人类乳头瘤病毒基因分型和E6 / E7 mRNA表达在希腊女性阴道上皮内瘤、鳞状细胞癌和外阴

文摘

大部分的阴道和外阴的鳞状细胞癌(癌)和上皮内瘤(虚荣和VIN)与HPV感染有关,主要类型16。本研究的目的是确定HPV基因型,以及高风险的E6 / E7 mRNA表达人类乳头瘤病毒(16,18岁,31岁,33岁和45)56组织学标本的虚荣,VIN,阴道和外阴癌。人乳头状瘤病毒被发现在56%的虚荣和阴道癌的50%,71.4%的VIN和外阴癌的50%。E6 / E7 mRNA表达被发现在三分之一的虚荣和所有阴道癌,42.9%的VIN和外阴癌的83.3%。我们的数据表明,人乳头状瘤病毒16是最常见的基因型鉴定徒劳无功,VIN和唯一的基因型中发现阴道和外阴癌的。这些发现可能表明,依照其他研究,mRNA分析可能是有用的在进行病变的风险增加发展为癌症。

1。介绍

人类乳头瘤病毒(HPV)感染的女性生殖道,尤其频繁的世界和它的多数是短暂的,而与此同时,造成的持续性感染致癌HPV负责癌症发展的类型。人乳头状瘤病毒的致癌作用的结果转换能力高风险(人力资源)人乳头状瘤病毒类型的癌基因蛋白E6、E7。高危人乳头状瘤病毒的致癌特性位于E6、E7基因,在细胞分裂如果不当表示解除控制细胞分裂和分化1]。

因果关系的人乳头状瘤病毒感染与宫颈癌的发展已牢固确立。同样的并不一定适用于外阴和阴道鳞状细胞癌(癌),在人乳头状瘤病毒只负责一个较小的比例,即阴道癌的60 - 70% (2,3)和38 - 75%的外阴癌(2,4]。有趣的是,HPV感染与阴道(白)和外阴上皮内瘤的患者中(VIN)(93.6%和84%,分别地。)5]。HPV 16是迄今为止最常见的人类乳头瘤病毒类型识别在阴道和外阴癌和癌前病变6]。以上数据可能会有所不同从人口,人口,据我们所知,没有这样的分析进行了希腊。

当前研究的目的是人类乳头瘤病毒基因分型,以及从hrHPV E6 / E7 mRNA的表达类型(31日16日,18日,33岁和45)在希腊女人虚荣,VIN,阴道和外阴癌的。

2。材料和方法

2.1。研究人口和收集的标本

本研究的样本由56个石蜡包埋组织切片的虚荣,VIN,或阴道和外阴癌的病理实验室获得地区抗癌肿瘤医院的雅典”圣。尼奥斯”。组织deparaffinized,总核酸提取使用自动提取(NucliSENS easyMAG,海勒斯bioMerieux s.a.)。然后,24人乳头状瘤病毒类型进行pcr芯片试验(PapilloCheck HPV筛选,他一一Bio-One GmbH,德国,猫没有。465 060)以及人乳头状瘤病毒16的表达,18日,31日,33岁和45 E6 / E7 mRNA,使用商业实时NucliSENS EasyQ化验(NucliSENS EasyQ HPV 1.1,海勒斯bioMerieux年代。猫没有。290003)。

尽管VIN术语研究改变了国际社会在Vulvovaginal疾病在2004年,我们保持原来的术语是用来在组织学诊断(6]。

伦理道德委员会批准授予了雅典的地区抗癌肿瘤医院”圣。尼奥斯”,所有参与者提供书面知情同意。

2.2。Deparaffinization

15微米的石蜡包埋组织被孵化deparaffinized 100%二甲苯(Applichem GmbH,达姆施塔特,德国,猫没有。10-20/21-38)50°C和100%乙醇洗两次(Applichem GmbH,达姆施塔特,德国,猫没有。64-17-5)。然后,球在室温下干了45分钟。最后,deparaffinized样本与100年消化μL消化缓冲[1毫升TE缓冲1 x(美国加州英杰公司集团。猫没有。12090 - 015年)和5μL Tween20 50%解决方案(美国加州英杰公司corp .),猫没有。00 - 3005)]和5μL蛋白酶K的解决方案(美国加州英杰公司corp .),猫没有。一夜之间,25530 - 049年)在65°C。蛋白酶K于热块报废在80°C 15分钟。

