评价Lentiviral-Mediated表达式的钠碘同向转运在未分化甲状腺癌和体内成像和治疗的功效

文摘

甲状腺未分化癌(ATC)是最致命的癌症之一。密集的多峰性的治疗,存活率仍然很低。ATC并不敏感^131年我治疗由于钠碘同向转运的损失(NIS)基因的表达。我们以前生成一个稳定的人类NIS-expressing ATC细胞系,ARO,碘化积累恢复的能力。使NIS-mediated基因疗法更适用,本研究旨在建立一个慢病毒系统hNIS基因转移到细胞和评估疗效的体外和体内radioiodide积累成像和治疗。慢病毒包含hNIS cDNA ARO转导细胞生产不集中碘。基因表达、细胞功能、radioiodide成像和治疗进行评估在体外和体内。结果表明,转导细胞恢复表达hNIS并积累了大量radioiodide高于父母的细胞。治疗剂量的^131年我有效地抑制肿瘤的生长源于转导细胞相比saline-treated老鼠。我们的研究结果表明,慢病毒系统有效地转移和表达hNIS在ATC细胞基因。转导细胞表现出一种很有前途的肿瘤成像和治疗的结果。

1。介绍

未分化甲状腺癌(ATC)是罕见的,是不到2%的所有甲状腺癌(1]。然而,它是一种最致命的人类癌症导致的一半以上死于甲状腺癌(2]。目前,ATC的治疗主要是手术与化疗和放疗相结合。尽管密集的多峰性治疗显示改进的局部控制,整体存活率仍然很低(3]。其他策略治疗ATC包括新药迫切。

ATC不集中碘由于钠碘同向转运损失的表达式(NIS)基因。NIS是膜蛋白13假定的跨膜域(4]。这同向转运是由内部低钠浓度和同向转移2为每个碘离子钠离子进入细胞。对甲状腺细胞NIS介导碘化运输是第一步三碘甲状腺氨酸(T3)、甲状腺素(T4)合成5]。碘化运输NIS的函数被用于radioiodide成像和治疗。为高分化甲状腺癌,^131年甲状腺切除术后我消融,全身闪烁扫描是目前最常见的治疗协议(6]。NIS基因被克隆后,几个调查人员使用它作为基因治疗的成像和治疗工具。通过引入NIS基因植入多种癌细胞不集中碘,它显示一个有前途的治疗后疗效同位素(7]。通过γ相机或与radioiodide正电子发射断层扫描,示踪剂的积累反映转移NIS基因的表达可以被监控。我们已经证明的有效性NIS-mediated radioiodide治疗肿瘤来源于ATC细胞系,ARO [8]。然而,建立的模型在以前研究稳定细胞瞬时转染和克隆扩张。

Virus-mediated基因传递在生物研究中已经使用了几十年。逆转录病毒是当前基因治疗的主要方法由于其高感染效率和高转移基因的表达。长期提供基因的表达归因于基因组整合也是一个有用的优势。然而,使用逆转录病毒需要细胞分裂被在一个积极状态(9]。另一种类型的逆转录病毒,慢病毒感染:间期细胞分裂和细胞已成为强有力的和通用的向量基因转移(10]。在这项研究中,我们旨在建立一个慢病毒系统提供NIS基因成ARO细胞并评估radioiodide成像和治疗的功效。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

293吨(BCRC60019)从生物资源收集和获得在台湾研究中心。ARO甲状腺癌症细胞系是请Chin-Wen博士提供的气(国立阳明大学、台湾)。所有媒体和组织培养补充剂获得Gibco-BRL(表达载体,加州卡尔斯巴德,美国)。293 t细胞生长在最低基本培养基(MEM)。ARO细胞保持rpmi - 1640中。所有完成媒体补充10%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。细胞培养在37°C和5%湿润孵化器有限公司₂:95%的空气。

2.2。病毒载体建设和生产

pcDNA3 hNIS cDNA克隆(FL * -hNIS / pcDNA3)请提供了娘娘腔Jhiang博士(俄亥俄州立大学)。巨细胞病毒启动子与hNIS pcDNA3向量保持酶的移除,然后绑定到LentiLox 3.7矢量(pLL3.7)与合适的限制性内切酶创建pLL3.7-hNIS(图1)。慢病毒颗粒生产协议后发表的Tiscornia等人与一些修改(11]。6×10⁶每100毫米293 t包装细胞细胞培养板被播种在DMEM培养补充10%的边后卫24小时。瞬时转染是使用Lipofectamine 2000(美国表达载体,加州卡尔斯巴德)后手动指令。质粒DNA和试剂混合和孵化20分钟在室温下形成了DNA-Lipofectamine复合物。混合物被添加到293 t细胞在一夜之间文化和孵化。第二天,媒体被拆除,代之以新鲜培养基均含有1% (w / v)。在转染后72小时,病毒particle-containing上层清液在无菌收获,封顶锥形管,以及离心机在300克15分钟在4°C到颗粒细胞碎片。浮在表面的“(分泌物)颗粒”(LV-CMV-hNIS和LV-CMV-EGFP)然后通过无菌,0.45μm低此种Millex-HV PVDF过滤器(微孔,贝德福德,质量,美国)。flowthrough是收集和覆盖在4毫升20%蔗糖溶液由PBS使离心管。病毒的浓度是由离心26.000 rpm, 4°C 1.5小时。卸载后上层清液、颗粒重组病毒颗粒的混合在哈佛商学院和存储−80°C。病毒效价由QuickTiter化验慢病毒定量工具(美国细胞生物学实验室,Inc .)。

