过度磷酸化FAK Delocalizes从焦粘连膜褶边

文摘

细胞粘附和迁移是肿瘤转移的关键决定因素。依从性肿瘤细胞的细胞外基质通过整合素介导的含有焦粘连(FAs)。绑定的整合蛋白ECM触发磷酸化FAs的两个主要组件,粘着斑激酶(FAK)和Src,激活下游信号通路导致FA拆卸和细胞迁移。在本文中,我们分析的FAK磷酸化调节其走私在人类FAs星形细胞瘤细胞。在pervanadate-induced FAK磷酸化,磷酸化FAK出现高表达在新形成的膜褶边。这种效应被废除的特定的Src抑制剂PP2。我们的研究结果表明,经磷酸化,FAK delocalizes FAs膜褶边。

1。介绍

在肿瘤转移的过程中,更一般的细胞迁移,细胞与微环境通过焦粘连(FAs) [1]。FAs转导信号从细胞外基质通过整合蛋白进入细胞集群和后续信号通路的激活。的一个主要激酶与足总信号是粘着斑激酶(FAK)。FAK有助于FA脚手架,也传送adhesion-dependent和生长因子依赖信号到细胞2- - - - - -4]。FAK的主要作用是影响动态监管integrin-associated粘连,肌动蛋白细胞骨架,拴在那里,是通过不同的分子相互作用。这反过来调节细胞迁移通过控制焦复杂的装配/拆卸周期的主要板状伪足迁移细胞,同时控制粘附拆卸后缘。

作为FAK^{- / -}成纤维细胞过度,而不是减少,形成焦接触,FAK与拆卸integrin-based粘连相关网站(5]。的确,并入FAs的表观速率常数桩蛋白和zyxin,两足总组件,在野生型所观察到的类似成纤维细胞,表明FA形成的速度不受缺乏FAK的影响(6]。另一方面,英足总在FAK拆卸^{- / -}细胞明显受损,作为桩蛋白的分解速率常数和zyxin FAK少14倍^{- / -}细胞比野生型细胞。当FAK在FAK重新引入^{- / -}细胞,桩蛋白拆卸的速率常数与观察野生型细胞(6]。符合提议FAK调节粘连营业额,粘连的数量翻了FAK的突出的地区^{- / -}细胞明显低于野生型细胞。综上所述,这些结果表明,FAK对于动态粘连的拆卸效率是必要的。

Tyr397 FAK的主要网站自身磷酸化,磷酸化Tyr397为Src家族激酶和创建一个结合位点Src同源2-containing蛋白质,暗示Src粘附营业额监管的作用(3]。因此,桩蛋白的表观速率常数拆卸19-fold在Src /是的/ Fyn-deficient成纤维细胞减少,与野生型相比,成纤维细胞。比较结果FAK中观察到^{- / -}细胞表达Y397F-FAK [6]。因此,一个共同的信号通路导致FA拆卸似乎需要一个磷酸化的一步。在协议中,pervanadate-induced hyperphosphorylation FAK导致排斥的FAK FAs [7]。此外,ERK / MAP激酶磷酸化是必要calpain2激活导致足总营业额,与活动组成的复杂的形成至少ERK / MAP激酶和calpain2受FAK的适配器功能(8]。其他研究已经表明,FAK与FA拆卸的磷酸化,从而调节细胞迁移(9- - - - - -12]。我们之前报道的存在快速通量FAK胞质和FA隔间之间U87星形细胞瘤细胞,通过收紧分析(13]。此外,的FAK磷酸化Tyr397增加专门的FAK time-residency FAs但在胞质,进而诱发拆卸FAs的观察使用Y397F-FAK突变细胞(14]。为了揭示FAK贩运和磷酸化事件之间的关系,我们分析了FAK磷酸化水平在pervanadate治疗在不同细胞车厢和FAK在活细胞动态。使用这种方法,我们表明,增加在FAK磷酸化导致移位的FAK FAs膜褶边。这一效应是由Src如图所示使用Src激酶的选择性抑制剂和超表达激酶死突变的Src (K298M-Src)。