2.3。提取的核酸

组织样本被裂解缓冲(NucliSENS裂解缓冲,海勒斯bioMerieux年代。猫没有。200292)30分钟,然后总核酸提取了场外的协议与NucliSENS easyMAG平台(海勒斯bioMerieux s.a.),根据制造商的指示。核酸是筛选了55年μL(洗脱缓冲。DNA质量测试是使用人类的球蛋白,β,底漆工具包(箴言生物科技有限公司、南旧金山,CA)根据制造商的指示。评估RNA的完整性,5μg的RNA样本1% formaldehyde-agarose凝胶分离。

2.4。人乳头瘤病毒基因分型(PapilloCheck HPV DNA微阵列)

使用的PapilloCheck hpv筛选。这项技术是基于特定类型的DNA芯片识别24类型的人乳头状瘤病毒(6 18高风险和低风险的类型)。E1-based PCR进行根据制造商的指导方针。对于每个样本,我们混合19日8μL PapilloCheck MasterMix 0 2μL HotStarTaq + DNA聚合酶(5 U /μL,试剂盒,猫没有。203605)和5μL组织样本的DNA。杂交是紧随其后的是混合30μL PapilloCheck杂交缓冲的新鲜反应管5μL PCR产品在室温和转移25μL杂交组合到每个舱的芯片。我们孵化芯片在室温下15分钟在潮湿的气氛中。芯片被3清洗解决方案,在5000转离心3分钟,CheckScannerTM扫描。

2.5。人乳头状瘤病毒E6 / E7 mRNA表达(NucliSENS EasyQ HPV检测)

一个商业实时NucliSENSEasyQ1.1试验(NucliSENS EasyQ HPV,海勒斯bioMerieux年代。猫没有。290003)进行的定性检测人乳头状瘤病毒E6 / E7 mRNA五hrHPV类型(33岁,16,18日,31日和45)根据制造商的指示。首先,三个预混料是由添加试剂领域稀释剂(Tris-HCl, 45% DMSO)试剂领域(核苷酸、dithiotreitol MgCl2)。在每个预混料,我们添加了U1A / HPV 16日HPV 33/45,或HPV 18/31底漆和分子信标混合,氯化钾股票的解决方案,和NASBA水。其次,10μL的预混料是分发给每一个在反应板,以及5μL核糖核酸。板块孵化了4分钟在65°C的RNA二级结构的稳定,其次是冷却41°C。酶的反应是由加法(AMV-RT,核糖核酸酶H, T7 RNA聚合酶,和牛血清白蛋白)和实时测量使用Lambda 600 FL荧光读者(Bio-Tek Winooski, VT) 41°C 2小时30分钟。

2.6。统计分析

使用SAS v9.0我们的数据进行了分析。绝对和相对频率被用来根据年龄和组织学显示HPV流行。卡方测试进行评估统计学意义的患病率的差异。t以及,以及相关的描述性统计(平均值、标准差和均值的95%置信区间)比较平均年龄患者根据人乳头状瘤病毒的流行和组织学。在所有统计测试,5%使用水平的意义。DNA之间的一致性和信使rna测试是评估使用科恩kappa统计。

3所示。结果

3.1。阴道上皮内瘤变和阴道鳞状细胞癌

这组由18徒劳的患者(平均年龄46.2岁)和4癌患者(平均年龄61.3岁)。8徒劳的病例分为虚荣我和10徒劳II / III。HPV感染中检测出56%的虚荣(10/18)和50%的阴道癌(2/4)。可检测HPV DNA从24的至少一个基因型在75%(6/8)的病例被发现的虚荣我和40%(4/10)的虚荣II / III。徒劳的情况下,HPV感染的存在显著相关,年轻患者年龄(38.7和55.6年,)。

hrHPV类型被发现在70%(7/10)和lrHPV类型在30%(3/10)的徒劳的病例。只在阴道癌发现hrHPVs (2/2)。多种HPV类型只出现在一个案例中(一个虚荣II / III示例包含33人乳头状瘤病毒和53)。

