低氧诱导因子- 1α印度尼西亚喉鳞状细胞癌患者的表达

摘要

目标.本研究旨在确定缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)喉鳞状细胞癌的表达与临床分期。方法．我们回顾性分析了2011年至2014年47例喉鳞癌(LSCC)患者的石蜡包埋组织。HIF-1α使用抗hif -1免疫组织化学分析表达α鼠单克隆抗体。HIF-1之间的关联α采用卡方检验分析表达及临床分期。结果．声门是喉部鳞状细胞癌的主要发生部位，43/47(91.5%)的患者出现在晚期。在晚期患者中，27/43的HIF-1阳性α16/43染色阴性。早期患者中，2/4 HIF-1阳性α表达和2/4染色阴性。统计分析未显示HIF-1的显著相关性α表达式。结论．HIF-1之间没有统计学意义的关联αLSCC的表达与临床分期或组织学分化。

1.介绍

喉癌在世界范围内很常见；它是仅次于鼻咽和鼻窦肿瘤的第三常见头颈部恶性肿瘤[1.]每年，美国大约有12760例新的喉癌病例被诊断出来，估计有3560人死于这种疾病[2.］．喉癌最常见的类型是鳞状细胞癌(SCC)，它可以从癌的范围原位低分化癌。喉癌发生在声门的几率是声门上的三倍;声门下癌极为罕见，仅占所有喉癌的2% [3.］．

许多因素被认为有助于喉癌诊断后的生存率；肿瘤分期、肿瘤部位、治疗策略、患者年龄和共病都被认为起到了作用[4.］．肿瘤缺氧是许多实体肿瘤的特征。缺氧的原因是多因素的，包括肿瘤血管系统异常或混乱、血液灌注受损、耗氧量降低和贫血[5.］．严重的肿瘤缺氧最终导致组织坏死，但非致死水平的缺氧可影响肿瘤细胞生物学。低氧诱导因子- 1α(HIF-1α)是一种转录因子，介导对缺氧的适应性反应。HIF-1α在许多人类癌症中，由于基因改变或瘤内缺氧，活性增加。HIF-1α激活基因转录以增加氧气的可用性;HIF-1α可以刺激血管生成或重组细胞代谢以适应氧气供应减少[6.］．HIF-1的调控α亚单位构成氧反应途径调控的一部分。在氧气存在的情况下，HIF-1α亚基被羟基化，并随之降解。然而，在缺氧条件下，它们不被羟基化;HIF-1α稳定并能刺激基因表达。HIF-1α调节几种重要的生物途径，包括与细胞增殖、血管生成、细胞代谢、凋亡和迁移有关的途径[7.］．然而，HIF-1的作用α对于HIF-1在喉癌中的活性了解甚少，关于HIF-1的研究也非常少α印度尼西亚喉癌患者的研究已经发表。本研究的目的是确定HIF-1α喉部鳞状细胞癌(LSCC)表达。

2.材料和方法

日惹Gadjah-Mada大学医学院伦理委员会批准了这项横断面研究。该研究包括2010年1月至2014年4月期间47例经组织学诊断的LSCC患者的石蜡包埋组织。该研究由耳鼻咽喉头颈外科部进行来自印度尼西亚日惹Gadjah Mada大学医学院的nd解剖病理学。纳入标准为年龄>40岁且既往无化疗、放疗或手术史的患者。数据不完整或严重并发症的患者被排除在研究之外。