2。材料和方法

2.1。试剂和抗体

鹰的最低基本培养基(EMEM),胎牛血清的边后卫,ultraglutamine,青霉素,链霉素,来自Lonza trypsin-EDTA解决方案。基底膜基质和鼠标单克隆抗体(Ab)针对FAK激酶结构域的氨基酸(354 - 533)是来自BD生物科学。多克隆Abs针对FAK c端(Ct)域的氨基酸(748 - 1052)是来自于北部。Antiphospho-Tyr861-FAK (p-Tyr861)和antiphospho-Tyr397-FAK BioSource (p-Tyr397) Abs。Anti-Src Ab Biomol国际。Anticortactin微孔。Antivinculin和β肌动蛋白Abs来自σ。Phalloidin fluoroProbe547 Interchim。辣根peroxidase-conjugated山羊antimouse或antirabbit免疫球蛋白来自Promega。若丹明红X-conjugated山羊antimouse或anti-rabbit Abs来自杰克逊实验室。蛋白酶抑制剂混合物平板电脑和从罗氏Fugene 6了。PP2硫酸和G418来自表达载体。Pervanadate解决方案在1毫米是刚做好的钒酸混合溶液(σ)和过氧化氢在PBS最终浓度的1毫米和0.006%,分别。最后一个100的浓度M pervanadate是用于治疗细胞。

2.2。表达载体

pcDNA3-FAK / YCam和Y397F-FAK / YCam了如前所述[14]。包含Y530F-Src pcDNA3质粒被f . Cruzalegui友情提供。质粒都是孤立的使用后的捷星质粒工具包(基因组)制造商的协议。

2.3。细胞培养和稳定的转染

U87-MG人星形细胞瘤细胞系得到来自美国文化集合类型。单层细胞维持subconfluent EMEM补充10%的边后卫,2毫米ultraglutamine,青霉素100单位/毫升和100克/毫升链霉素。稳定转染,使用Fugene 6首次转染细胞,转染细胞被fluorescence-activated选择排序和保持在1毫克/毫升G418包含介质。

2.4。免疫印迹

对西方的屁股,FAK /镀YCam-expressed细胞在低密度菜与178年预镀g / ml人工基底膜2天。细胞被洗冷PBS和细胞溶解与冰冷的里帕缓冲区(Triton x - 100年150毫米氯化钠,1%,0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH值7.5,和蛋白酶抑制剂混合物平板电脑)。蛋白溶解产物被解决通过sds - page,然后转移到聚乙二烯二氟化物膜(通用电气医疗集团)。1 h阻塞后在室温下0.1% casein-PBST渐变20 (PBS补充0.1%),与主要Abs在一夜之间,膜被孵化C: anti-FAK激酶(1/1000),anti-FAK Ct (1/1000), antiphospho FAK在1/2000 (Tyr397或Tyr861)。相应的辣根peroxidase-conjugated二级Abs在1/30000稀释使用。免疫反应性使用ECL +可视化系统(通用电气医疗集团)。

2.5。间接免疫荧光法和相关分析

FAK在低密度/镀YCam-expressing细胞基底膜基质多聚甲醛固定前2天,特里同x - 100和0.2% BSA阻塞与PBS / 3%。细胞用PBS和孵化主要Abs (1/200) PBS / 0.2% BSA 1 h。额外的洗后,细胞被孵化与罗丹明红色X-conjugated二级Abs在PBS / 0.2% BSA(1/200),用PBS洗净,然后使用共焦显微镜观察(Bio-Rad 1024年,Kr-Ar激光;尼康Eclipse TE300, 60 x水浸CFI Plan-Fluor。其1.2目标)。YFP和若丹明兴奋在488和568海里,分别和荧光收集522(绿色)和585海里(红色)。ImageJ 1.37 v软件被用于处理和分析图像。

