前接受化疗和/或放疗的患者不包括在内。患者的临床资料从医院记录中收集，包括年龄、性别、民族、烟酒消费、肿瘤部位、疾病分期，根据国际抗癌联盟(UICC)的TNM系统[26]治疗（手术、术后辅助放疗）和临床随访（复发、颈淋巴结转移、远处转移或第二原发肿瘤的发生）。本研究由巴西圣保罗A.C.Camargo癌症中心研究伦理委员会批准（#1385/10）。

formalin-fixed 3μ取M厚肿瘤组织切片，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，免疫组化分析β2-AR。三位观察员(Denise Tostes Oliveira, Gustavo Amaral Lauand, Diego Mauricio Bravo-Calderón)在不了解临床数据的情况下分析了肿瘤切片。根据Bryne等人的系统确定OSCC的组织病理学恶性程度[27]．肿瘤浸润邻近结构，血管栓塞，淋巴结转移(pN+)也有报道。

2.2.口腔鳞状细胞癌无瘤手术切缘中β-2肾上腺素能受体的表达

62个口腔鳞状细胞癌标本的切片在二甲苯中脱蜡，并使用分级酒精/水浴进行水合。抗原回收使用10mM柠檬酸缓冲液(pH 6.0)在一个家用压力锅(Nigro，型号Eterna 4.5 L, Araraquara, SP，巴西)为4然后用3% H孵育抑制内源性过氧化物酶活性₂O₂30分钟。肿瘤部分孵化了18个小时在4°C潮湿室与anti-beta-2肾上腺素能受体主要抗体(圣克鲁斯生物技术、sc - 9042,圣克鲁斯,CA,美国)和稀释1:50磷酸缓冲盐(PBS)与牛血清白蛋白溶液(σ,A9647,圣路易斯,密苏里州,美国)阻止非特异性反应。接下来，将肿瘤切片用Post Primary Block (Novocastra, NovoLink Max Polymer, RE7260-K, Newcastle Upon Tyne, UK)孵育30分钟min，然后用同一试剂盒中的聚合物孵育。使用3.3 '二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB/Sigma, D-5637, St. Louis, MO, USA)进行5次抗原-抗体反应Min在黑暗中。肿瘤切片用Harris苏木精反染色，脱水后用盖玻片制备。切片内血管平滑肌为阳性内对照。阴性对照，免疫组化染色时省略一抗。所有OSCC标本均在一次免疫染色。

使用400倍放大镜捕获肿瘤游离边缘的10个显微区域，以分析肿瘤的免疫组织化学表达β2-AR。图像通过数码相机(Axiocam MRc, ZEISS，耶拿，德国)连接到光学显微镜(Axioskop 2 Plus, ZEISS，耶拿，德国)并保存在计算机程序系统(Axiovision 4.6, ZEISS，耶拿，德国)。免疫组织化学表达β如前所述，对2-AR进行评估[21]．简单地说，使用ImageJ软件(Wayne Rasband NIH, Bethesda, MD, USA开发的基于java的公共领域图像处理与分析程序)对具有代表性的肿瘤图像进行分割。阳性的恶性细胞的棕色强度变化β2-AR表达式按照以下RGB通道值范围进行分类:R(红色)通道为90 ~ 194;G（绿色）通道为50～140；B（蓝色）通道为45～147；R值应大于B值;G值应该大于B值。

根据上述标准，使用MATLAB计算语言软件对每个OSCC手术边缘采集的10张图像进行自动分割。该软件根据像素的数量，测量每个分割区域(确定β2-AR immunopositive地区)。计算机辅助免疫组化分析后，平均β计算10例手术边缘图像的2-AR表达水平。接下来，62个OSCC样本的平均值，之前由Bravo-Calderón等获得[21，并以中位数作为分界点，将样本分类为弱/阴性(平均0.62至23.86)或强(平均25.99至79.63)。β2-AR表达式。这个测量β3名研究人员(Denise Tostes Oliveira, Gustavo Amaral Lauand, and Diego Mauricio Bravo-Calderón)在不了解组织病理学特征和患者临床状况的情况下，主观证实了手术边缘上皮细胞的2-AR表达。如果这些分析仪之间不一致，则保留主观评价标准，因为这一评价涉及整个标本。