2.3。免疫细胞化学研究

细胞被播种,并允许生长22毫米×22毫米盖玻片(Marienfeld, Lauda-Konigshofen,德国)。24小时孵化后,细胞与PBS冲洗3次,然后固定在4%多聚甲醛在室温下15分钟。PBS三5分钟后洗,0.1%的细胞被permeabilized Triton x - 100在PBS /厘米/ BSA(与0.1毫米氯化钙PBS, 1毫米MgCl₂,0.2% BSA) 10分钟。三5分钟后洗,PBS的细胞被孵化1:100稀释的鼠标anti-hNIS多克隆抗体(美国泰梅库拉Chemicon) 1小时在室温下与PBS洗。1:200稀释FITC-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(美国圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术)被添加到细胞和孵化1小时在室温和PBS洗紧随其后。细胞核染色使用Bisbenzimide H33342在室温下30分钟。三次最后PBS洗(5分钟),这些细胞被安装和安装解决方案。细胞的荧光图像使用徕卡TCS SP5共焦显微镜观察。

2.4。聚合酶链反应(PCR)检测集成转基因和基因表达

转导ARO细胞和亲代细胞扩大在文化、和总基因组DNA分离使用DNeasy工具包(美国加州试剂盒,瓦伦西亚)根据制造商的指示。集成hNIS DNA PCR与正向引物设计,扩大了5′-TCAGCACAGCATCCACCAG-3′和反向引物5′-GGGCACCGTAATAGAGATAG-3′。PCR协议设置为:94°C的4分钟,94°C 30年代,56°C 30年代,30年代和72°C,重复反应周期为30倍。RNA表达的检测,细胞细胞溶解,总RNA孤立使用RNeasy迷你包(美国加州试剂盒,瓦伦西亚)。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用MMLV逆转录酶(美国生物技术中心,麦迪逊," wli)根据制造商的指示。在随后的PCR反应,以前描述的引物被用来放大hNIS基因。内部控制,引物的杂交β肌动蛋白cDNA被包括在相同的反应混合物(β肌动蛋白正向引物:5′-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′;β肌动蛋白反向引物:5′-GGGCACCGTAATAGAGATAG-3′)。的退火温度β肌动蛋白是54°C。

2.5。在体外^125年我吸收

体外细胞^125年我吸收测量根据维斯et al。12)进行小修改。5×10⁵细胞每被播种在前一天12-well板实验。冲洗后,汉克斯平衡盐溶液(hbs),细胞被孵化0.5包含10毫升哈佛商学院μ米奈和3700 Bq^125年我在37°C。在5、10、20、30和60分钟,细胞被洗了快1毫升iodide-free冰冷的哈佛商学院。细胞被胰蛋白酶然后分离,收集所有细胞和1毫升hbs resuspended计数管。放射性测量使用眼镜蛇II autogamma计数器(美国康涅狄格州帕卡德仪)后手动过程。

2.6。在活的有机体内^124年我成像和定量图像分析

在体内成像研究中,1×10⁷ARO亲代细胞和细胞转导与LV-CMV-hNIS皮下注入的右翼男性NOD / SCID小鼠的肩膀上。肿瘤直径达到8毫米后,小鼠静脉注射^124年我(1.85兆贝可)。一个小时后,老鼠和2%异氟烷麻醉(久远的雅培,Queenboroug,肯特,英国)和98%氧气混合物和容易获得的成像表位置。静态图像获得使用microPET R4扫描仪(西门子临床解决方案,诺克斯维尔,田纳西州,美国)30分钟。完全三维列表模式数据收集了30分钟使用一个350 - 750 keV能量窗口和时间窗口6 ns。最大的敏感性,巧合rebinned到三维正弦图数据使用的轴向接收角扫描仪(max。戒指的区别= 31)。保持轴向分辨率,高采样的极角(跨度= 3)。结果三维正弦图然后rebinned到二维正弦图使用傅里叶rebinning(前)和二维过滤反射影重建(FBP)使用一个坡道过滤器在奈奎斯特与截止。图像矩阵大小为256×256。数据操作是通过MicroPET管理器提供的软件制造商。不需要进行衰减校正。 The images were interpreted qualitatively. All images were expressed in the ordinary rainbow color scale with standard visual spectrum installed in the computer of the microPET system.

