循环结直肠肿瘤细胞细胞形态学:一个小案例系列

文摘

存在一些方法枚举循环肿瘤细胞(ctc)癌症患者的血液;然而,大多数方法缺乏高分辨率成像,因此,对这些细胞的cytomorphologic特性。转移性结直肠癌患者在这项研究中,我们使用immunofluorescent染色与光纤阵列扫描技术来识别ctc,后续Wright-Giemsa和Papanicolau染色。ctc是相对于对应的小学和转移性肿瘤。结直肠ctc显示标记intrapatient多形性。相应的组织切片相比,细胞从所有网站显示类似的多型现象,表明大肠癌ctc保留多形性呈现稳定增长的地区。他们也常常保留特定cytomorphologic特性出现在病人的主要和/或转移性肿瘤组织。这项研究提供了一个初步的分析cytomorphologic循环结肠癌细胞的特征,为进一步研究提供基础ctc的意义和转移潜能。

1。介绍

癌细胞从原发肿瘤站点的传播到遥远的器官产生一个无法治愈的条件与高发病率相关的死亡率(1]。证据表明,原发性肿瘤细胞进入血液,因此成为循环肿瘤细胞(ctc)通过外周血旅游网站在解剖学上遥远的从原发肿瘤。他们形成继发性肿瘤,最终产生致命的转移,在癌症患者治疗失败的主要原因2,3]。

循环上皮细胞(CEpiCs)患者的外周血中发现各种转移性上皮恶性肿瘤在不同浓度使用几种不同的方法4- - - - - -10]。一般来说,CEpiCs可以确定(使用免疫荧光化验)通过针对epithelial-specific抗原的单克隆抗体,允许他们是有别于正常血细胞(11,12]。设置的病人转移性癌,这些循环上皮细胞通常假定被大多数研究者循环恶性肿瘤细胞。对这一假设是新兴的支持;研究表明基因的变化单一CEpiCs细胞非整倍性,启发性的证据,这些细胞确实是恶性13- - - - - -16]。对于本研究的目的,我们使用CEpiCs的细胞学的特征及其相关性与主活检来支持他们认为恶性肿瘤和今后报告称这些细胞为ctc。

ctc的存在已被证明与不良预后和降低生存在转移性乳腺癌和结直肠癌患者17- - - - - -20.]。有限的试验研究也表明检测ctc的效用转移性大肠癌患者虽然枚举在各种研究存在明显差异(4,20.,21]。ctc提供主之间的链接和转移性肿瘤22]所以识别和表征ctc持有承诺对转移性上皮恶性肿瘤的诊断和治疗管理。此外,隔离和表征这些细胞转移的生物学机制提供新的见解。

大多数CTC检测方法取决于immunomagnetic分离和immunofluorescent标签epithelial-specific抗原,如上皮细胞粘附分子(EpCam)和细胞角蛋白(CK);然而,由于方法学的限制,细胞学的细胞没有明显的细节,和详细的形态学研究和ctc的图片是有限的(13,22,23]。详细描述和形态学的图像类型的ctc发现特别是在转移性结直肠患者更缺乏(23]。

循环肿瘤细胞:仍然不太清楚他们如何进入血液中,频率在血液中被摧毁,他们如何退出血液,和每个CTC是否有相同的转移潜力,也就是说,同样的潜力外渗和发展到一个新的肿瘤转移网站(24]。因此,仅仅列举ctc必须增强研究单个细胞的能力通过额外的形态学和/或分子特性可以提供临床有用的信息以及帮助我们理解转移过程。

我们以前曾报道过一个enrichment-free immunofluorescent染色协议与光纤阵列扫描技术(快速)列举和描述ctc在转移性癌症患者(5,22,25]。方法允许详细的cytomorphologic分析,我们以前报道的详细审查循环乳腺癌细胞。现在我们添加循环结肠癌ctc的有限阿特拉斯,用小系列我们cytomorphologically评估ctc五转移性结直肠癌患者的血。单个细胞中发现血也比归档病人的病理及细胞学标本的主要和/或转移性肿瘤。

