北葡萄牙青少年和大学女性的致癌HPV类型感染:从自我取样到癌症预防

抽象的

本研究旨在描述葡萄牙青少年和年轻大学女性的HPV感染状况。在使用商业试剂盒对435名脱落宫颈细胞进行自我取样后，通过PCR DNA分型评估HPV基因型的分布。我们观察到HPV感染的总频率为11.5%。此外，在那些自称有性行为的年轻女性中，HPV DNA患病率为16.6%。检测频率较高的HPV类型分别为31、16、53和61。经统计分析确定的中位数年龄(；)，终生性伴侣的数目(；)，以及多年的性行为(；)作为HPV感染的危险因素。因此，我们的研究显示，肿瘤性HPV感染常见于年轻无症状的葡萄牙女性，有2 - 5个性伴侣和超过2年的性活动。此外，这些结果表明，在自我收集的样本中进行HPV检测可能对评估更好的预防策略和监测疫苗接种规划在不同人群中的影响很重要。

1.介绍

生殖器人乳头瘤病毒(HPV)在性活跃的女性中非常普遍。这种感染已被确定为生殖器疣和宫颈鳞状上皮内病变的病因，然而，只有某些类型的人乳头瘤病毒能够诱发宫颈癌的发展[1- - - - - -3.］.

子宫颈癌是癌症导致死亡的主要原因之一，每年约有49.5万名妇女新确诊[4］.在葡萄牙，宫颈癌是第四大癌症，每年有950例新诊断病例和378例死亡，在15至44岁的妇女中发病率第二高[5］.

青少年和年轻成年女性更容易感染HPV。这些观察结果基于宫颈上皮的生物学/生理学差异。在成人中，主要细胞类型为鳞状细胞，而在青少年中，主要细胞类型为柱状和化生细胞[6]然而，大多数HPV感染会自发消退，只有一小部分感染持续存在，低度上皮内病变（LSIL）发展为高度上皮内病变（HSIL），并最终发展为浸润性宫颈癌[7］.现时普遍认为，持续受高危人乳头瘤病毒感染是引致子宫颈癌的必要条件，但并非充分条件[8］.

人类乳头瘤病毒分子检测已在多个国家实施，并已建议作为取代巴氏涂片检测的主要筛查方法[9- - - - - -11］.而HPV DNA检测的阴性预测值和敏感性高于传统的巴氏涂片检查，但在鉴别女性LSIL或癌症方面的阳性预测值较差[9- - - - - -11，它们可能对鉴别无或低风险发生上皮内病变的女性极为有用[12］.

然而，HPV基因分型可以被认为是仅仅比检测的更重要的方法，因为它有助于鉴定预测HPV感染结果的持续感染（上皮内病变或宫颈癌的开发）。一些内部医院和研究中心已经开发了人乳头瘤病毒基因分型方法，这些方法有利于在临床样本中检测和描述人乳头瘤病毒[13，14］.

尽管葡萄牙宫颈癌的发病率和死亡率很高，但到目前为止，还没有实施任何国家筛查计划，也没有足够的HPV感染流行病学数据，尤其是年轻女性。年轻女性筛查计划对于了解HPV的流行病学以及行为和沟通至关重要统一的做法，从而防止感染的传播。青少年应接受有关HPV和相关感染风险因素的教育。因此，还应鼓励他们在开始性活动后获得适当的妇科护理[15，16］.

最近有几项研究报道，从肛门-生殖道自行获得的样本是准确的，适合于HPV-DNA检测，并显示出与临床获得的样本相似的相关性[17，18］.自我取样不需要临床医生进行阴道窥镜检查，因此，它减少了使筛查变得没有吸引力的不适，即使对有机会获得保健服务的妇女也是如此。此外，研究显示，自采集样本的HPV DNA检测的敏感性相当于甚至优于细胞学检测[12，17，19］.