部分4 - 5μM取自石蜡包埋的组织块。切片在二甲苯中脱烃，用分级乙醇复水。抗原回收在微波炉中进行，两次10分钟。内源性过氧化物酶活性被阻断，用1.5%过氧化氢和无水甲醇在室温下孵育10分钟。抗hif -1的小鼠单克隆免疫球蛋白G (IgG)α抗体（美国研发系统公司）用于检测HIF-1α细胞核和细胞质中的蛋白表达。在室温下应用一抗1小时，切片用50 mM tris缓冲盐水冲洗3次，pH 7.2 (TBS)，然后用50μL的聚合，辣根过氧化物酶偶联，抗小鼠IgG抗体在室温下30分钟。切片用50 mM TBS洗涤3次，并用二氨基联苯胺(DAB Kit, Thermo Scientific, USA)观察蛋白表达。切片随后用苏木精和伊红进行反染色，脱水，并用光学显微镜进行评估。样品用10mm TBS而不是一抗作为阴性对照。HIF-1α细胞核和细胞质的表达仅为阳性(1+)或阴性(0)，阳性染色定义为HIF-1α>表达占肿瘤面积的10%。HIF-1之间的联系α应用卡方检验分析LSCC的表达、临床分期和分化情况。

3.结果

研究中包括47例经组织学诊断的LSCC患者。患者的临床分期通过计算机断层扫描、胸部X光和腹部超声成像确定。患者特征，包括性别、年龄、临床分期和组织病理学分化（良好、中等或较差）如表所示1.年龄<60岁的患者24例（51.1%），年龄<60岁的患者23例（48.9%）≥60岁，HIF-1阳性αHIF-1染色阴性α29/47(61.7%)和18/48(38.3%)患者出现染色。29个HIF-1α-阳性样本中28/29例(96.5%)为男性，1例(3.5%)为女性。患者临床分期分为早期(I、II期)和晚期(III、IV期)，其中早期4例(8.5%)，晚期43例(91.5%)。原发性肿瘤的位置，定义为声门或声门上，主要是声门;声门癌42例(89.4%)。组织病理学分析显示分化良好15/47(31.9%)，中分化24/47(51.1%)，低分化8/47(17.0%)。HIF-1差异无统计学意义α在不同分化的肿瘤中均有表达2.)．

我们接着研究了HIF-1之间的关系α表达与LSCC临床分期。在4例(8.5%)早期患者中，2例HIF-1阳性α2例HIF-1阴性α表达式。43例(91.5%)晚期患者中有27例(62.8%)HIF-1阳性α16例(37.2%)HIF-1阴性α表达式。然而，统计分析没有显示HIF-1之间有任何显著的关联αLSCC的表达与临床分期(；表格2.)．

4.讨论

之前的研究报道了关于HIF-1之间关联的不一致结果α表达与LSCC临床分期有关。吴等[8.]发现HIF-1之间存在显著的相关性αT3-T4期LSCC的表达及意义(在中国)。然而，Schrijvers等人的另一项研究[9表明HIF-1与HIF-1之间没有显著关系α声门鳞状细胞癌的表达和早期临床阶段。然而，他们的研究侧重于早期患者，而我们的研究主要包括晚期患者，这两项研究的临床阶段不同，因此很难比较我们的结果。

在其他恶性肿瘤中，Cao等[10]已经证明HIF-1之间存在显著的相关性α大肠癌的表达与晚期临床分期。Lin等[11]也报道了HIF-1之间具有统计学意义的相关性α口腔鳞状细胞癌的表达、肿瘤大小、区域转移和临床晚期。No等人的另一项研究[12]检验了HIF-1之间的关系α和血管内皮生长因子(VEGF)在宫颈癌中的表达。他们发现HIF-1之间没有显著的统计学关系α但他们的结论是，宫颈癌的癌变受HIF-1的影响α，尽管确切的机制尚不清楚。

在这项研究中，我们没有发现HIF-1之间的关联α提示其他生物标志物可能在确定LSCC的癌变过程中具有重要意义。HIF-1αHIF-1在实体瘤中由缺氧诱导，使肿瘤细胞适应低氧条件α表达由严格控制的表达和降解周期来调节。Toffoli和Michiels [13]的研究表明，在单个肿瘤中存在缺氧区和非缺氧区。此外，缺氧区域可以经历一个复氧过程，以恢复常氧条件;HIF-1α在缺氧条件下是稳定的，在复氧过程中会被降解。因此，经过再氧以恢复氧气条件的肿瘤区域将HIF-1染色为阴性α表达式。

