饮食限制促进血管成熟在鼠标星形细胞瘤

文摘

成熟血管内皮细胞包含一个与周围鞘的周/血管平滑肌细胞(VSMCs)。肿瘤血管不成熟和缺乏周皮细胞鞘。Colocalization血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)和血小板源生长因子受体β(PDGF-Rβ)减少外膜细胞ensheathment肿瘤的血管。我们发现30%的饮食限制(DR)增强血管成熟在鼠标CT-2A星形细胞瘤。减少博士在星形细胞瘤微血管密度和VEGF的表达,同时增加招聘的周,阳性alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma)。此外,降低VEGF-R2 colocalization博士和PDGF-Rβ,但没有减少总PDGF-Rβ表达式。这些发现表明,促进血管正常化博士通过防止VEGF-induced抑制PDGF的信号在周轴。博士似乎肿瘤脉管系统从漏水的不成熟状态转移到一个更成熟的状态。我们建议船标准化可以提高交付脑部肿瘤的治疗药物。

1。介绍

肿瘤血管化肿瘤进展的关键,为肿瘤提供营养和氧气(1- - - - - -3]。vessel-forming内皮细胞的增殖是肿瘤生长的限制因素(4- - - - - -7]。因此,针对肿瘤血管增殖减少血流量和养分有效性,从而减缓肿瘤的生长(8]。肿瘤诱导宿主血管增生性血管反应通过影响血管生成的局部平衡监管机构、病原反应步骤称为血管生成开关(9,10]。血管生成刺激器的控制生产和缺乏抑制剂有利于血管增长10- - - - - -12]。

与周围正常组织血管包含一个内皮细胞鞘的周/血管平滑肌细胞(VSMCs) [13]。与健康的血管,肿瘤血管不成熟,经常mal-shaped,不规则,有曲折的结构漏水的内皮细胞衬里(13,14]。血管成熟的过程包括ensheathment新生血管性豆芽α-smooth-muscle-actin - (αsma -)积极的周(15]。接触周围的周内皮细胞和内皮细胞功能发挥积极作用和血流量调节15- - - - - -17]。成熟的血管包含各种收缩蛋白包括αsma,常常被用来作为一个外膜细胞标记15,18,19]。

肿瘤血管的不稳定性与缺乏平滑肌细胞鞘(11]。异常在肿瘤血管形态和结构不仅影响药物输送,还可以促进转移性传播(20.,21]。虽然看上去血管数量的增加将为肿瘤提供足够的氧气,异常血管提供更少的氧气导致肿瘤缺氧环境(13]。这将进一步刺激肿瘤生长和异常的血管生成22,23]。血管内皮生长因子(VEGF)和血小板源生长因子(PDGF)信号驱动器血管生成和血管周的招聘细胞围绕着新成立的血管(24]。VEGF促进内皮细胞迁移、增殖、生存,渗透率,腔的形成,已成为抗血管新生疗法的主要目标(13]。堵塞的VEGF信号诱发血管正常化和抑制新血管生长(16)。除了修剪的不成熟的血管,抑制VEGF的表达也会增加细胞外膜细胞覆盖率和血管成熟(25,26]。

血小板源生长因子(PDGF)坐标通过PDGF-R周皮细胞血管芽的报道β对血管平滑肌细胞(27]。Greenberg等人表明,除了刺激内皮细胞增殖,VEGF也通过其抑制新血管形成能力破坏血管平滑肌细胞功能(24]。具体来说,VEGF可防止外膜细胞新生血管芽的报道导致船不稳定。VEGF VEGF-R2抑制PDGF-R激活β在VSMCs信号通过一个复杂的装配组成的两个受体。抑制VEGF-R2阻止这种受体复杂的形成和恢复组织血管生成。此外,肿瘤细胞VEGF基因删除也扰乱了受体复杂,因此会增加肿瘤血管成熟。这些研究结果非常重要,因为它们揭示两个角色VEGF信号作为促进内皮细胞功能和VSMCs的抑制剂和血管成熟24,26,28,29日]。