本研究首次采用自我取样的方法对葡萄牙北部地区的青少年和大学女性中存在的HPV进行了描述。

2.研究对象、材料和方法

2．1.研究人群

开展了一项以人群为基础的研究，以获得葡萄牙北部地区HPV感染状况的概况。2010年3月至5月，来自葡萄牙北部地区8所高中和两所大学的14至30岁的女学生被邀请参加了这项研究。获得了美国的伦理委员会的伦理批准大学的费尔南多佩索阿研究包括的所有个人都根据《赫尔辛基宣言》作出知情同意，对于18岁以下的妇女，根据葡萄牙法律，由父母/监护人签署。

这项研究在435名女性(中位年龄17.0±2.46岁)中进行，她们回答了一份匿名的流行病学特征问卷。研究人群根据年龄、初潮年龄(中位年龄12.0±1.34)、教育水平、HPV疫苗接种、性活动()、初次性行为年龄(16.0±1.67)、首次性行为年龄(2.0±2.06)、伴侣数量(表1)1）.

２.２.样本采集

所有的参与者都是志愿者，并通过专门为解释研究和自我取样程序而开发的研讨会被告知该研究。简单地说，使用商业试剂盒通过自我取样收集脱落的宫颈细胞普遍的集合中（UCM）来自Digene（Digene，巴西），包括一个锥形刷子和一个带有输送介质的管，用于稳定样本。自我收集过程包括将无菌刷子插入阴道，直到手指到达阴唇，然后沿同一方向旋转刷子五次，将刷子从阴道中取出，并按照医生的建议放置在UTM中商业套件说明。

２.３.HPV分析和基因分型

样品处理包括离心浓缩细胞，然后使用QiAmp DNA血液迷你试剂盒(QIAGEN, Hilden, Germany)提取DNA，根据制造商说明。用紫外/可见分光光度计测量260 nm处的吸光度来评估DNA质量，用260/280 nm处的吸光度值的比值来评估DNA纯度。

为评估提取方法的有效性，采用PCR方法检测基因组DNA的存在，并利用PCO对β -珠蛋白基因进行扩增_3.引物5′-ACA CAA CTG TGT TCA TAG C-3′和BGII引物5′-GTC TCC TTA AAC CTG TCT TG-3′。

PCR反应在50μL溶液与1x Taq缓冲液，4.0 mM氯化镁₂, 0.2 毫米dNTPs，0.30 μ每个引物，taq聚合酶1 U，基因组DNA 0.2 ug。扩增条件为:DNA模板在95℃变性3 min, 94℃变性1 min, 55℃变性1 min, 72℃变性1 min, 72℃最终延伸10 min，共35个循环。扩增的175个碱基对片段经1.5% (w/v)琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外可见。

采用GP5+/6+两对不同的引物，PCR检测HPV DNA，该引物扩增一个150 bp的区域[20.];MY09/11退化引物，根据HPV类型扩增449-458 bp区域(如之前报道的[1])。这两套引物均可扩增HPV L1基因的高度保守区域，并有可能在单个PCR反应中检测出大量粘膜HPV类型[21］.

用GP5+/6+引物进行PCR扩增反应μL的反应混合物与1x PCR缓冲液，3.0 mM氯化镁₂, 0.2 毫米dNTPs，0.30 μ每个引物的M, 1uTaq.DNA聚合酶，和0.2 ug基因组DNA。热循环如下:DNA模板在95℃初始变性4 min, 94℃变性30 s, 44℃变性60 s, 72℃变性90 s，最后72℃延伸10 min，共40个循环。扩增片段经1.5% (w/v)琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外可见。

用my09 - 9进行PCR扩增反应μL的反应混合物与1x PCR缓冲液，4.0 mM氯化镁₂, 0.2 毫米dNTPs，0.40 μ每个底漆的m，1个单位Taq.DNA聚合酶，和0.2 ug基因组DNA。扩增条件包括在3分钟内在95℃下的初始变性，然后在45℃下为40℃，55℃，45℃，72℃，1分钟，最终延伸步骤72℃5分钟。扩增片段经1.5% (w/v)琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外可见。

