抗增殖和凋亡的影响特定Antiprostate干细胞单链抗体对人类前列腺癌细胞

文摘

前列腺干细胞抗原(PSCA)是一个高度糖基化的细胞表面蛋白的过表达在一些恶性肿瘤包括前列腺癌、胰腺癌,膀胱癌症。报道了肿瘤抑制anti-PSCA抗体。小和高亲和力单链抗体(scFv)介绍了有效的癌症immunotargeting代理方法。在目前的研究中,我们使用一种噬菌体抗体显示scFv图书馆和选择两个抗体两个immunodominant PSCA淘洗过程的抗原表位。的scFvs相应的抗原表位的反应是由噬菌体ELISA。绑定的特异性抗体PSCA-expressing前列腺癌症细胞系,du - 145,通过流式细胞术分析。抗增殖和凋亡诱导效应进行评估通过MTT和Annexin-V化验,分别。结果代表功能scFv C5-II可以绑定专门du - 145细胞,显著地抑制这些细胞的增殖(61%)对PSCA-negative细胞无影响。抗体也在PSCA表达细胞诱导细胞凋亡。凋亡细胞的比例经过24小时的暴露在500 scFv /细胞为33.80%。 These results demonstrate that the functional anti-PSCA scFv C5-II has the potential to be considered as a new agent for targeted therapy of prostate cancer.

1。介绍

前列腺干细胞抗原是一种细胞表面抗原属于Thy-1 / Ly-6 glycosylphosphatidylinositol家族(GPI)锚定蛋白1]。PSCA主要表达在正常组织显示前列腺特异。然而,少PSCA的表达中也发现了其他正常组织包括胎盘,胃,肾2]。高浓度的PSCA在超过80%的前列腺癌标本已报告在所有情况下的前列腺癌骨转移病灶的患者(3]。PSCA的超表达也被报道在大多数膀胱和胰腺癌(4- - - - - -6]。在前列腺癌的情况下,高水平的PSCA表达广泛一直与格里森评分高,先进的肿瘤阶段,精囊参与,发展androgen-independent疾病和骨转移(7- - - - - -10]。虽然PSCA的角色在细胞间信号已被证明,对PSCA的监管机制或生物功能11,12]。有人建议,PSCA可以作为肿瘤抑制和促进肿瘤抗原根据肿瘤类型,肿瘤的微环境,PSCA和其他分子之间的串扰(12]。临床数据表明PSCA作为一个潜在的目标抗原诊断和治疗的应用。阻塞PSCA的单克隆抗体在某些前列腺和胰腺癌症导致的小鼠模型的抑制肿瘤的生长和预防转移(13- - - - - -15]。

重组抗体最近显示出巨大的希望在单克隆抗体在不同的替代医学等领域对人类恶性肿瘤免疫治疗(16- - - - - -19]。单一链片段变量(scFv)抗体是其中最流行的格式的重组抗体(20.]。优势scFvs完整抗体包括规模较小,快速渗透和紧密绑定目标组织,快速排除体外,和更好的药代动力学性质以及人类起源提供了scFvs完全理想的工具,用于成像和治疗的目的(21- - - - - -24]。

在目前的研究中,我们分离特定scFv抗体immunodominant PSCA的抗原表位和评估他们的抑制性影响PSCA-expressing癌症细胞通过细胞增殖和Annexin-V化验。

2。材料和方法

2.1。选择Anti-PSCA scFv

噬菌体scFv抗体显示图书馆开发如前所述[25,26]。图书馆使用M13KO7 phage-rescued辅助噬菌体和具体scFv抗体被平移过程孤立。氨基酸,多肽作为抗原表位(50 - 64和67 - 81的PSCA)涂在一夜之间在immunotubes (Nunc、鲁开德、丹麦)。的phage-rescued上层清液(10¹⁰空斑形成单位/毫升)稀释与阻塞的解决方案是添加到管和孵化1 h在室温下。添加日志之后阶段一号大肠杆菌细菌,细菌颗粒生长2日ty-ampicillin琼脂板上。四轮平移进行隔离特定抗体的抗原表位。PCR进行平移后调查获得的克隆的存在所需的乐队scFv对应插入和DNA指纹图谱与Mva-I限制性内切酶显示普通模式。的一个克隆最常见的模式是选择对每个表位和phage-rescued进一步评估。

2.2。scFv浓度测量

所选scFvs浓度测量使用噬菌体浓度测定。所选phage-rescued上层清液(10μL)加入1毫升一号大肠杆菌在对数生长期和孵化用颤抖的1 h在37°C。连续稀释文化被镀到2 ty-ampicillin琼脂板上。那时单链阵线浓度计算通过计算菌落的数量每稀释。