肿瘤细胞的VEGF表达更大比正常细胞(30.- - - - - -33]。降低VEGF表达减少血管生成同时增加血管成熟(24]。穆克吉等人表明,30%的饮食限制(DR)抑制血管生成和减少前列腺肿瘤的生长34]。我们博士表明,在小鼠减少微血管密度在实验老鼠和人类大脑肿瘤(35,36]。Powolny等人变弱博士表明,肿瘤的生长,减少血管密度。他们还发现,40%的博士显著降低VEGF基因和蛋白质表达在大鼠前列腺肿瘤37]。这些博士的研究表明,可能是一个可行的无毒的治疗方法来管理恶性大脑肿瘤的生长,减少肿瘤血管生成,增加长期生存在老鼠轴承orthotopically植入肿瘤(35- - - - - -38]。

博士是由限制总热量的内容管理的主题。然而,区别于饥饿博士是不会引起厌食症或营养不良34,39- - - - - -42]。重要的是要注意,减少卡路里,而不是食物的macronutritional内容,证明最重要的生产减少限制肿瘤生长和血管生成的影响(34,39]。尽管先前的研究表明,饮食限制反血管增生发起在肿瘤早期开发时,没有之前的研究已经确定了饮食限制的机制有效地纠正脉管系统。

博士在本文中,我们表明,提高船舶的成熟和稳定的高度血管CT-2A鼠标星形细胞瘤。除了降低VEGF的表达,我们博士还发现,与PDGF-R VEGF-R2 colocalization降低β。我们的研究表明,博士传授其反血管增生和血管成熟影响CT-2A通过减少肿瘤VEGF表达促进VSMC ensheathment血管芽。

2。材料和方法

2.1。老鼠

的C57BL / 6 j小鼠品系从杰克逊实验室获得(美国我巴尔港)。老鼠传播的动物保健设施波士顿大学的生物系,使用前面描述的畜牧业条件[43]。雄性老鼠(8 - 10周的年龄)被用于研究和提供食物随意(AL)或在限制条件下(如下所述)。水随意提供给所有的老鼠。动物的房间被保持在22°C,和棉花嵌套垫提供了额外的温暖。所有动物实验伦理委员会批准按照美国国立卫生研究院的指导的护理和使用实验动物机构护理委员会批准。

2.2。脑部肿瘤模型

的同源的CT-2A实验小鼠大脑肿瘤生成的植入我们实验室20-methylcholanthrene C57BL / 6小鼠的大脑皮层的过程齐默尔曼(45,46]。组织学上,CT-2A脑瘤大致归类为低分化高度恶性间变性星形细胞瘤(46]。肿瘤生长orthotopically软,noncohesive,高度vascularised质量。

2.3。颅内肿瘤植入

CT-2A肿瘤植入大脑皮层的C57BL / 6 j小鼠使用套管针作为我们之前描述的47,48]。简单地说,老鼠与戊巴比妥麻醉(兽医实验室公司)腹腔内和他们的头被剃在无菌条件下,用70%酒精擦洗。小CT-2A肿瘤碎片(1毫米³)从C57BL / 6 j供体小鼠植入正确的麻醉大脑半球受体小鼠正如我们最近描述(48]。所有的老鼠从手术中恢复,回到笼子里当完全活跃。从完整的肿瘤的肿瘤的起始部分比开始从培养细胞碎片已经包含一个确定的微环境,促进肿瘤的生长。

2.4。饮食限制(博士)

老鼠分离前的开始实验,随机分配到对照组是美联储AL或者一个实验组,美联储是一个总饮食限制(博士)的30%。每只小鼠单独住在一个塑料鞋盒笼过滤器顶部和被棉花嵌套垫取暖。博士启动肿瘤植入后2天,植入后持续了11天。总保持一个常数比博士的营养能量;即平均每日食物摄入量(克)AL喂老鼠决定每隔一天和DR-fed老鼠每天数量的70%。所有老鼠收到PROLAB chow (Agaway Inc .),它包含一个鼠标的营养成分和平衡,根据制造商的规范,提供4.4千卡/克总能量。身体重量的老鼠记录每隔一天。