2.6。活细胞成像

FAK /镀YCam细胞基底膜基质为2天提交至100年M pervanadate治疗phenol-free EMEM补充10% FCS和10毫米消息灵通的,之前通过共焦显微镜成像。系列栈(0.35步骤)是每5分钟1 hc代表细胞从最低4个独立的实验。图像J软件被用来评估FAs和膜的动态褶边。自动计数FAs的单个细胞完成后噪声阈值去除,过滤和应用FAs的大小限制。数据提出了的意思s.e.m. FAs /数量的细胞。

2.7。统计分析

使用学生的数据进行了分析以及和差异被认为是重要的(*)。

3所示。结果

3.1。在FAs Pervanadate增加FAK磷酸化

之前的研究表明,酪氨酸磷酸化,FAK被排除在FAs [7]。我们建立了FAK与FAs的拆卸,FAK磷酸化是关键因素的time-residency FAK在FAs14]。为了确定FAK磷酸化的影响在其亚细胞定位、U87-MG稳定转染细胞与FAK / YCam治疗与pervanadate表示时报,磷酸酶抑制剂会增加FAK磷酸化(7,15,16]。在pervanadate治疗,FAK磷酸化Tyr397和Tyr861 / Ycam发生在时间的方式(图1)。此外,pervanadate-dependent内生FAK磷酸化的增加也发现,虽然FAK的总量保持稳定。

3.2。增加磷酸化FAK在膜褶边

描述的影响FAK hyperphosphorylation其亚细胞定位、细胞生长在Matrigel-coated成像菜肴与pervanadate孵化。细胞表达外源FAK识别YFP发射的信号。疣状图像显示全球增加磷酸化FAK信号强度见细胞染色Tyr397和Tyr861比未经处理的细胞(图2(一个))。在FAs,在总FAK磷酸化FAK的比例是Tyr397增加了3.6倍和2.9倍Tyr861而控制细胞(图2 (b))。然而,FAK染色在FAs PV后更加分散治疗,建议再分配的FAK磷酸化后,如前所述在成纤维细胞(7]。因此,磷酸化FAK似乎高度本地化在pervanadate后膜褶边,总FAK磷酸化FAK的比率是Tyr397增加了5.3倍和4.9倍Tyr861而控制细胞。值得注意的是,FAK的增强型定位膜在细胞可视化褶边并不明确YFP信号。一个可能的解释可能是,FAK磷酸化引发解理的FAK FAK的n端包含YFP一部分因此不再写给FAs。然而,免疫染色实验对激酶与Abs, Ct或脂肪域的FAK没有透露更多强烈的FAK染色膜褶边pervanadate后(没有显示)。我们的研究结果表明,FAK的一小部分定位在膜褶边高度磷酸化,符合高FAK活动。

3.3。增加在FAK Hyperphosphorylation FA拆卸

进一步确定本地化的FAK对酪氨酸磷酸化确实敏感,成像方法对住FAK / Ycam细胞。细胞接受pervanadate和观察到的在1小时内(图3(一个))。几个FAs期间进行了拆卸pervanadate-induced FAK hyperphosphorylation。量化的动态显示FAs每个细胞的数量减少(图3 (b))以及整体的荧光强度降低FAs PV治疗后(没有显示),有时还伴有透明细胞的运动(图3)。30%的细胞分析,一个完整的损失FAs pervanadate后观察1 h。这些结果表明,hyperphosphorylation FAK领导首先排除FAK的FAs拆卸FAs紧随其后。

3.4。后降低FAK Colocalization Vinculin Pervanadate治疗

为了测试这一假说,免疫染色实验进行细胞治疗20分钟PV和标记FAK和vinculin FAs的标志。在FAs FAK和vinculin完全与未经处理的细胞(箭头,图4),而一些外围FAs彩色只为vinculin而不是FAK在光伏电池(箭头,图4)。此外,腹侧FAs只为FAK和没有vinculin(图4)。这些观察经量化分析使用皮尔逊系数决定之间的重叠程度,两个配对图像(图4)。系数是相对较高的控制细胞(,),但明显低于PV-treated细胞(,)。