2.3。噬菌体ELISA

肽(100μ96 g / mL)涂在微量滴定ELISA板在一夜之间在4°C(一个不相关的肽也是涂层是一种消极抗原控制)。井被屏蔽解决方案使用2%脱脂奶在PBS和孵化37°C 2小时。与PBS /渐变20和PBS,洗涤后的phage-rescued上层清液含有scFv添加到板和孵化在室温下(RT) 2小时(M13KO7添加辅助噬菌体肽涂井作为负面抗体控制)。洗后,anti-fd噬菌体抗体(英国σ)添加和孵化为1.5 h。板被删除的抗体和HRP-conjugated anti-fd抗体了。1 h RT的孵化后,板被150人μL的衬底(1μL H₂O₂在0.5毫克/毫升abt柠檬酸缓冲)补充道。30分钟后吸光度检测在405海里使用ELISA读者。

2.4。细胞培养

人类前列腺癌的细胞系,du - 145和LNCaP从伊朗国家细胞银行购买(NCBI,巴斯德研究所的伊朗,德黑兰,伊朗)。细胞系的培养和维护rpmi - 1640年媒介(美国纽约PAA,大岛)和补充10%胎牛血清(PAA)、青霉素100单位/毫升和100μg / mL链霉素(英国BioSera)。细胞生长在37°C有限公司₂孵化器。

2.5。流式细胞术

检查的具体绑定选择scFv抗体PSCA表面的细胞,流式细胞术。细胞(10⁶)被转移到流式细胞术管。的anti-PSCA scFv抗体(500 scFv /单元)是添加到管在4°C和孵化2 h。M13KO7辅助噬菌体是用作控制同形像。Anti-fd抗体(σ,化工有限公司,英国)添加和孵化RT 1 h。洗后,FITC-conjugated anti-fd抗体(σ,化工有限公司,英国)添加到管和孵化的RT 30分钟在一个黑暗的地方。,正欲使用FACSCalibur数据获取(美国)。

2.6。细胞增殖实验

细胞被播种到96孔平底盘子的密度(NUNC、丹麦)10⁴细胞/好,孵化一夜之间在37°C。du - 145和LNCaP细胞系被治疗在6复制与不同浓度的scFv(200、500和1000 scFv /细胞)为24小时37°C。M13KO7辅助噬菌体和2泰肉汤媒体作为消极的控制。MTT试剂(150μL(0.5毫克/毫升)其次是添加了4小时的潜伏期在37°C。紫色甲瓒晶体形成后,浮在表面的温柔地删除和水晶产品可溶性和孵化在DMSO(德国默克公司)在室温下过夜。比色评价使用分光光度计在570海里。细胞生长的百分比计算从治疗和治疗细胞的吸光度值如下: 。

2.7。Annexin-V化验

Annexin-V /π试验进行评估的凋亡效应C5-I和C5-II scFv抗体PSCA-positive du - 145细胞。对于每一个条件,10⁶细胞/被转移到6厘米文化板块和孵化一夜之间在37°C。细胞然后接受C5-I C5-II scFv抗体(500 scFv /单元)为24小时37°C。在CM10 3 h DMSO溶液(10%)是作为积极的控制。细胞被温柔地收获,转移到流式细胞术管,与冷PBS洗,沾2μL Annexin-V和2μ100年L propidium碘μL孵化缓冲区(罗氏应用科学,德国)在RT在黑暗中15分钟,然后分析了FACSCalibur(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)。

2.8。统计分析

使用Mann-Whitney数据进行了分析测试比较的百分比antibody-treated和未经处理的细胞之间的细胞生长。所有数据提出了均值±标准差。< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Anti-PSCA scFv抗体

数据1(一)和1 (b)显示20翻版的DNA指纹图谱克隆抗原表位I和II。通用模式的频率40%(8/20)和55%(11/20)得到肽I和II,分别。一个殖民地从每个模式(克隆C5-I和C5-II)是用于进一步的调查。

3.2。噬菌体ELISA

噬菌体进行ELISA测定特异性选择scFvs绑定到相应的肽。如图2,C5-I C5-II scFvs绑定到肽I和II PSCA的分别。吸光度明显高于井没有肽(< 0.05)。辅助噬菌体M13KO7没有反应的抗原表位。

3.3。流式细胞术

流式细胞仪显示的绑定能力C5-I和C5-II scFvs PSCA在du - 145细胞的表面。结果表明,两种抗体绑定到du - 145细胞特别是PSCA-negative细胞系相比,LNCaP(图3)。

3.4。细胞增殖试验(MTT)

不同浓度的抗增殖作用C5-I和C5-II抗体du - 145和LNCaP细胞MTT试验进行评估。治疗浓度200、500和1000年scFv C5-II显示显著的抗增殖作用Du145细胞与辅助噬菌体治疗相比,24小时后,media-treated和未经处理的控制条件(< 0.05)。没有明显的anti-proliferative效应得到C5-I scFv。然而,百分比du - 145细胞生长的细胞治疗C5-II scFv 80%、39%和35%浓度200,500,和1000 scFv /细胞,分别。没有在LNCap细胞的增殖抑制作用观察(图4)。

