短期接触烟草毒素改变多个增殖基因标记的表达主要人类支气管上皮细胞培养

文摘

有限数量的生物效应研究了烟草毒素。在这里,我们描述人类支气管上皮细胞的文化接触低浓度的烟草致癌物:硫酸镍、苯并(b)荧蒽,N-nitrosodiethylamine, 4 - (methylnitrosamino) 1 - (3-pyridyl) 1-butanone (NNK)。经过24小时的接触,表皮生长因子受体在细胞膜和细胞质中表达,bcl - 2表示只有在大型非典型的不规则核细胞,MKI67表达于细胞核没有染色的大细胞,胞质BIRC5核染色较强的大型非典型细胞和核TP53强烈表示在所有细胞。仅仅24小时曝光之后,细胞表现出典型的核和胞质特性。48小时后曝光,表皮生长因子受体细胞核染色是局部的,bcl - 2在强度略有降低,BIRC5细胞质是本地化的,TP53在小型和大型细胞染色增加。BCL2L1表达在细胞质和细胞核的细胞在24 - 48小时曝光。我们说明支气管上皮细胞系的short-termexposure smoking-equivalent烟草致癌物浓度改变关键增殖调控基因的表达,表皮生长因子受体、bcl - 2、BCL2L1 BIRC5, TP53,MKI67类似报道,在活检标本描述的肺上皮肿瘤出现前的病变。

1。背景

吸烟是肺癌的一个主要原因。90%的男性和75 - 80%的女性肺癌死亡率在美国吸烟相关(1]。定义由国际癌症研究机构(IARC),每个香烟包含60多个已知的致癌物质的混合物(2]。至少20这些致癌物质与肿瘤(1]。

支气管上皮细胞经历了一个逐步肿瘤出现前的过程包括各种形态和肺癌的分子变化之前公开的发展(3]。肺癌患者的5年存活率约15% (4nonsmall细胞肺癌患者,在舞台上我疾病复发有33%的机会在完整的手术切除后5年(5,6]。目前,没有免疫组织化学或形态标记,用于化生,发育不良,或癌insitu公司,可靠地预测肿瘤出现前的损伤的生物学行为。

的bcl - 2(7- - - - - -9),BCL2L1凋亡基因将导致致癌作用。bcl - 2延长生存noncycling细胞循环,抑制细胞凋亡细胞(10,11]。表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)是一种酪氨酸激酶受体的细胞增殖增加(12- - - - - -16]。BIRC5属于细胞凋亡蛋白的抑制剂(IAP)的家庭,一个cell-cycle-regulated双功能蛋白表达在G2 / M期(17- - - - - -19]。BIRC5可能克服G2 / M期检查站执行进展的细胞通过有丝分裂,有利于肿瘤克隆的发展。MKI67表达在细胞周期的所有活动阶段。的比例MKI67阳性的肿瘤细胞(MKI67标记指数)提供相关疾病的临床过程20.- - - - - -22]。

虽然恶性转换可以在支气管上皮细胞培养诱导,接触各个烟草致癌物的影响还没有深入研究在前阶段明显的癌症的发展。我们目前的工作的目的是研究个人烟草致癌物的影响人类支气管上皮细胞培养。

2。材料和方法

2.1。试剂

来源的毒素、细胞系、抗体、试剂用于这项工作列出补充数据网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2011/208563)。

2.2。细胞培养

支气管上皮生长培养基(BEGM)准备如前所述23]。低温贮藏细胞系解冻,最初生长在35毫米的塑料盘子在指定介质湿润5%股份有限公司₂孵化器在37°C到细胞汇合的70 - 80%。细胞被取消胰蛋白酶化和山肩24-well板块包含玻璃覆盖到70 - 80%汇合的。

2.3。毒素暴露

毒素的解决方案(表1)是评估影响非特异性酯酶(研究)和细胞形态学评估由巴氏染色法和相衬显微镜。我们评估的影响硫酸镍(重金属),苯并(b)荧蒽(聚芳烃),N-nitrosodiethylamine(烟草亚硝胺)和亚硝胺(尼古丁衍生物)使用电子显微镜和免疫组织化学24和48小时后暴露致癌物质在低浓度。最后的溶剂浓度的培养基是如前所述[不到0.01%24]。工作浓度的毒素是基于上皮细胞暴露于毒素通常出现在一个香烟(25]。每个毒素的浓度中位数在一个吸烟香烟作为介质的浓度(M),和低(左)和高(H)剂量暴露浓度任意决定(表1)。两个控件都包含在每一个接触致癌物质,“溶剂控制”(S)对应于所使用的溶剂溶解毒素(使用相当于最高浓度)和“负控制”(N)只包含生长介质。细胞培养的培养基含有毒素或控制24和48小时。细胞然后用DPBS洗。巴氏染色,细胞被固定在95%酒精30分钟,晾干,储存在4°C。电子显微镜、细胞使胰蛋白酶化洗两次生长介质,离心机。细胞颗粒固定在2.5%戊二醛和冷藏4°C。