2.5。肿瘤的生长和组织学

颅内肿瘤的生长分析直接通过测量总肿瘤湿重。肿瘤从正常脑组织解剖,被冻结,然后是重的。肿瘤样本的组织学中性缓冲福尔马林固定在10%(σ)和嵌入石蜡。他们5点分段μ米,苏木精和伊红染色,光学显微镜检查。

2.6。测量血浆葡萄糖和脂质

老鼠与异氟烷麻醉(卤烃实验室、河流边,新泽西,美国)和安乐死放血,涉及收集的血液从心脏肝素化管。血液是离心10分钟6000克、等离子体收集,整除被储存在−80°C到分析。血浆葡萄糖浓度测定的分光光度计使用Stanbio酶葡萄糖过程(Stanbio)。高效薄层色谱法被用来评估根据我们的标准程序(血浆脂质49]。

2.7。免疫印迹分析

冷冻CT-2A肿瘤和正常侧脑组织均质裂解缓冲,在冰上。溶菌产物被转移到埃普多夫管,混合在一个摇臂在4°C 1 h,然后离心20分钟。收集上清液,和蛋白质浓度估计使用Bio-Rad detergent-compatible蛋白质分析。大约25μg从每个组织样本总蛋白质的变性和sds - page样品缓冲和解决与sds - page Bis-Tris凝胶4%到12%(表达载体)。蛋白质被转移到一个聚乙二烯二氟化物止动剂TM-P膜(微孔)在一夜之间在4°C和阻塞在5%脱脂奶粉在TBS渐变20 (pH值7.6)在室温下1 h。膜与初级抗体探测一夜之间在4°C温柔的颤抖。这些墨迹被适当的二次抗体孵育1小时在室温下,乐队和可视化与化学发光。每个膜被剥夺和reprobedβ肌动蛋白作为内部加载控制,并表示蛋白质的比例β肌动蛋白被扫描微密度分析。

2.8。抗体和试剂

抗体得到对αsma(σ),β肌动蛋白(细胞信号),第八因子(Dako) PDGF-Rβ(Santa Cruz), VEGF-R2 (Santa Cruz),和VEGF (Santa Cruz)。

2.9。共焦显微镜

免疫组织化学研究,组织部分deparaffinized,水化,洗。组织部分被热处理(95°C)抗原暴露的解决方案(美国向量实验室,伯林盖姆,CA) 30分钟。组织部分被封锁在山羊血清(PBS) 1: 10 1 h在室温下,治疗主要抗体,其次是二次抗体治疗。没有相应的组织部分主要抗体作为消极的控制。共焦显微镜,数码图像得到在徕卡DMI6000倒范围配备徕卡TCSSP5共焦系统,使用HCX PL APO 409/1.25石油和HCX PL APO 639/1.4 NA NA石油客观的镜头。徕卡共焦软件被用来获取图像。

为αsma和VIII因子immunoflourscent染色,部分被孵化的鸡尾酒αsma和VIII因子主要抗体(1:100)阻断缓冲区1 h在室温下,紧随其后的是鸡尾酒alexafluor 585年和488年,共轭anti-mouse anti-rabbit,分别二次抗体(1:200)在室温下了45分钟。

colocalization VEGF-R2和PDGF-Rβ,部分被孵化的鸡尾酒VEGF-R2 PDGF-R2主要抗体(1:100)在4°C阻断缓冲区在一夜之间,紧随其后的是鸡尾酒alexafluor 585年和488年,共轭anti-mouse anti-rabbit,分别二次抗体在1:200稀释了45分钟。其他条件都是如上所述。

2.10。免疫组织化学

组织部分处理类似的共焦显微镜。部分与VEGF治疗,PDGF-Rβ一夜之间,VIII因子主要抗体在4°C接着用生物素化的anti-rat二级抗体在1:100稀释(向量实验室、公司)。部分被用抗生物素蛋白生物素治疗复杂之后,3,3-diaminobenzidine作为基质染色根据制造商的协议(Vectastain精英ABC工具包,向量实验室,Inc .)。与苏木精复染色的部分和安装。没有相应的组织部分主要抗体作为消极的控制。蔡司Axioplan 2光学显微镜是用来捕捉图像具有亮。