3.5。增加FAK在细胞膜

为了关联膜皱褶形成过度磷酸化FAK和本地化,FAK / Ycam细胞孵化PV和紧随其后的成像方法。30分钟后,细胞被固定,并为phospho-Tyr397-FAK标记。值得注意的是,75%的细胞没有改变在膜皱褶形成PV-treated细胞,剩下的25%显示FAK拆卸与膜皱褶形成(图5(一个))。检查是否新形成的褶边含有磷酸化FAK, PV-treated细胞被固定,permeabilized phospho-Tyr397-FAK标记。检测结果显示,phospho-Tyr397 FAs也在膜褶边(图5 (b)),这表明激活FAK存在于膜褶边。细胞膜的强度分析地区指出一个箭头显示显著增加在总FAK磷酸化FAK(60.3和39.59最大荧光强度、职责)。

3.6。Src-Dependent FAK的本地化

我们的观察表明,酪氨酸磷酸化的FAK诱发移位的FAK FAs以来膜褶边增加磷酸化FAK发现膜褶边PV治疗后(图2)。的FAK磷酸化Tyr397为Src创建一个结合位点,这反过来FAK磷酸化的酪氨酸残基。据报道,Tyr861 Src-specific衬底(17,18]。在协议中,我们现在报告说,在人类的星形细胞瘤,U87细胞PP2处理,选择性Src抑制剂,明显下降的FAK磷酸化Tyr861(图6(一))。此外,这些细胞的转染既定的活动形式的Src, Src-Y530F,导致增加FAK-Tyr861磷酸化水平(图6 (b))。这表明Tyr861 Src-specific目标在人类星形细胞瘤,因此表明FAK易位从FAs膜褶边可能是由于Src活动和致癌性转化的第一步骤。事实上,磷酸化的细胞定位FAK显示膜定位(图6 (c)前面板)比得上pervanadate治疗后观察或invadopodia本地化(图6 (c)底部面板)。invadopodia具有定位的具体标志cortactin(图6 (c))。这种差异在本地化可能取决于致癌性转化的阶段。

4所示。讨论

酪氨酸磷酸化显然与FAs的营业额,然而这一过程的分子机制仍然是模糊的。我们先前描述快速通量之间的FAK FAs和胞质13]。增加FAK磷酸化导致增加time-residency FAs的FAK而减少磷酸化了time-residency下降(14]。宏观上,FAK hypophosphorylation的结果是减少全球足总营业额在几项研究报告使用Y397F-FAK [6,14,19]。Src家族激酶phosphorylation-induced涉及排斥的FAK FAs [7),但FAK磷酸化之间的关系,FAK贩运和足总营业额从未被描述。在这项研究中,我们分析了FAK贩卖FAK磷酸化和证明磷酸化FAK从FAs转移到膜褶边通过大概Src-dependent机制,进而形成FA拆卸和膜褶边。这个过程链接的影响FAK在促进integrin-stimulated细胞运动性FAK在细胞入侵的含义20.,21]。