2.7。在活的有机体内^131年我治疗

在小鼠肿瘤生长的影响评估^131年我治疗。细胞接种两周后,小鼠轴承肿瘤腹腔内注射55.5兆贝可(1.5 mCi)^131年我还是同样体积的正常。肿瘤大小是衡量每周两次^131年我的治疗。肿瘤体积测量通过卡尺和计算方程,在那里估计肿瘤体积,,,长度(毫米),宽度(毫米)和深度(mm)的肿瘤,分别。

3所示。结果

3.1。免疫细胞化学研究

评估hNIS转导ARO细胞中表达,我们执行immunofluorescent染色。使用鼠标anti-hNIS主要抗体加上FITC-conjugated山羊抗小鼠的免疫球蛋白,荧光FITC发出荧光团显示局部转导细胞的细胞表面,与H33342细胞核染色的位置相比(图2 (b))。ARO亲代细胞处理相同的染色过程没有FITC-related荧光信号,表示没有或低表达hNIS这些细胞(图2(一个))。这个结果表明有效转移和随后的表达hNIS慢病毒转导。

3.2。PCR检测综合病毒载体和基因表达

验证的外生hNIS构建慢病毒整合转导ARO细胞,我们曾与设计引物进行PCR检测基因组DNA的集成构建隔绝ARO亲代细胞和转导细胞(13]。在图3,转导细胞表现出明显的外生hNIS PCR扩增子与预期大小(巷5)当父母的细胞没有发现乐队(巷4)。rt - PCR也执行检测在父母和转导细胞RNA表达。后执行逆转录和随后的PCR,表达外源hNIS观察(巷2)和亲代细胞显示没有检测到表达(巷1)。

3.3。体外Radioiodide吸收

评价碘吸收转导细胞的功能,我们以前执行的顺序在体外^125年我吸收实验13]。ARO亲代细胞或细胞转导LV-CMV-hNIS或LV-CMV-hNIS被孵化^125年I-containing hbs紧随其后γ计算在不同时间点细胞内放射性。如图4,细胞转导LV-CMV-hNIS积累^125年我在10分钟,迅速和放射性达到高原在20分钟开始。ARO亲代细胞和细胞转导LV-CMV-EGFP显示最小^125年我吸收,没有更高的积累随着时间的增加。在20分钟,累积的指数^125年我在细胞转导与LV-CMV-hNIS ~ 7倍与LV-CMV-EGFP亲代细胞或细胞转导。这个结果证明了lentiviral-transferred hNIS,展示其原始功能,因此恢复碘吸收的能力未分化甲状腺癌细胞。

3.4。体内Radioiodide MicroPET成像

为了知道ARO-transduced细胞保留hNIS的表达和碘吸收的功能,我们建立了肿瘤来源于ARO父母和转导细胞NOD / SCID小鼠。静脉注射后1小时^124年我,老鼠使用microPET扫描仪成像。静态图像的老鼠轴承肿瘤来源于ARO亲代细胞(左)和转导细胞(右)收购了30分钟,如图5。肿瘤来源于转导细胞显示,更有效的积累的^124年我虽然比肿瘤来源于父母的细胞。这个结果表明转导细胞保留不仅转移hNIS的表达,碘化积累的能力。

3.5。在活的有机体内^131年我治疗

知道的功效^131年我治疗hNIS-expressing肿瘤,肿瘤小鼠轴承处理55.5兆贝可(1.5 mCi)^131年我或盐水。结果表明,通过治疗,有效地抑制了肿瘤的生长^131年我作为肿瘤治疗生理盐水相比(图6)。这些数据以及体内成像的结果表明肿瘤来源于转导细胞保留的表达和功能hNIS甚至在体内环境中。

4所示。讨论

使用慢病毒载体,我们已经成功转导ATC细胞NIS基因表达明显和转导细胞的功能。肿瘤由转导细胞保留高表达hNIS使肿瘤治疗^131年我和radioiodide成像和监控。我们之前的数据显示,稳定细胞提供了一个好的模型来测试NIS-mediated基因治疗的可行性。然而,由病毒转导基因传递更适用于体内。Lentivitral基因转移集中使用由于其优势,包括稳定的转基因整合、转导:间期细胞分裂和细胞的能力和长期的转基因表达。金等人显示有效的长期监测和放射性核素治疗结肠癌细胞生物体通过慢病毒载体系统携带hNIS由哥伦比亚大学启动子控制(14]。Dingli等人也用lentivectors目标和表达hNIS骨髓瘤细胞^131年我治疗。结果表明,肿瘤异种移植治疗^131年我是完全根除没有复发15]。报告上面显示潜在的慢病毒载体结合NIS基因治疗癌症。我们的数据是第一个示范的慢病毒NIS-mediated未分化甲状腺癌基因治疗。