3所示。结果

3.1。饮食限制减少了体重、血糖和颅内肿瘤的生长

博士组表现出平均体重减少22±1%,肿瘤平均减少76±4%。平均肿瘤湿重显著降低DR-fed老鼠(51±7毫克)比AL-fed老鼠(209±40毫克);,学生的t以及。血糖水平(更易/ L)和艾尔博士老鼠8.6±0.6,4.4±1.0,分别为(,由双尾t以及)。博士小鼠的血糖水平降低,我们之前显示(36,50]。未发现显著差异之间的半岛和老鼠博士分布的主要脂质包括胆甾醇酯、胆固醇、甘油三酯、磷脂酰胆碱(数据没有显示)。下鼠标活动水平增加膳食能量限制。这是证据确凿的现象,发生在所有老鼠当放置在热量限制和增加是由于觅食51]。很难确定是否增加身体活动导致心理压力。能够很好的证明,一般健康和健身大幅提高小鼠和充足的营养(营养不良时51,52]。重要的是要注意,所有肿瘤植入增长在博士和基地组织,表明饮食限制没有抑制肿瘤。这项研究证实了以前的观测,抑制CT-2A肿瘤生长博士(36]。

3.2。饮食限制减少微血管密度和大出血CT-2A星形细胞瘤

博士)染色法是用来评估的影响在CT-2A出血性血管(图1(一))。亮粉红色染色显示正常脑组织。明亮的粉红色染色发现CT-2A肿瘤组织内显示出血性血管。出血性血管的数量DR-fed老鼠的肿瘤明显低于AL-fed老鼠的肿瘤。血因子免疫组织化学博士是用来评估的影响血管内皮细胞的密度。Factor-VIII-stained内皮细胞的数量明显减少的部分肿瘤从AL-fed DR-fed老鼠比老鼠,表明减少微血管密度(数字1 (b)和1 (c))。

3.3。饮食限制增加成熟的血管CT-2A星形细胞瘤

共焦显微镜是用来确定博士对定位的影响αsma和VIII因子在血管CT-2A(图2)。αsma(红色)是用来标记血管平滑肌细胞(VSMC) / perictye覆盖的血管,和VIII因子(绿色)被用来作为内皮细胞的标记。VSMCs定位(红色)与内皮细胞衬里(绿色)是更大的肿瘤血管AL-fed DR-fed老鼠比肿瘤血管的老鼠。这些发现表明,增强了VSMC博士/ perictye CT-2A肿瘤血管的报道。

3.4。饮食限制增加αsma表达和降低血因子表达在CT-2A星形细胞瘤

免疫印迹分析是为了检查博士的相对表达的影响αsma和VIII因子在肿瘤血管。VIII因子表达明显降低αsma表达明显高于在CT-2A肿瘤生长在DR-fed老鼠比生长在AL-fed老鼠(图3)。的比例αsma VIII因子显著更大的肿瘤小鼠博士比老鼠(图3)。增加这个比例在老鼠博士相比AL组表明减少内皮细胞增殖,同时增加周皮细胞/ VSMC船舶保险。

3.5。饮食限制降低VEGF表达的CT-2A星形细胞瘤

免疫组织化学是用来确定饮食限制的影响当地CT-2A VEGF的表达。棕色的VEGF染色强度和DR-fed肿瘤的老鼠数量明显少于AL-fed肿瘤的老鼠(图4)。这些发现与等离子体的前期研究结果一致表明降低VEGF表达[博士35,36]。

3.6。饮食限制减少PDGF-Rβ和VEGF-R2协会CT-2A星形细胞瘤

共焦显微镜显示黄色染色,表明colocalization PDGF-Rβ(红色)和VEGF-R2(绿色),少AL-fed DR-fed老鼠相比,肿瘤的老鼠(图5(一个))。免疫印迹分析表明PDGF-Rβ表达类似于肿瘤DR-fed和AL-fed老鼠(图5 (b))。