2。材料和方法

2.1。收集血液样本

五个转移性结直肠癌患者提供知情同意(CA)拉霍亚的斯克里普斯诊所的机构审查委员会批准。从每个病人,8毫升的外周血被收集在一种罕见的血液细胞收集管(斯特、奥马哈NE),并在24小时内处理。

2.2。Immunofluorescent染色标记ctc的协议

血液样本受到与氯化铵等张裂解缓冲(155毫米KH Cl, 10毫米0.1毫米EDTA, pH值7.4)。旋转5分钟,5分钟后离心重700克,上层清液包含细胞溶解的红细胞被移除。由此产生的有核细胞颗粒在磷酸缓冲盐resuspended (PBS)和分布在专门设计的胶粘剂幻灯片(Marienfeld、德国)有一个活跃的面积62可容纳约2700万有核细胞单层。幻灯片在孵化C了40分钟。细胞然后用2%多聚甲醛固定20分钟,洗净用PBS和permeabilized冷甲醇5分钟,其次是另一个PBS清洗步骤。随后,山羊血清添加10% 20分钟阻止非特异性结合位点,其次是孵化C和单克隆antipan细胞角蛋白(σ,密苏里州)和共轭CD45-Alexa647 (Serotec)抗体了40分钟。PBS洗后,二级抗体,Alexa555(表达载体),增加了20分钟。细胞复染色与DAPI 10分钟和安装水越来越多的媒体。

2.3。快速扫描和ADM-Coupled成像Immunofluorescently ctc的标签

光纤阵列扫描技术(快速)是用来确定ctc如前所述的位置(25]。短暂,氩离子激光激发荧光标记细胞的位置,并确定一个荧光标记细胞的扫描和舞台位置发射时的扫描速率每分钟2500万个细胞。每个FAST-identified对象是再用20 x目标荧光成像通过自动化数字显微镜(ADM)。

2.4。搬迁的ctc形态分析

病理学家使用20 x放大和应用严格的标准ctc定义为细胞角蛋白阳性,CD45负数,DAPI积极(核染色)。枚举的ctc是对所有病人标本20 x。形态学评估荧光ctc进一步细胞学的细节,图片100 x。随后,盖玻片被移除和Wright-Giemsa染色剂和/或Papanicolau应用染色。细胞被重新安置在brightfield进一步cytomorphologic使用校准基准点和成像分析(图1)。

2.5。耐心的分析

主要综述了和转移性肿瘤活检病理学家。建筑和细胞学的特性可用的每个原发肿瘤和转移性肿瘤活检进行了综述。病人状态的时候抽血(稳定的疾病与进步的疾病)是由盲医疗肿瘤学家实验室数据的审查包括东航,放射学,临床医生评估病人的画。

3所示。结果

病人和肿瘤特征归纳如表1。患者不同数量和类型的转移以及他们的治疗;然而,审查的主要肿瘤幻灯片显示都有出现中度分化腺癌。主要组织和转移性组织切片可用时,所有可用的组织切片检查。这5个患者检测ctc从12 - 282每8毫升的血液。虽然不是临床结果的一项研究中,我们注意到,病人被发现进步的疾病有更显著的细胞比病人稳定在抽血的时候。图2在每个病人显示代表ctc发现。

3.1。详细的ctc Cytomorphologic评价

在外周血中,我们发现了一个明显的结肠肿瘤细胞多形性人口结直肠ctc的画廊(如图所示3)。不仅有大型,高nuclear-to-cytoplasm (N / C)比细胞(数字3(一个)和3 (g)),而且细胞与温和的大量的细胞质,收益率moderate-to-low N / C比值(数字3 (e)和3 (f))。整体CTC大小也不同。许多人比周围的良性白细胞(数据3(一个),3 (f),3 (g));然而,也有细胞相同的大小或小于周围白细胞(数字3 (c),3 (d),3 (e))。在某些情况下,较小的提示凋亡细胞显示功能,如不规则核或细胞质凝结或弗兰克分裂成密集的圆形结构(图3 (e))。