协调拆卸所需的FAs是有效的细胞迁移,然而FA拆卸的过程只是知之甚少。相对缺乏的信息反映了FA拆卸和组装同时发生,并且直到最近,模型系统中拆卸活动分开组装是不可用的。为了绕过这个问题,最近的研究采用的方法允许协调FA拆卸(14,19]。策略是根据之前的观察显示增长微管是暂时性联系FAs,诱导他们的拆卸22]。然而,尽管提供的明确的见解“诺考达唑没有用”模式(22在FA拆卸的机制,一些重要的途径很显然不是必需的。例如,Src家族激酶被发现不是必要microtubule-induced FA拆卸(19)相反,已经证明了附着力营业额在成纤维细胞迁移6,12)或结肠癌细胞(23]。因此,我们使用另一个策略基于FAK磷酸化为了更好地可视化和分析FA拆卸。的确,FAK磷酸化似乎是一个主要的和必须的步骤在这个过程12- - - - - -14,19,21,24]。pervanadate后,FAK过度磷酸化(7,15),导致细胞比例增加的内容在FAK磷酸化FAK,从而允许分析磷酸化FAK的细胞定位。事实上,我们在pervanadate-treated细胞免疫荧光实验揭示了膜定位的磷酸化FAK几乎被可视化YFP FAK / YCam嵌合体(图的一部分2(一个))。pervanadate治疗,FAK首先是离域从FAs colocalization FAK的分析和演示vinculin后磷酸化过程。这是符合循序渐进的拆卸的FA观察pervanadate治疗(图5)。因此,这些数据提供了有力,但间接证据在FAs分子变化,从高FAK磷酸化和FA拆卸和p-FAK贩卖膜褶边。

现在的问题是解释可能的生物学意义高磷酸化FAK在膜褶边。Tyr397最近,FAK的自身磷酸化网站是必不可少的前沿的迁移细胞的空间组织(25]。FAK及其磷酸化过程也被证明是必要lamellipodial形成和发展(26,27)和酪氨酸磷酸化的FAK与lamellipodial有关发展在人类神经母细胞瘤细胞。此外,稳定的本地化FAK在FAs一直在观察成纤维细胞迁移,以及临时招聘的FAK lamellipodial扩展的形成包括FAK信号复杂,Src, p130Cas 180年码头,参与细胞入侵(20.]。因此,磷酸化FAK在膜褶边可能是一个早期的致癌过程中转换的步骤。实际上,当U87细胞转染Src的本构活性形式,这些细胞显示增加的磷酸化水平在tyr861 FAK,和转化表型特征的存在podosomes已经描述(28]。因为存在的标记的FAK激活podosomes [29日),我们相信在Src激活,早期细胞表型的变化包括焦粘连和皱褶形成的损失,随后,podosomes的形成。因此,使用热敏突变的Src,肌动蛋白重组之后在开关从限制到允许温度(30.]。在这项研究中,形成Src-containing膜褶边是明显的16个小时后,开关。

总之,为了应对移民invasion-associated刺激,高水平的Src表达和肿瘤细胞的活动允许积极FAK-Src反馈回路导致随后的FAK磷酸化。磷酸化FAK航天飞机迅速从FAs膜褶边,这可能是一种细胞,加强道德高度动态的营业额FAs和粘附蛋白进入新生粘连形成板状伪足。我们的研究结果提供了新的见解的分子机制涉及FAK磷酸化在促进肿瘤细胞迁移。因此,针对FAK磷酸化为癌症治疗可能是一个重要的基础。最近,几个小分子抑制剂开发目标明确Y397 FAK的自身磷酸化,TAE226等复合显示有效的抑制血管生成和肿瘤生长时结合治疗伊马替尼(31日,32]。有前途的抑制剂Y15特别块FAK自身磷酸化,从而其整体磷酸化,从而导致细胞分离和胰腺肿瘤回归体内(33,34]。

缩写

阿瑟:	抗体
YFP:	黄色荧光蛋白
费尔南多-阿隆索:	粘着斑
FAK:	粘着斑激酶
PV:	pervanadate
YCam:	黄变色。

确认

作者感谢R.Y.钱(UCSD药理学系,CA 92093), f . Cruzalegui(癌症研究,生物研究所Servier,法国),和S.B.Kanner(百时美施贵宝公司,普林斯顿,纽约08543)请提供质粒。工作是联赛的赠款支持反对le癌症(拉西du Bas-Rhin / Haut-Rhin) p .过来,从Ministere de la矫揉造作的a . Hamadi和t . b . Deramaudt CNRS。

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