此外，知道大多数抗原受到福尔马林固定的不利影响[28，确认β2-AR表达模式是通过免疫组化染色的另外19个冷冻切片OSCC从解剖病理学，圣地亚哥临床医院大学，西班牙圣地亚哥德孔波斯特拉。

2.3.统计分析

所有统计分析均使用SPSS13.0 for windows软件（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行βPearson相关系数检验证实了2-AR在无瘤手术切缘和OSCC浸润前沿的表达β2-AR表达和临床病理变量通过卡方检验或Fisher精确检验进行分析，被认为代表了统计上显著的结果。

3.结果

62例OSCC标本免疫组化分析显示阳性表达β2-AR在所有无瘤手术切缘的角化不全层状鳞状上皮中均有表达，50例(80.6%)表现为强表达β2-AR水平。β在无肿瘤手术切缘的正常上皮细胞的细胞质和质膜上检测到2-AR免疫染色。同样地，同样的模式β在肿瘤浸润前沿的恶性上皮细胞中发现2-AR表达（细胞质和膜性）。

有趣的是，Pearson相关系数检验发现两者之间有统计学上显著的正相关β2-AR在无肿瘤手术边缘和肿瘤浸润前的表达水平(；)(图1）.在62例口腔鳞癌标本中，大部分(64.5%)口腔鳞癌标本中β2-AR在无瘤手术边缘的表达水平，并伴有侵袭性前沿的表达水平升高。换句话说，那些标本的弱β2-AR在无瘤手术边缘的表达在其侵袭性肿瘤前沿也表现为弱/阴性的免疫染色;同样的，当免疫表达β2-AR蛋白在正常口腔上皮细胞中表达强烈，在无瘤手术边缘，肿瘤侵袭前方的恶性上皮细胞中表达水平也较高(图)1）.

另一方面，22例(35.5%)OSCC样本之间无相关性β无瘤边缘和肿瘤浸润前的2-AR水平如图所示1．20例(32.25%)非相关病例中，肿瘤侵袭性前沿下降β2-AR的表达水平与他们各自的无瘤手术边缘相比较(图1).另一方面，the pattern ofβ2-AR在OSCC无瘤手术边缘和侵袭性肿瘤前部的表达如图所示2．

通过对19个新的OSCC冷冻标本的评估，对福尔马林固定的石蜡包埋组织材料进行了额外的分析，以确认我们的发现。β该样本中的2-AR表达在大多数OSCC标本中得到证实，在87.5%的无瘤手术切缘和55.5%的浸润前沿呈阳性免疫表达。在手术切缘的基底层和角质层或口腔癌的角蛋白珠中，2-AR的免疫表达均为阴性β2-AR被检测到。此外，胞质和膜质表达β2-AR在邻近肿瘤的口腔上皮细胞以及OSCC的恶性上皮细胞中被证实。

３．１．之间的关联β2-AR表达与临床病理变量

以确定可能的临床意义β2-AR在口腔癌中的表达以及该蛋白表达与OSCC患者临床病理特征之间的关系，进行卡方或Fischer的精确检测。

免疫组化表达无统计学意义β2-AR在无瘤手术边缘和临床变量的评估(表1).另一方面，β浸润性肿瘤前沿的2-AR免疫表达与饮酒有统计学相关性()，同时饮酒和吸烟()并与临床T期()，如表所示1.大多数口腔鳞状细胞癌患者表达弱/阴性β肿瘤浸润前2-AR表现为饮酒或烟酒消费。此外,强大的β2-AR在肿瘤上皮细胞中表达多见于临床早期T1/T2期患者。

不管分析的区域是什么，无论是无瘤手术边缘还是侵袭性肿瘤前缘，两者之间都没有统计学上显著的关联β2-AR表达及组织病理学特征，包括恶性程度、淋巴结累及(pN+)、血管栓塞及神经周围浸润、肌肉或骨骼浸润(表)2）.