复杂的癌变机制是LSCC从早期临床阶段发展到晚期临床阶段的基础。在这个转变过程中，肿瘤发生了复杂的变化，许多研究正在进行，以提高我们对这些过程的理解。当实体肿瘤遇到缺氧条件和HIF-1时αHIF-1的表达，发生了许多过程来实现肿瘤的进展和临床分期的改善α在缺氧条件下引发基因组不稳定、血管生成、细胞凋亡、免疫逃避、肿瘤侵袭和转移以及糖酵解的激活。所有这些过程都在细胞和分子环境中产生变化，并受到进一步复杂机制的支持[13,14］．

根据Poon等人[14， HIF-1的激活α除缺氧条件外，还需要多种因素引起肿瘤微环境刺激的变化，包括生长因子、von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白、琥珀酸脱氢酶、p53和其他蛋白。HIF-1α肿瘤细胞中的蛋白表达通过多种过程触发恶性进展，包括血管生成，这是通过VEGF实现的;葡萄糖代谢的改变，这是通过葡萄糖转运体1实现的;肿瘤细胞存活，这是通过胰岛素样生长因子-1实现的;转移是通过赖氨酸氧化酶和纤溶酶原激活物抑制剂-1实现的。本研究仅检测HIF-1的表达α许多研究都未能证明HIF-1与HIF-1之间的关系α表达与临床分期。然而，考虑到LSCC进展和发展机制的复杂性，我们预计其他因素将被证明与LSCC临床阶段相关。

No等人的研究[12]在HIF-1之间没有显示出统计上的显著关系α蛋白表达与LSCC肿瘤大小或转移。恶性肿瘤的进展通常以临床分期的增加为特征，它是通过许多复杂的机制发生的，而不仅仅是一个或两个因素的作用。Ruan等人[15]提出氧气扩散足以使氧气传播到100-180度μm位于毛细血管远端和细胞之间。肿瘤体积增大，表明T分期升高，将降低氧扩散在维持常氧、缺氧条件和HIF-1方面的功效α稳定将发生在远离毛细血管远端肿瘤细胞。我们的研究没有显示HIF-1之间有任何显著的关联α蛋白表达与LSCC转移。这增加了HIF-1论点的说服力α并不是在LSCC致癌过程中发挥作用的唯一蛋白质;HIF-1α可能在恶性肿瘤的进展中发挥积极作用，但可能需要其他蛋白质来加速肿瘤的发展和侵袭性。

本研究中证明的唯一具有统计学意义的关系是HIF-1之间的关系α表达方式及性别()．相反，Cao等人．［10[发现这些变量之间没有关系，但他们的研究队列中男性:女性患者的比例约为1.5:1。在本研究中，男女患者的比例约为7:1。由于在我们的研究中，性别分布不是同质的，需要进一步研究更同质的患者分布来验证我们的发现。

5.结论

总的来说，我们的研究结果强调了HIF-1的作用α在致癌作用。尽管在本研究中没有发现统计学上显著的关联，HIF-1α和其他生物标志物已被证明有助于喉鳞状细胞癌的发展和进展。需要进一步的研究来阐明喉癌的分子途径。

附加分

总结点．HIF-1α可以在LSCC中得到证明。

相互竞争的利益

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Hariyadi,医学博士学位,免疫组织化学结果证实,奥古斯汀•夫人准备材料和执行实验室工作,为她和Yuni女士作为数据管理器在肿瘤学部门,部门的耳鼻咽喉头颈外科医学院意大利Gadjah马达思班,以及医学博士学位持有者Anisa帮助手稿准备。这项工作得到了印度尼西亚日惹大学医学院Dana Masyarakat A34/2014的资助。

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