2.4。非特异性酯酶(了无)细胞化学和子宫颈(PAP)染色

我们使用了无染色细胞活性的测量和确定最低限度有毒化学物质浓度的测试能够诱导细胞形态学有意义的变化。染色是如前所述[26,27]。染色细胞在封面上都出现脱水及安装在玻片上的反向使用Permount安装媒体(费舍尔科学、匹兹堡、PA)。

2.5。免疫组织化学(包含IHC)

固定cytospin幻灯片孵化3%过氧化氢在室温下15分钟,在蒸馏水冲洗,孵化为10 - 15分钟在室温下阻塞血清,其次是主要鼠单克隆抗体的应用表皮生长因子受体(1:100),TP53(1:100),BIRC5(1:150),MKI67(1:50)bcl - 2(1:100)BCL2L1(1:150)。主要的抗体在室温下孵化了60分钟。幻灯片与PBS洗了三次0.2%渐变其次是应用biotin-labeled antimouse免疫球蛋白和进一步孵化在室温下30分钟。细胞与PBS 0.2%渐变,然后洗和稀释的新鲜民建联的解决方案是添加工作。幻灯片在吉尔的苏木精复染色,放置在氨水5 - 10秒,脱水,并与Permount安装。

2.6。电子显微镜(EM)

使用标准组织处理电子显微镜(28]。Toxin-treated glutaraldehyde-fixed细胞颗粒器皿清洗Millonig磷酸盐缓冲剂和放置在1%锇酸一小时,洗两次与Millonigs缓冲区,通过分级脱水的乙醇两次,每15分钟,最后在100%乙醇30分钟。然后,颗粒是治疗1:1和3:1工作Spurr: 100%乙醇混合物,后跟一个性欲的解决方案工作,30分钟,嵌入在梁胶囊的中心。厚和薄的部分是准备和检查用透射电子显微镜(Tecnai 12 T;范公司晚宴过后,俄勒冈州)。

2.7。相衬显微术

定义的所有幻灯片后曝光时间和任何进一步的处理之前被认为使用一个倒置相差显微镜(德国徕卡DMIRE2) 20 x,和适当的图片。普通数字图像的彩色幻灯片被60 x使用显微镜的形态测量学(奥林巴斯BX51,中心山谷,PA)配备数码相机(奥林巴斯DP71,中心山谷,PA)。一块100微米是使用一个内部规模60 x,后来用于校准ImageJ软件。

2.8。评价分析了无,ki - 67, p53染色、形态测量学

分析了无染色在60岁以下的100个细胞x客观评估。-细胞被分级为零,最小的染色和/或原子核周围形成一个不完整的边缘是否有小点的齐次1,适度染色和/或原子核周围形成一个完整的边缘是否有小点的均匀,和强大的染色3原子核周围形成一个完整的边缘。一些小致密的无玷污的细胞,最有可能代表基底细胞,确定未曝光和暴露的文化都没有算。形态测量学的细胞学效应,核:胞质比率测定与NIH ImageJ软件。手动执行的一个8位灰度图像阈值和选择感兴趣的区域“地区的利益”(ROI)经理。一根工具是用来选择区域不适合的阈值。ImageJ校准在一组尺度窗口使用100年μm比例尺捕获早在60 x放大。密度校准,ImageJ校准过程上市后在欣ImageJ手册(http://rsb.info.nih.gov/ij/)。Biostatistical分析和图形显示了使用R软件(http://www.r-project.org/)。