采用引物MY09/11扩增的hpv阳性病例通过RFLP分析进行分型，如Nobre等人在2008年所描述的[14］.每个限制性内切酶反应在20μL终体积反应，使用5μMY09/11 PCR产物L, 2μL的10x推荐限制性内切酶缓冲液，每个限制性内切酶的10个单位:PstI (New England BioLabs, R0140S)， HaeIII (Fermentas Inc.， #ER0151，加拿大)，DdeI (New England BioLabs, R0175L)和RsaI (New England BioLabs, R0167S)。在37°C下进行消化5小时。限制性片段经3%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，紫外可见。HPV类型的识别是使用Nobre等人在2008年提出的算法进行的[14］.

HPV阳性的定义是基于MY09/11和/或GP5+/6+ PCR扩增结果。两套引物的不一致结果被送去测序以确认结果。对MY09/11阳性病例进行HPV基因分型，并根据其致癌活性将HPV基因分型分为四组:高危类型(HPV 16, 18岁,31岁,33岁,35岁,39岁,45岁,51岁,52岁,56岁,58岁的和59),可能的高危类型(26日,53岁,66,68,73,82),低风险类型(6、11、13、40,42岁,43岁,44岁,54 - 55,61年,70年,72年,81年和89年),和类型的不确定的风险(30、32、34和64年、62年、67年,69年,71年,74年,83年,84年,85年,86年,87年,90年,91年,97年,102年,106年)(22，23］.

２.４.质量标准

为保证研究质量，确定了以下质量标准:(1)盲法研究;(2)所有PCR反应均纳入阴性对照和阳性对照:阴性对照采用双蒸馏水(dd H₂O)替换反应混合中的模板DNA;作为阳性对照，我们使用了在病毒学服务中用于HPV感染诊断的HPV阳性样本，使用的是商业试剂盒hc2高危型HPV DNA检测（QIAGEN，Hilden，德国）；（3）重复100%的样本以验证结果；（4）由三位作者分别分析PCR和RFLP结果。不一致的结果被发送至sequentiate以确认结果。

2．5．统计分析

采用计算机软件进行统计分析社会科学统计软件包Mac版本16.0 .卡方()检验以比较各组之间的频率。的(Odds Ratio)及其95%置信区间作为分类变量(平均年龄、初潮平均年龄、初次性交平均年龄、教育水平、性伴侣终身数量)与HPV感染状况之间的关联的度量。

3.结果

３．１．人乳头状瘤病毒分布

在435份年轻女性自检样本中检测了HPV的存在，并确定了50例阳性病例。阳性病例包括一例来自没有开始性活动的妇女，以及3例没有提供此类信息的妇女。在进行数据分析时，我们只考虑了被提及有过性行为的女性()，其中HPV感染的患病率为16.6%(46/277)(表2）.

根据年龄、初潮年龄、初次性交年龄、初次性交后年龄、性伴侣数量、文化程度、HPV疫苗接种情况分析HPV感染情况(见表)2）.在比较终生性伴侣数量和HPV感染频率时，我们发现有2-5个性伴侣(29.8%)的人HPV感染频率更高，而开始性活动超过2年的女性HPV感染频率更高(24.0%)。

我们观察到，HPV在大学生中(24.0%)比非大学生(12.8%)更常见。然而，在阳性病例中，非大学生的高危HPV患病率高于大学生(47.9% vs 34.8%)(表)2）.总体而言，共检测到19种不同类型的HPV: 6种高危型(HPV16、18、31、45、56和58);2例可能高危(HPV53和66)，4例低危(HPV6, 54,61和89);7种未知风险(HPV30、32、71、84、86、87和97)3.）.值得注意的是，研究中发现的最常见的HPV类型是高危型，HPV31是最常见的(15.2%)，其次是HPV16 (13.0%)， HPV53和HPV61(8.7%)。

3.2.流行病学特征的风险估计

HPV分布在教育程度、HPV疫苗接种、平均年龄、终生性伴侣数量、首次性交后的年数等方面有统计学差异(见表)4）.我们发现HPV感染与年龄超过17岁的女性之间存在很强的相关性(；95%可信区间1.59 - -7.97;)、有2至5名性伴侣的女性(，95％CI 2.26-8.96，)，以及开始性行为超过2年的女性(， 95%置信区间1.24-4.49，）.