4所示。讨论

我们发现第一次,博士可以加强在恶性肿瘤血管成熟鼠标星形细胞瘤。博士不仅减少血管生成,但也增加了血管外膜细胞ensheathment在高度血管CT-2A星形细胞瘤。博士减少内皮细胞增殖,减少染色显示VIII因子、内皮细胞的标记。我们还观察到一个增加的外膜细胞和血管平滑肌细胞的报道在血管内皮细胞衬里,的增加αsma、VSMCs的标志和VSMC-like周。这是明显的增加的比例αsma相对于第八因子。我们的研究[博士同意先前记录的抗血管新生的影响34- - - - - -36,53]。肿瘤组织化学染色部分与VEGF抗体显示VEGF表达的整体减少DR-treated肿瘤。我们建议观察VEGF的减少导致了反血管增生和血管成熟的影响,通过VEGF-VEGF-R2信号轴。

VEGF-VEGF-R2信号轴是内皮细胞增殖的主要途径(54]。此外,格林伯格等人与VEGF在两个角色。除了作为促进内皮细胞功能,VEGF也作为负调节VSMCs因此船成熟(24]。我们观察到,降低VEGF-R2 colocalization博士和PDGF-Rβ在CT-2A肿瘤。我们还发现博士对PDGF-R没有显著影响β表达式。这些发现表明,块VEGF-R2协会博士和PDGF-Rβ通过降低VEGF,从而防止抑制PDGF信号轴由于colocolization两受体(24]。需要进一步的研究来评估这些信号通路。

一个不成熟和漏水的脉管系统是实体肿瘤的特点55- - - - - -57]。肿瘤脉管系统的泄漏导致间质肿瘤内流体压力升高。通等人表明,肿瘤内部静水压力的增加阻碍药物渗透在肿瘤血管(58]。他们还表明,大分子的渗透到肿瘤是通过统一的周皮细胞血管覆盖比通过与不规则的血管外膜细胞覆盖。我们建议可以提高药物输送到肿瘤博士通过一个类似的机制。丹尼等人发现,限制药物小分子的生酮饮食改善交付到老鼠的大脑。他们发现大脑N-butyldeoxynojirmycin (NB-DNJ)内容是限制大3.5倍生酮饮食+ NB-DNJ老鼠比单独NB-DNJ组博士建议提高药物对大脑的交付。这可能允许一个较低的剂量来达到治疗效果(59]。进一步研究饮食限制大脑血管的影响有必要阐明的机制博士饮食和加强药物输送到大脑。

能够很好的证明,恶性神经胶质瘤患者预后差对大多数(60]。血管生成已成为一个重要的战略的目标在当前治疗(61年,62年]。抗血管新生疗法的目标是减少微血管密度和增加血管稳定(9,60- - - - - -62年]。我们建议博士规范化肿瘤脉管系统通过减少肿瘤VEGF的表达。我们的研究结果表明,成熟smooth-muscle-cell-covered船只更突出的博士在脑瘤在脑瘤喂养。

5。结论

结果表明,限制饮食促进血管成熟在实验老鼠星形细胞瘤。临床前研究表明博士可能是一种有效的无毒性抗血管新生治疗脑瘤。博士也可能改善药脑部肿瘤,因此可能与药物治疗结合使用。

缩写

CT-2A:	鼠标星形细胞瘤
博士:	饮食限制
艾尔:	随意
αsma:	α-平滑肌肌动蛋白
VSMC:	血管平滑肌细胞
VEGF:	血管内皮生长因子
VEGF-R2:	血管内皮生长因子受体2
PDGF-Rβ:	血小板源生长因子受体β。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由国家卫生研究院的基金支持的部分(hd - 39722、ns - 1080 55195和ca - 102135),从1081年美国癌症研究所资助的研究,和波士顿大学费用基金。作者感谢哈佛大学组织病理学核心设施和罗德里克布朗森博士的帮助下,组织处理。他们也感谢约书亚·罗森博格博士,波士顿大学生物系主任成像设备。

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