3所示。结果

3.1。分析了无、巴氏染色和形态测量学

未经处理的细胞的形态作为比较的基础。这些细胞显示正常和光滑的细胞和核轮廓和小核仁。所有carcinogen-treated细胞显示一系列的形态学变化;代表图像描绘苯并(b) fluoranthene-treated细胞显示在图1(前面板)。在低浓度,细胞显示核增大,最小的微核轮廓不规则,核仁的扩大以最小的细胞膜轮廓的变化。此外,在中等浓度,细胞表现出轻度至中度增加核密度,核仁的大小,进一步增加细胞质膜萎缩,细胞大小的变化,和核:细胞质(N: C)比值。在最高浓度,核hyperchromasia显著增加核轮廓不规则和不显眼的核仁。第二人口大非典型细胞不规则和折叠核出现在公开的文化构成只有5 - 10%的总人口。这些大型细胞群被排除的形态学评价表明,N: C比率七致癌物的暴露(硫酸镍、氯化铬、苯并(b)荧蒽,indeno (1、2、3, cd)芘,氨基甲酸乙酯,N-nitrosodiethylamine,和亚硝胺)在统计学上显著高于控制在不同的致癌物质浓度(表2)。PAP-stained vehicle-treated细胞没有表现出任何上述形态变化(没有显示)。了无染色一直没有在所有12 toxin-exposed细胞组除了氯化镉和铬浓度,显示弱活动在低浓度(L)。强烈的过氧化物酶染色法观察媒介只控制细胞(N)细胞孵化与溶剂(S)证明了无活动只与介质控制(图1)。

3.2。相差显微镜和电子显微镜

所有toxin-treated细胞组织收缩,小细胞大小和核粒度膜不规则使用相差显微镜。一个值得关注的发现是细胞质起泡和outpouching损失引起的细胞膜平滑N-nitrosodiethylamine即使在低浓度(图2)。细胞治疗与硫酸镍、苯并(b)荧蒽,NNK显示显著的和一致的电子显微镜下可见核仁的变化。核仁的大小和形状的变化包括伸长显著增加,以及多个放大和/或形状不规则的核仁。在某些细胞核仁似乎跨越了原子核的内径。电子密度nonmembrane绑定粒状材料是偶尔在细胞的细胞质不接受毒素(图3)。

3.3。免疫组织化学

负控制细胞(媒体只或溶剂)显示所有抗体膜染色除了没有染色表皮生长因子受体(图4)。通过省略主要抗体,“负疣状控制”也评估,没有显示任何染色(没有显示)。bcl - 2染色基本以24小时为暴露在所有细胞除了负面大型非典型细胞与多个和不规则的细胞核bcl - 2本地化与弱到中度的细胞质细胞核染色。有丝分裂细胞和致密的细胞核萎缩和那些经历了强烈的核积极性。这些变化是一致的在所有四个毒素检测24和48小时;然而,一些大型非典型细胞被积极的在48小时bcl - 2。MKI67在48小时内没有评估。在24小时的接触,MKI67显示高反应活性染色质的斑点和细粒度的模式概述。形成鲜明对比bcl - 2,MKI67没有污点的大型非典型细胞不规则和多个细胞核。二十大非典型细胞核和100小细胞细胞核数和细胞核的平均数量三倍积极染色MKI67代表总数的百分比(表吗3)。类似的方法被用来评估核TP53无论大小,非典型细胞染色(表4)。小细胞染色阳性,而大细胞主要是负面的。在细胞暴露于苯并(b)荧蒽的数量TP53阳性细胞从68%上升到82.6%在24 - 48小时曝光间隔。N-nitrosodiethylamine,疣状TP53是积极的在更大比例的细胞(82.3%)在24小时(82.3%比64.6%)。染色的模式TP53保持不变在24 - 48小时暴露在大非典型细胞。在24小时的接触,表皮生长因子受体很强的细胞质和细胞膜染色和很弱的所有细胞的核染色。在48小时的接触,只有小细胞的细胞核染色强阳性没有细胞质和细胞膜染色。大型非典型细胞与多个不规则的原子核与偶尔的细胞大多是负面示范软弱和变量表皮生长因子受体细胞质或核染色。所有四个毒素测试在24 - 48小时曝光,BIRC5活动主要是分布在细胞的细胞质中,尽管一些核染色也观察到细胞暴露于硫酸镍。相对较强的核染色BIRC5指出在不规则的大型非典型细胞细胞核。在48小时暴露,只有在小型和大型细胞胞质染色观察。一些膜染色细胞暴露于苯并(b)荧蒽。BCL2L1染色存在于细胞质和细胞核的细胞在24 - 48小时。BCL2L1在苯并(b)更强烈积极荧蒽与硫酸镍暴露细胞24小时(图4)。一般来说,没有区别在细胞毒素对细胞间的可行性和控制细胞(数据未显示)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们已经开发出一种可再生的技术让人类支气管上皮细胞在文化可溶性烟草毒素和早期发现这些毒素对细胞形态的影响,分析了无活动,选定的基因表达。虽然各种蛋白质的免疫组织化学剖面在侵入性肺癌已被广泛研究,有蛋白表达在癌前病变的研究相对较少29日,几乎没有信息培养毒素暴露后支气管上皮细胞的变化。在烟草毒素苯并(a)芘(BaP),一个被聚芳烃(PAH),也许是最为广泛的研究。其他毒素不太认可的独特影响的复杂的复合环境烟草烟雾暴露实验。有有限的数据暴露水平的个人烟草毒素(30.- - - - - -36]。因此,我们选择了一个范围的暴露浓度根据报道熏香烟中的毒素浓度(25]。在我们的实验中,细胞暴露24和48小时,允许足够的时间对蛋白质合成。Dibenz (a, h)蒽、苯并(k)荧蒽,只在甲苯可溶,被排除在我们的分析,以避免混淆甲苯细胞毒性问题。