碘化甲状腺内保留一段时间由于甲状腺激素合成多个进程。Zuckier等人报道^131年我集中在甲状腺继续增加19 h政府到老鼠后根据biodistribution实验(16]。相同的结果指出了我们之前的研究(8]。通过对连续图像roi分析获得使用γ相机,放射性甲状腺大约20小时后达到峰值^131年我注射。类似的实验也显示,5小时内注入,平等的水平^131年我积累是指出在甲状腺肿瘤来源于ARO稳定的细胞,而只有1/3^131年我活动测量肿瘤来源于ARO亲代细胞。放射性肿瘤减少后5小时内与甲状腺的增加。结果表明,没有进一步的步骤T3和T4的合成、碘离子注入细胞NIS迅速流出。这个缺点大大减少了NIS在基因治疗的可行性。

radioiodide解决短期保留的问题,黄等人coexpressed NIS和传真照片nonsmall细胞肺癌中保留时间的增加radioiodide仅在细胞与细胞NIS表达(17]。Furuya等人交付TTF-1(甲状腺转录因子1)NIS-transfected细胞。TTF-1甲状腺特定转录因子,能够打开Tg等下游甲状腺特定基因的表达,传真照片,NIS [18- - - - - -20.]。然而,交付超过一个基因进入细胞大大增加了困难。尽管短期内保留放射碘转导细胞,肿瘤的增长仍然显示显著抑制在这项研究中,我们之前的数据8]。高度NIS单独与充分的表达但不致命的剂量的管理^131年我可以补偿短的radioiodide滞留的问题。

最近,一个全面的DNA序列分析分析指出,ARO细胞是高度一致,HT-29,结肠癌细胞系(21]。然而,几项研究表明,在治疗某些代理、甲状腺特定基因的表达可以恢复ARO细胞。Landriscina等人表明,逆转录酶抑制剂恢复甲状腺刺激激素信号和碘吸收能力(22]。在治疗组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂如depsipeptide和trichostatin (TSA), thyroid-specific基因表达和积累radioiodide通过通用的碘化细胞蛋白被发现在ARO细胞(23]。ARO细胞也表达显示甲状腺刺激激素受体(TSHR),治疗后表达TSHR的人口增加的TSH剂量依赖性的方式(24]。尽管公布的结果表明,ARO细胞保留功能和特定的基因表达与甲状腺细胞,需要更多的证据来阐明ARO细胞的身份。

慢病毒基因转移被认为是一种很有前途的肿瘤基因治疗方法。癌症特异性靶向的体内基因治疗的关键。在这项研究中,CMV启动子被报告为体外最有力的推动者之一是用于我们的转导系统。然而,在体内系统,沉默的基因由发现巨细胞病毒在几个器官在几周内(25,26]。此外,巨细胞病毒是一种普遍的启动子不能用于专门激活下游基因表达在特定的细胞类型。因此,一个专门针对ATC急需启动子。我们之前证明使用肝癌嵌合启动子(EIIA增强器相结合α胎蛋白启动子)针对肝癌细胞(HCC)导致专门打开hNIS转基因在肝癌,但不是在non-HCC [13]。甲状腺球蛋白子据报道,目标甲状腺癌。与转移和特定的TK基因的表达受甲状腺癌细胞的Tg子,结果显示,GCV的存在标志着杀戮能力,体内的毒性,应该在未来有用的治疗甲状腺Tg-producing癌症(27]。ATC称为低分化甲状腺癌与减少或沉默thyroid-specific几个基因的表达,包括NIS和Tg。因此,设计一个ATC-specific慢病毒瞄准系统,Tg基因的启动子不能为此工作。我们未来的工作将集中在寻找一个合适的启动子在我们lentivirus-mediated ATC NIS radiogene疗法。

5。结论

我们已经建立了一个慢病毒系统交付hNIS ARO细胞。转导细胞显示高表达的转基因和恢复radioiodide积累的能力。肿瘤来源于体内转导细胞显示有效成像和治疗。这项研究提供了一种很有前途的,适用的方法来治疗ATC。

确认

这项研究受到了以下资助:nsc99 - 2314 - b - 010 - 032 my2 nsc100ν- e - 010 - 001ν(国家科学委员会,台湾),doh100 - td - c - 111 - 007(卫生部)v99c1 - 087和v99er2 - 013(台北荣民总医院)。作者感谢国家基因组医学研究项目的技术支持,台湾(分子和基因成像核心,nsc99 - 3112 - b - 010 - 015),和Tsuey-Ling简女士的帮助下准备手稿。

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