4.讨论

HPV感染是最常见的性传播感染之一和主要的公共卫生问题，特别是在青春期期间[24，25］.大多数HPV感染是无症状的，并被免疫系统有效控制，因此，HPV感染的结局是可变的，感染通常是短暂的，完全解决通常是在12至24个月内[26，27］.然而，持续感染一种或多种致癌性HPV可能导致上皮内病变的出现，可能发展为高度不典型增生，严重者可能发展为浸润性癌[7］.

由于HPV感染在世界范围内的分布以及在不发达国家的高发病率，许多公司都在尝试开发低成本、高效率的检测HPV的检测方法。已建议将自我抽样作为一种有用的工具，用于检测妇女的HPV感染情况，主要针对资源匮乏的人群或难以获得卫生保健的人群[12］.自我取样被认为比医生收集样本检测HPV生殖器感染有更多优点[17］.自我取样是一种成本较低且无创的方法;它减少了一些妇女与医学检查有关的不适，以及使筛查项目不那么愉快的不安，即使是那些有机会获得保健服务的妇女[17，28］.多项研究表明，自我取样对检测低、高等级甚至侵袭性肿瘤病变具有敏感性，相当于甚至优于巴氏涂片[17，18]最近的一项荟萃分析显示，自我抽样具有敏感性≥与医生取样相比，检测HPV感染的特异性为70%，特异性为88%[29］.

尽管样本数量有限，需要进一步的大规模流行病学研究来评估不常见基因型的重要性，但这项研究首次提供了葡萄牙年轻女性中最常见粘膜HPV型谱的观点。

流行病学研究指出，HPV感染在一般人群中的流行率为2%至44%，20至24岁的女性患病率最高[30.，31］.我们的结果显示，HPV阳性病例的总体频率为11.5%(50/435)，考虑到性行为是HPV感染的重要鉴别因素，年轻性活跃女性的频率为16.6%(46/277)。这一频率与其他研究的发现相似，后者指出无症状女性的HPV感染可能在12至31.4%之间，视乎人口而定[32- - - - - -36］.

根据几项研究，与青少年和年轻成年女性的HPV感染相关的行为风险因素包括过早的第一次性行为[24，37- - - - - -39］.然而，在我们的人口样本中，首次性交的年龄似乎不是HPV感染的辅助因素。然而，我们的结果表明，年龄是HPV感染的一个重要因素，它在17岁以上的年轻女性中比年轻女性更常见。再一次，这些结果与其他几项研究一致，即HPV感染在性活跃的年轻女性中始终更常见[40］.

终生性伴侣的数目被认为是人类乳头瘤病毒感染的主要危险因素之一[39，在我们的研究中，我们观察到拥有一个以上性伴侣(2到5个)的女性与HPV感染的可能性增加有关。此外，我们观察到在开始性行为超过2年的女性中感染的可能性增加。

目前的结果表明，比较有关教育水平和HPV疫苗接种的HPV分布的差异。自从第一步性交年龄为16.0岁以来，预计大学生有多年的性生活比非大学生。因此，它们将更频繁地暴露于比无情的学生的HPV感染。关于HPV疫苗接种，由于葡萄牙的国家疫苗接种计划开始在2年前为13至18岁的女孩纳入HPV疫苗，预计这些女孩将受到保护免受HPV感染。因此，我们的数据与这些证据相关，并且疫苗接种可以通过HPV有效地减少感染。

尽管有这些重要的流行病学数据，但在人群中确定HPV基因型频率被认为是更加必要的。HPV诊断分析，如混合捕获第二代（HC2）和基于PCR的方法，使用共有引物MY09/11和GP5+/6+，可以检测大量HPV类型，主要是高危类型[28］.这些引物已被广泛用于研究hpv的自然历史及其在宫颈癌发展中的作用[28，41］.