最常见的HPV基因型是徒劳的HPV 42我样品(3/6例,50%),其次是HPV 16(2/6例,33.3%)和HPV 39(1/6例,16.7%),而徒劳HPV16和HPV33最常见类型II / III(2/4例,50%)。HPV 16是唯一类型与HPV-infected阴道癌(2/2例,100%)。

关于hrHPV类型16,18日,31日,33岁,45岁,33.3%(6/18)的虚荣和阴道癌的50% HPV DNA阳性至少一个以上的类型。五的检出率hrHPV类型样本提供不同等级的虚荣和癌的女性在图1。

阴道癌(4/4)和60%(6/10)的虚荣II / III是积极的人乳头状瘤病毒E6 / E7 mRNA的表达。这是统计上显著高于虚荣我样品,没有人乳头状瘤病毒E6 / E7 mRNA表达检测(和),分别(图1)。

hrHPV类型的表达式模式16,18岁,31岁,33岁和45岁的徒劳的品位和癌,总结在表1。

人乳头状瘤病毒DNA检测之间的一致性(PapilloCheck DNA微阵列)和人乳头状瘤病毒E6 / E7信使rna测试(NucliSENS EasyQ HPV检测)结果是可怜的虚荣的患者我(75%;卡巴0.00)和阴道癌(50%;卡巴0.00),而这是有利于患者徒劳II / III (80%;卡巴0.62)(表2)。

3.2。外阴上皮内瘤变和外阴鳞状细胞癌

我们与VIN包括28例,其中一半有低度病变(平均年龄35岁)和6外阴癌患者(平均年龄62.5岁)。VIN病例与地衣sclerosus无关,分化外阴上皮内瘤变或鳞状细胞增生。PapilloCheck DNA微阵列检测HPV感染VIN样本的71.4%(20/28)和50%的会阴部的癌(3/6)。从24的至少一个基因型人乳头状瘤病毒DNA检测和VIN 64.3%(9/14)的女性,和78.6%的VIN II / III (11/14)。在VIN情况下,HPV感染的存在与年轻患者年龄(31.7和43.1年,)。

PapilloCheck化验检测hrHPV感染所有VIN病例和外阴癌。多个发现感染5例(3 VIN我情况下包含HPV 6/16, HPV 6/16/59和11/59,分别地。,2 VIN II / III案件包含人乳头状瘤病毒和人乳头状瘤病毒16/51/66 16/53,职责)。

最常观察感染HPV16和HPV59 VIN我样品(4/9例与多个感染HPV 6/16/59每一个案例中,55.6%),而VIN HPV16是最常见的基因型II / III(9/11例,81.8%),其次是类型18日,51岁,52岁,53,66(1/11例,9.1%)。在患有乳腺癌外阴癌,只有人乳头状瘤病毒16在场(3/3例,100%)。

关于hrHPV类型16,18日,31日,33岁,45岁,53.6%(15/18)的VIN和50%的会阴部的癌是HPV DNA阳性至少一个以上的人乳头状瘤病毒类型通过PapilloCheck DNA微阵列。五的检出率hrHPV类型样本提供不同等级的VIN和癌的女性在图2。

VIN样本的42.9%(12/28)和83.3%的会阴部的癌(5/6)是积极的人乳头状瘤病毒E6 / E7 mRNA的表达。有更高的患病率E6、E7 mRNA表达患者就让病变如图2。检测的差异之间的E6 / E7 mRNA表达VIN我和外阴癌是统计学意义()。

HPV16最常见类型显示了NucliSENS EasyQ HPV检测在VIN, VIN II / III,外阴癌(4/4情况:100%,6/8例:75%,3/5例:60%,resp)。(表1)。

人乳头状瘤病毒DNA检测之间的一致性(PapilloCheck DNA微阵列)和人乳头状瘤病毒E6 / E7信使rna测试(NucliSENS EasyQ HPV检测)结果很好样品分为VIN我(92.9%;k = 0.84),但贫困患者VIN II / III (57.1%;k = 0.09)。的样本分类外阴癌,和合是公平(66.7%;k = 0.33)(表2)。