在暴露于毒素,细胞显示频谱形态改变包括核增大,轮廓不规则,核仁增大,核密度,增加细胞质膜萎缩,细胞大小的变化,和N: C比值,逐步强调浓度从低到高。在暴露的细胞培养,出现第二个人口异常大的非典型细胞不规则和折叠核构成细胞5 - 10%的人口。所有这些特性类似于那些描述发育异常的细胞。我们的结果进一步表明一致减少了无toxin-treated细胞相对于所有烟草毒素的控制。

表皮生长因子受体人类癌症细胞中过表达,与转移和抵抗治疗。在我们的研究中,表皮生长因子受体强烈积极在细胞膜和细胞质只有弱核染色后24小时的毒素暴露。48小时的暴露后,所有表皮生长因子受体染色是集中在细胞核。nonexposed细胞只显示模糊膜轮状染色。免疫染色的表皮生长因子受体已被证明与发育异常的严重程度增加肿瘤出现前的和肿瘤早期支气管上皮细胞。相反,减少的表达表皮生长因子受体遵循回归的支气管鳞状上皮化生13,16,19,29日]。核转移表皮生长因子受体48小时后毒素暴露与观察,在生长因子刺激,一小部分表皮生长因子受体从细胞表面转移到细胞核,可能与STAT3互动和直接调节基因表达15]。

bcl - 2肿瘤表达已经不那么咄咄逼人的行为,是与增加细胞生存7]。我们的研究结果表明缺席疣状bcl - 2在大多数细胞暴露于毒素24或48小时。然而,大型非典型细胞不规则的分组人口和大型核表明积极的核和细胞质bcl - 2染色在24小时持续48小时与降低强度。在未曝光的细胞,bcl - 2染色是检测不到。研究报道显示基底组织部分bcl - 2在正常上皮细胞染色,在化生的上皮基底和suprabasal染色,越来越异常bcl - 2表达发育不良的增加成绩(7- - - - - -9]。大池bcl - 2已确定在间期细胞核控制细胞增殖可能诱导而不是保护细胞免受细胞凋亡(8,37]。我们的研究结果还表明,bcl - 2毒素暴露后早期表达。

这一事实MKI67存在在所有活动阶段的细胞周期和察觉在静息细胞使其成为一个优秀的标志来确定给定的细胞群的增长分数(22]。我们发现高MKI67疣状斑点和细粒度的模式,概述toxin-exposed细胞的核染色质材料(表3)。相比bcl - 2,疣状MKI67没有出现在大的人口非典型细胞与多个或不规则的细胞核。MKI67完全没有在所有细胞未曝光的文化。各种研究报道高MKI67活动支气管发育异常的病变包括王等人的62.5 - -100%。36),1 - 60% Tan et al。20.,36),49%表达在小细胞肺癌标本Paik et al。36,38]。我们发现高MKI67疣状toxin-exposed细胞因此类似于组织切片观察报道从发育异常的病变。