在我们的研究中，我们使用了Nobre等人描述的基因分型方法。2008年，允许良好的粘膜HPV类型辨别，包括通过当前诊断方法下降的几种HPV类型。我们的数据显示，高风险的HPV类型是最常见的，HPV31和HPV16具有更高的频率。令人惊讶的是，HPV31被发现是我们研究中最常见的。最近的荟萃分析表明，HPV31可以是欧洲女性患有正常细胞学的第二种或第三种最常见的类型[40，42］.尽管HPV18在世界范围内是一种流行型，也是与宫颈癌发展相关的第二常见高危型，但在我们的研究中它并不是更常见的类型。然而，HPV 18感染会导致子宫颈癌迅速发病[43]，预计在高档病变中比在无症状的年轻女性中更常见。值得注意的是，在大多数当前商业测定（HPV 34,53,61,62,66,67,70,71,73,81,83,84和102）中未检测到未检测到的13种粘膜HPV类型被检测到本研究。

关于我们的结果，我们必须考虑到，在公开邀请所有参与者参与研究后，所有参与者都是志愿者，并通过专门为解释研究和自我取样程序而开发的研讨会被告知该研究。我们不能排除两个因素的影响，一是在校生对人乳头瘤病毒的了解较多，二是感染人乳头瘤病毒风险较高的受试者害怕被检出阳性。然而，我们确实认为这些因素的影响降低了，因为知道HPV结果是可选的，而且只有在妇科医生的监督下。此外，我们的参与率不受测试费用的限制(对所有参与者都是免费的)。

分子病理学方法已被证明在改善癌症和遗传或病毒相关疾病的筛查、诊断或监测方面非常重要。此外，它们为被称为个性化医学的新医学范式提供了有价值的工具[44- - - - - -46］.新的分子生物学程序使用传统的困难材料，如甲醛固定样品，并分析不稳定分子，如RNA，让我们考虑新的分子病理生物标志物的实际应用的新可能性。因此，DNA和RNA病毒由于其对某些疾病的发展和进化的影响，处于这些可能性的前沿[47，48］.就HPV而言，分子流行病学研究是开启宫颈癌疫苗接种窗口的关键。若干证据显示HPV分子生物学检测在宫颈癌筛查中的假定作用及其在头颈癌中的假定作用[49- - - - - -52］.

可以接受的是，为了使卫生预防战略发挥最大功效，我们必须最大限度地提高某些人群对其流行病学、服饰和关注事项的了解，这对于尚未开发出筛查或疫苗的人群尤其重要[53- - - - - -56］.这一数据加强了开展基因分型研究以确定全球HPV基因型分布特征的紧迫性，以便根据HPV基因型分布对每个人群采取相应的预防和治疗策略[1，14］.

总之，我们必须提议自抽样可能是临床医生替代阴道窥器检查的替代方案，作为年轻无症状女性中HPV感染的初次筛选的工具。该研究有助于更好地了解年轻葡萄牙女性中HPV感染的流行病学。在年轻女性中的HPV型材的确切知识可能很重要，以评估不同人口的疫苗接种策略。

利益冲突

任何作者都没有利益冲突。

资金

本计划由葡萄牙抗癌联盟(葡萄牙足球联赛- - - - - -Núcleo北部地区)和费尔南多·佩索阿大学。

致谢

作者感谢葡萄牙抗癌联盟(葡萄牙足球联赛- - - - - -Núcleo北部地区），葡萄牙卫生部（沙特调查委员会：ccics -32/2007)，葡萄牙SPPV-HPV协会(http://www.sppv.org/）和费尔南多Pessoa大学支持他们的支持。J. Silva和J. Ribeiro同样参加了该研究。

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