3.5。Annexin-V化验

结果显示,scFv C5-II du - 145年显著诱导细胞凋亡细胞治疗24小时后相比scFv C5-I治疗细胞和未经处理的细胞(33.8%,1.48%和2.74%,分别地。)(图5)。

4所示。讨论

前列腺干细胞抗原此前多次被不同的策略包括单克隆抗体和疫苗在临床前研究(13,27]。PSCA已经提出了免疫疗法作为治疗目标。各种形式的anti-PSCA抗体研究了包括单克隆抗体和格式重组人源化抗体,diabodies, minibodies有效目标PSCA [28- - - - - -31日]。据报道,单克隆抗体1八国集团目标PSCA能够诱导细胞死亡小鼠体外,防止肿瘤转移与人类前列腺癌细胞接种(32,33]。由于众所周知的优点单链抗体在完整的单克隆抗体,这种抗体格式已被用于癌症生物标记定位。在这项研究中,我们选择一个特定的和功能人类单链抗体来对抗PSCA用于前列腺癌的靶向治疗。为了选择特定的单链抗体PSCA,两个immunodominant PSCA的抗原表位。氨基酸肽(TARIRAVGLLTVISK)是50 - 64的细胞外域PSCA分子。据报道,mAb 1八国集团认识到PSCA的中间部分细胞外领域,氨基酸46 - 8533]。因此,肽在这项研究中的应用是在1 g8抗体识别的部分介绍了作为生物活性片段anti-PSCA PSCA分子和被公认的抗体(34]。氨基酸二肽(SLNCVDDSQDYYVGK) 67 - 81 PSCA蛋白。这种肽也有免疫原性属性和被认为是一个氨基酸序列,能够引起抗体的生成(35,36]。噬菌体ELISA检测,对这两个孤立的scFv片段特别绑定到相应的肽相比,控制多肽。细胞增殖试验的结果表明,治疗du - 145细胞与不同浓度的C5-II scFv导致显著抑制细胞生长与未经处理的细胞。DU145细胞生长抑制61%时获得500 scFv /细胞已被使用。但是,没有增长的抑制作用PSCA-negative LNCaP细胞观察。治疗DU145细胞scFv C5-I没有诱导抗增殖效果。顾的类似的研究等。32],anti-PSCA单克隆抗体的影响1 g8 PSCA-transfected前列腺癌细胞的增殖,LNCaP-PSCA细胞株,研究。LNCaP-PSCA细胞的抗体明显抑制细胞生长,表明抗体PSCA-expressing细胞的直接影响。Annexin-V /π试验的结果证实了MTT结果和显示的作用机制scFv C5-II。DU145细胞凋亡效应33.80% C5-II处理和未经处理的细胞凋亡2.74%表示的能力选择scFv抗体诱导前列腺癌的细胞死亡。虽然anti-PSCA单克隆抗体1八国集团也能诱导细胞死亡在PSCA-expressing细胞(32];小尺寸的选定scFv C5-II是一个很大的优势,有助于快速组织渗透。

前列腺癌靶向治疗是临床试验的新方法和一些研究包括针对血管生成、微管蛋白和bcl - 2引发细胞凋亡进行(37,38]。开发抗体高特异性和高亲和性属性翻译到诊所,单链抗体开发针对前列腺抗原。Anti-MUC1 di-scFvs了作为一个有效的靶向放射剂(RIT)提高治疗指数罗切斯特理工学院的航拍等上皮肿瘤的前列腺肿瘤的39]。scFv结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)也公布了其使用在靶向治疗应用程序(40]。功能性单链抗体PSCA将产生前列腺癌的治疗肿瘤的新可能性PSCA表达的一个重要层面以来发现的肿瘤多数前列腺癌患者(3]。操纵肿瘤特异性scFvs通过基因工程使生产抗肿瘤融合蛋白的附加效应函数。这个属性的scFvs使得这些抗体更适用于治疗。据报道,一个anti-PSCA scFv起源于一个单克隆抗体anti-PSCA用于建设嵌合受体能够诱导细胞毒性对PSCA-positive肿瘤细胞(41]。具体anti-PSCA scFv C5-II选择在这个研究是起源于人类抗体库和诱发前列腺癌的细胞死亡提供了一个有前途的前列腺癌治疗的代理。研究结果显示的进一步评估scFv C5-II在前列腺癌的治疗中的应用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢设拉子大学医学科学的财政支持。所写的论文的摘要提取Soghra Abdi(批准号89 - 5433)。

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