有研究报道负面BIRC5染色在正常支气管上皮、最小非典型增生的肿瘤和非肿瘤的病变毗邻。核和/或胞质BIRC5表达已被确定在化生的,发育不良的,和中度异生(增生性病变18,36]。的水平BIRC5与发育异常的程度最高,在癌19,36]。BIRC5被发现局部在早期非小细胞肺癌70%的细胞核,细胞质和细胞核在54%的情况下。此外,它还确定了非典型细胞有丝分裂和巨大的出血性肿瘤细胞核(39]。我们观察到BIRC5主要在细胞的细胞质后24小时的接触,与一些核染色细胞暴露于硫酸镍和相对较强的核BIRC5在大型非典型细胞不规则核。48小时后曝光,只有细胞质染色观察,与焦膜染色细胞暴露于苯并(b)荧蒽。这种模式在培养支气管细胞持续的细胞质BIRC5immuno-reactivity和最小核反应后48小时的暴露于毒素有点不同于其他组织的研究中核immuno-reactivity优势已被报道。这种差异可能与短时间间隔的毒素暴露在我们的细胞培养模型或组合效应multitoxin接触在先前的研究。

在我们的研究中,坚强TP53核染色细胞暴露于指出一些毒素24小时48小时后进一步增加(表4)。反应动力学的变化不同的毒素可以反映出不同的刺激机制TP53。改变信号通路通过蛋白质磷酸化或直接修改中间信号化合物通常是非常快的。另一方面,信使rna表达的改变或稳定需要更长的时间,尽管短于一个表观遗传修饰。在自然界中,这些化合物的半衰期很长(2 - > 300天)。然而,这些化合物的半衰期是从未在组织培养研究。在控制文化,只有罕见的小细胞显示了积极的TP53染色。几项研究证明镇压BIRC5通过TP53(17]。的TP53疣状报道是罕见的在正常或化生黏膜但可能在多达30%的病例的轻度支气管上皮发育不良(36]。逐步增加suprabasal表达TP53可以看到随着等级的发育不良。侵入性癌症的可能性的程度呈正相关TP53表达同一肺叶支气管上皮细胞(40),这表明TP53可能有预测价值评估肿瘤出现前的支气管内病变的生物学行为。在另一项研究中,41%的患者发育异常的病变显示> 10%TP53阳性细胞核后发达国家只有23%的肺癌TP53负病变进展癌症(积极的和消极的预测价值的78%和77%,分别地。)(41]。我们的结果表明,接触烟草毒素导致的重要TP53核immuno-reactivity而未曝光(控制)细胞,并且染色强度与接触烟草毒素的持续时间增加。

很少有文献中的信息的表达BCL2L1在肿瘤出现前的/发育异常的肺损伤。细胞质的表达BCL2L1和高BCL2L1成绩单已报告基因在肺癌的81.7%和60%,分别。肿瘤患者表达BCL2L1显示短生存中值相比,病人没有BCL2L1表达肿瘤(11]。细胞质或核的表达BCL2L1被发现在肺癌的81.5%和30.4%,分别。核BCL2L1表达式相关的所有组织学类型与TNM四期和细胞质的高表达BCL2L1在切除非小细胞肺癌(81.9%)没有任何明显影响临床结果(10]。在我们的研究中,细胞质和核BCL2L1染色是在24 - 48小时曝光间隔。BCL2L1在苯并(b)更强烈积极荧蒽,暴露的细胞相比,nickel-sulphate-treated细胞24小时,建议BCL2L1表达可能是毒素相关的。

总之,我们的研究描述已知的影响肺烟草毒素细胞系建立的人类支气管上皮细胞。尽管这些毒素在香烟烟雾的浓度已经决定,我们只能估计适合应用程序在组织培养细胞的浓度。条件下的实验,我们发现一个简短的接触烟草毒素产生一致的和可再生的细胞形态变化的细胞和核大小和形状。利用免疫组织化学我们发现细胞毒素处理显示活动的出现表皮生长因子受体,bcl - 2,MKI67,BCL2L1,BIRC5,和TP53没有发现在未经处理的控制细胞。这些变化是类似报道肺癌组织标本肿瘤出现前的病变和充分发展。本研究的结果表明,这些蛋白质表达的变化发生在暴露后快速的细胞毒素,提高的可能性,一些变化与迅速公开可能发生恶性肿瘤在活的有机体内毒素暴露。持续或间歇性的细胞毒素暴露影响尚不清楚。额外的研究使用人类支气管上皮细胞系和其他毒素或慢性间歇性暴露可能会增加我们的理解的途径参与了肺癌的发展。

确认

本文由MetroHealth基金会的资金支持和病理学系,MetroHealth医疗中心,克利夫兰,俄亥俄州。伊姆兰·s·瓦哈卜和阿什拉夫El-Meanawy提供同样的出版物。

补充材料

引用

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