引人注目的是频繁的与核轮廓不规则,细胞大叶状或细违规行为(数字3(一个)和3 (b))。一些核大叶状monocytoid出现在形状,或显示一半小伙子配置(图3 (f));核内陷cytokeratin-rich细胞质。在其他细胞中,核不规则规模较小,产生一个精细核不规则轮廓通常圆形或椭圆形的细胞核(图3 (c));这些功能是最有力地证明了高性能Papanicolau-stained细胞在显微镜下检查。

古怪的核位置细胞胞浆内也是一个突出的特性在许多循环结肠癌细胞。在原子核周围的细胞质中扩展了压痕,许多细胞细胞质一侧凸起,被cytokeratin-rich细胞质(数字3 (c)和3 (d))。相应的Wright-Giemsa Papanicolau-stained细胞cytopathologists检查证明“血浆”外观熟悉各种腺癌的细胞学的准备。

3.2。详细的建筑,组织学和Cytomorphologic审查主要/转移性肿瘤

这个小系列的所有主要肿瘤分为中度分化,与建筑功能显示腺异常形成的优势,只有像平板一样的病灶部位的增长。图4显示组织学、细胞学和代表循环肿瘤细胞中发现患者大肠这个组织学的代表所有的病人在我们的系列。坏死炎性组织碎片,腺腔通常包含结肠癌的熟悉的“脏坏死”。腺体异常是由柱状细胞和核增大,着色过深,伸长和分层。在一些高分化腺越少,肿瘤细胞的方法一个立方形的形状,但总的来说主要的肿瘤细胞形状是柱状。单个细胞大小不同;尽管大多数肿瘤细胞大于任何良性细胞周围,有一个明显的肿瘤细胞大小,在小范围的细胞和细胞大小的方法,邻近组织细胞或其他良性间质细胞。N / C比值也很在肿瘤细胞的人口变量;当然高N / C比细胞存在,也有丰富的细胞moderate-to-low N / C比值由于其大量的胞质域。个别肿瘤细胞核也经常显示核小裂片,和/或细核不规则,功能更容易欣赏的细胞学标本细针活检的转移(图4)。肿瘤细胞凋亡或退化个人经常观察,细胞有丝分裂。

3.3。Cytomorphologic ctc的比较初级和转移性肿瘤

相比从原发性和转移性肿瘤组织切片的网站,形态细胞混合循环结肠肿瘤细胞的多形性相似。组织切片的指出某些细胞学的特征,特别是突出的叶状核轮廓,流动人口中一览无遗。,核膜不规则的轮廓在固体组织样本坚持循环肿瘤细胞的人口。最后,在循环显示结肠肿瘤细胞形态学cytokeratin-rich细胞质的古怪的倾向,而固体组织同行出现柱状的形状。

4所示。讨论

比较原发性和转移性结肠肿瘤细胞循环结直肠肿瘤细胞显示了显著的一致性之间的细胞学特征组织隔间如图2- - - - - -4。这些肿瘤组织病理学,中度分化腺癌,柱状肿瘤细胞形成异常的腺体;细胞核不规则波状外形的,经常有裂片的。正常值,主和转移性肿瘤存款多形性明显在单个细胞的肿瘤组织。循环细胞相同的患者保留这个细胞形态学,显示整体多形性与变化大小,形状,和N / C比值。ctc显示核轮廓不规则和叶状,离开中心位于细胞质中对应于一个柱式细胞腺癌。分析支持前提,ctc保留原发肿瘤细胞学的特点和ctc代表随机抽样的许多表型细胞类型出现在主和转移性肿瘤的存款。结果反对这个理论,只有特定的肿瘤细胞进入外周血的子集,比如非常低分化肿瘤细胞“干细胞”的地方,或者只明显死/凋亡的肿瘤细胞死亡。研究结果支持的可能性,循环肿瘤细胞由被动地“流”的组合与小细胞恶性潜能,积极可行的“迁移”细胞,可能会形成进一步转移焦点(26]。