4所示。讨论

本研究的目的是探讨人乳头状瘤病毒类型和人乳头状瘤病毒E6 / E7 mRNA表达与上皮内瘤变和阴道和外阴鳞状细胞癌。这是第一个研究报告与致癌HPV感染之间的关系表达式和vulvovaginal疾病在希腊女性。

HPV感染的作用在外阴上皮内瘤、鳞状细胞癌,已经确认通过多种研究。虽然类似的联系存在于阴道癌前和恶性病变,这尚未牢固确立。这部分是由于虚荣和阴道癌比会阴部的和颈椎不太常见,由于缺乏敏感转换区和角质化的阴道粘膜的保护作用[7]。此外,有可能是徒劳的病变的比例仍未确诊的无症状和不容易想象在一次例行妇科检查(5]。尽管如此,我们希望徒劳的爆发和VIN情况下,以及外阴和阴道癌,尤其是在年轻女性(8,9]。这被认为是由于不仅人乳头状瘤病毒的快速传播,但也增加妇科监测和诊断技术的提高,针对宫颈病变的识别。

正如上面提到的,一些研究曾描述了人乳头状瘤病毒患病率和基因型分布在VIN和外阴癌(3,4,10- - - - - -16]。当前研究的结果通常是类似全球VIN和外阴癌观察数据虽然有些差异。在我们的研究中,整个人乳头状瘤病毒患病率为71.4% VIN和外阴癌的50%。最近国际14元分析研究在63年阴道和外阴病变的研究报道,在VIN整个人乳头状瘤病毒患病率在外阴癌(84.0%和40.4%5]。类似的结果被其他研究报告显示HPV流行的VIN的79.6%和40.1%在外阴癌(15,16)(表4)。

根据我们的结果,hrHPV感染最常在VIN我情况下观察到。这是相反的数据从一个年长的研究(3),低风险(lr)人类乳头瘤病毒是最常见的类型。人类乳头瘤病毒16和人乳头状瘤病毒59在VIN我最频繁的两个基因型,占35.7%,而在最近的国际荟萃分析HPV 6被发现最常见的基因型(5]。人乳头状瘤病毒16是迄今为止最常见类型在VIN II / III和外阴癌在我们的研究中,占64.3%,类似于其他报告(4,14)(表4)。

35.7%的VIN我样品存在hrHPV(33岁,16,18日,31日和45)这上升到71.4%在VIN II / III样本。这个预计hrHPV感染的女性更有可能发展为高档病变。有趣的是,hrHPV降至50%的比例在会阴部的精原细胞。这表明病毒是目前只在非常低的副本数量和/或只有一个特定地区的病毒DNA整合到宿主基因组(17]。

在我们的研究中,HPV流行徒然样本是56%。这明显低于那些报道De Vuyst et al。(93年,6%)和史密斯et al。(95.6%)。在阴道癌,人乳头状瘤病毒患病率为50%。这是低但更与上述研究中发现(65.5%和69.9%,分别地。)5,15)(表3)。

在世界范围的荟萃分析,最常见的基因型HPV 16日,56岁的患者和51虚荣我病变,HPV 16, 18日,58那些虚荣II / III,和人乳头状瘤病毒16,18日和31日在那些阴道癌(5)(表3)。在我们的研究中,我们发现,在减少订单,HPV 42岁,16岁,我39徒劳的情况下,人乳头状瘤病毒16日,33岁和53徒然II / III,在癌病例,和人乳头状瘤病毒16。有趣的是,人乳头状瘤病毒18并不确定在任何我们的虚荣或鳞状细胞癌样本,而不是在其他地方见过什么,这可能是一个地理变异,需要进一步调查。另一种变异,可能归因于不同样本的人口,是HPV 42岁lrHPV类型,最常被类型白费了我,而在De Vuyst等人的研究和史密斯et al .,未发现lrHPVs低度病变(5,15]。