4.讨论

虽然一些研究描述了功能定位β2-AR在包括肿瘤微环境在内的多种细胞中，该受体在正常口腔上皮和恶性上皮细胞中的表达模式尚不明确[1- - - - - -3.，6，8- - - - - -24]我们对大量口腔鳞状细胞癌标本进行的免疫组化分析显示β除角质层和基底层外，所有无肿瘤手术边缘的正常口腔上皮细胞中均存在2-AR(图)2）.这些发现证实了先前的报告β2-AR作为主要的肾上腺素能受体亚型在培养的人口腔角质形成细胞和那些通过RT-PCR检测证实表达β15例正常口腔黏膜标本中14例2-AR mRNA的表达[3.，18]．我们及上述报告所取得的资料，整体而言[3.，18)表明,β2-AR在正常口腔上皮中呈结构性表达。

关于OSCC，与正常上皮相似，Piffkò等认为肿瘤浸润前部是进展最严重的区域。[29]，约3 ~ 6个肿瘤细胞层或分离的肿瘤细胞组免疫染色阳性β恶性上皮细胞的细胞质和细胞膜上可见2-AR，角蛋白珠为阴性(图)2）.此外，本研究首次证明了β2-AR在手术边缘与肿瘤侵袭前表达水平呈正相关(；)(图1）.尽管方法上存在差异，我们的发现证实了Bernabé等人提出的观察结果。[18的研究结果显示，在β正常粘膜和OSCC不匹配标本中2-AR mRNA的表达[18]．与此相反，Shang等人[16)报道,β2-AR在OSCC组织中的表达高于相邻的正常口腔粘膜。然而，与我们目前的结果相比，这是不可行的，因为上述分析是在少数手术边缘进行的。此外，Shang等未进行相关检验评价[16，根据作者的说法，他们的发现β手术边缘2-AR免疫染色可能是由于实验的多样性[16]．此外，我们在福尔马林固定的石蜡包埋组织中所确定的结果的准确性，通过对OSCC冷冻标本的分析得到了积极的验证。

生物学证据表明，慢性心理应激通过儿茶酚胺诱导神经细胞活化β2-AR可影响多种恶性肿瘤的进展[1，2，6- - - - - -25]．然而，与压力相关的激素的作用可以是刺激性的，也可以是抑制性的，这取决于激素的类型和肿瘤的类型[25]．在这种情况下β2-AR在口腔癌进展中的作用尚不明确。因此，科学文献已经证明βOSCC患者恶性细胞2-AR免疫表达与年龄、肿瘤大小、临床分期、颈部淋巴结转移显著相关[16].然而，目前的临床研究表明，临床上归类为T3或T4的患者表现出较高的弱/阴性率β2-AR在浸润性肿瘤前部的表达(见表1)1).此外，考虑到β2-AR出现在所有无肿瘤的手术切缘，预计在正常口腔上皮细胞的免疫组化表达和临床病理变量评估中没有统计学意义的相关性(表)1和2）.

另一方面，有证据表明，在某些oscc中，β2-AR在肿瘤细胞中的表达可能减少(图1)，如先前显示的口腔癌患者和弱/阴性β2-AR表达和低生存率，与强β2-AR表达式(21]，加强了Yu等人先前获得的研究结果[10]．Yu等人证明了基因沉默β2-AR增加正常前列腺细胞的细胞迁移和侵袭，这种蛋白的弱表达与前列腺癌患者的转移和最差生存率有关β为了进一步阐明该受体的作用，需要进行2-AR表达。在体外分析中提出了刺激和抑制因子β2-AR。

5.结论

因此，根据这些结果，我们可以得出结论，尽管目前的研究加强了这一点β2-AR是正常口腔上皮细胞的组成部分，并与表达水平呈正相关β2-AR在OSCC细胞中的作用，需要进一步的临床、细胞和动物研究来阐明β2-AR在口腔癌中的作用，特别是其降低对肿瘤进展的重要性。

缩写

β2-AR:	β2肾上腺素能受体
OSCC：	口腔鳞状细胞癌。

道德认同

本研究得到了A.C. Camargo癌症中心研究伦理委员会的批准，São, Paulo，巴西(#1385/10)。

竞争利益

作者称他们之间没有利益冲突。

致谢

作者要感谢圣保罗州宪法保障基金会（FAPESP，Grants#2011/11630-0和#2012/04098-2）和国家环境保护科学委员会（CNPq，Grants#142790/2011-7和#142175/2015-3）对本研究的支持。

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