相反在会阴部的样本,检测患者的比例hrHPV(31日16日,18日,33岁和45)逐渐增加的年级阴道病变进展。

使用NucliSens EasyQ HPV检测,我们调查了人乳头状瘤病毒癌蛋白表达在不同等级的发育不良和癌。E6 / E7信使rna测试的结果与等级的病变有关。hrHPV率最低的类型(16、18日31日,33岁和45)E6 / E7 mRNA表达是低级的患者会阴部的病变(VIN),而更高的利率被认为中高档病变(VIN II / III),这是按照什么是在宫颈病变(18- - - - - -20.]。VIN我病变可能检测到E6 / E7 mRNA表达的一个潜在的进步档次病变和恶性肿瘤,因此,E6 / E7 mRNA表达可以作为筛选标记为更好的监测在这个子类的女性。有趣的是,所有的五个高危类型E6 / E7 mRNA表达中检测出低级的阴道病变(虚荣)。上述结果可能表明虚荣我可能不是严格意义上的癌前疾病,同时,他们反映大多数人乳头状瘤病毒感染的瞬态性质。相反,VIN II / III,虚荣II / III,阴道和外阴癌显示盛行的E6 / E7 mRNA的表达。尤其是VIN II / III, E6 / E7 mRNA表达的利率,我们发现明显高于所发表之前(57.1和38.1%)[21]。

在我们的系列中,有一个明显高于检测HPV 16的NucliSens EasyQ HPV检测相比其他hrHPV类型对阴道和外阴的病例。这表明HPV 16可能与不同性质的持续感染和阴道和外阴癌蛋白表达在人乳头状瘤病毒类型相比,18日,31日,33岁和45。

DNA和mRNA分析的基础上,从人乳头状瘤病毒DNA检测更频繁地在会阴部的低度病变比E6 / E7 mRNA的表达。这些数据可能反映了游离状态或低数量的副本的病毒。然而,E6 / E7 mRNA表达的VIN我甚至可能表明hrHPV oncogenically活跃之前产生可检测细胞的变化(17]。

阴道高档病变和癌、外阴癌、较高的E6 / E7 mRNA表达观察,与人乳头状瘤病毒DNA。这表明E6 / E7癌基因蛋白的存在是一种特定的标志高档病变。虚荣II / III有意思的是,2例,1例VIN II / III,阴道癌2例,仅2例外阴癌正mRNA的表达。这可能是解释这一事实总病毒DNA整合到宿主基因组中,因此,它不能被探测到的DNA测试。重要的是要注意,在会阴部的高档病变检出率较高的HPV病毒的DNA观察相比,E6 / E7 mRNA的表达。这些结果可能是由于病毒转录活动水平很低。

样品在我们的研究相对较少,主要是由于发病率低的外阴和阴道上皮内瘤和癌。因此,我们只能提供粗略估计每个人乳头状瘤病毒类型的相对重要性关于阴道和外阴的癌症和癌前期人口。

我们研究的另一个局限性是外阴癌的组织学类型并不可用,所以组织学类型之间的相关性和人乳头状瘤病毒感染是不可能的。然而,有人建议,分化角质化癌,更频繁地发生在老年女性,不是与HPV感染有关,而nonkeratinizing癌,主要影响年轻女性,由于hrHPV感染(22]。这是间接地证实了在我们的研究中,HPV感染是年轻女性更容易被发现。

5。结论

本研究描述了生殖器HPV的检测率和归因类型,以及E6 / E7 mRNA的表达上皮内瘤和阴道和外阴鳞状细胞癌在希腊女性。总之,我们的结果表明,一个非常重要的人乳头状瘤病毒与VIN,虚荣,和阴道/外阴癌,和人乳头状瘤病毒16占大多数患有乳腺癌病例。某些情况下的会阴部的低级别病变阳性E6 / E7 mRNA表达也是感兴趣的,因为它可以识别这些更清楚的癌前病变。惊人的增长尤其在VIN在年轻女性的发病率已经报道在过去几十年在一些人力资源的国家(8,23,24]。

需要进一步的研究来更好地评估mRNA的角色测试作为一种分子标记对阴道和外阴的致癌作用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢滨Margaroni女士她继续支持和热情。这个项目得到了地区抗癌肿瘤医院的雅典”圣。尼奥斯”,雅典,希腊。

引用

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