相比之前的ctc的形态学研究乳腺癌,流动人口的多形性大肠癌类似于流动人口在乳腺癌的多形性。然而,似乎是微妙的,但明显的细胞学的区别这两种癌症的类型;循环乳腺癌细胞通常是圆的圆周细胞质,而许多的循环结肠癌细胞出现偏心,细胞质凸出一侧。ctc之间的细微差别的形状两种肿瘤类型的感觉可能是由于细胞形状的肿瘤类型。乳腺癌的细胞通常是立方形的而不是柱状,和相应的分离ctc显示细胞质均匀分布没有明显的偏心。可以推测,更夸张的柱状的形状和/或基底的原始肿瘤细胞的细胞核,细胞质越古怪会出现当从基质细胞分离,进入循环。未来评估额外的情况下的腺癌原发肿瘤分化很好或很低分化将进一步解决这一问题的出现细胞间连接组织和流通。

形态学评价循环肿瘤细胞的特点从不同恶性肿瘤包括nonmetastatic疾病患者将有助于我们未来的转移过程的理解。此外,CTC枚举和表征进入主流癌症的诊断和治疗,熟悉CTC的外观和可变性的特征将重要的病理学家。本系列小表明结肠癌细胞循环外观没有什么不同的细胞组织在一个病人,肿瘤类型之间,细胞循环可能不同的外观。作为新技术的进一步评估上皮肿瘤出现循环的组成部分,这些细胞可以作为一个方便的实时“活检”活跃的肿瘤病人的身体。

确认

作者感谢斯克里普斯诊所,研究护理人员拉霍亚,自愿的病人和收集血液标本。他们也感谢Chris Rombaoa Papanicolau染色和Elvia Nunez手稿准备。这项工作是支持的斯克里普斯诊所,私人捐助库恩实验室,DM Wayne-reen奖学金和弧相交,国立卫生研究院国家癌症研究所资助。这是20270号TSRI手稿。

引用

1. a·艾克尔斯和d·r·韦尔奇”转移:最近发现和新的治疗策略,”《柳叶刀》,卷369,不。9574年,第1757 - 1742页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j·l·Townson g . n . Naumov和a·f·钱伯斯,“细胞凋亡在肿瘤进展和转移的作用,“当前分子医学,3卷,不。7,631 - 642年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. 布劳恩,b . s . Cevatli c Assemi et al .,“比较分析骨髓和淋巴结微小转移的淋巴结阴性的乳腺癌患者接受辅助治疗,“临床肿瘤学杂志,19卷,不。5,1468 - 1475年,2001页。视图:谷歌学术搜索
4. w . j Allard, j·马泰拉,m·c·米勒et al。”外周血循环肿瘤细胞的所有主要癌但不是良性的疾病,患者在健康受试者或“临床癌症研究,10卷,不。20日,第6904 - 6897页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. h . b .谢长廷,d . Marrinucci k·伯特利et al .,“高速循环肿瘤细胞的检测,生物传感器和生物电子学,21卷,不。10日,1893 - 1899年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. s . Nagrath l . v . Sequist s Maheswaran et al .,“罕见的癌症患者循环肿瘤细胞的分离芯片技术,”自然,卷450,不。7173年,第1239 - 1235页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. k .那位o·卡马拉,a Kavallaris et al .,“监控的反应循环上皮肿瘤细胞在乳腺癌辅助化疗可以检测病人的早期复发的风险,”临床肿瘤学杂志,26卷,不。8,1208 - 1215年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. s . Riethdorf h . Fritsche诉穆勒et al .,“检测外周血循环肿瘤细胞的转移性乳腺癌患者:验证研究细胞的搜索系统,”临床癌症研究,13卷,不。3、920 - 928年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. d·r·谢弗·m·a·Leversha特区Danila et al .,“患者循环肿瘤细胞分析进步castration-resistant前列腺癌,”临床癌症研究,13卷,不。7,2023 - 2029年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 总值s·j·科恩,r·k·Alpaugh s . et al .,“隔离和表征循环肿瘤细胞在转移性结直肠癌患者,”临床大肠癌》第六卷,没有。2、125 - 132年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. r·摩尔”,细胞角蛋白标记的分化上皮肿瘤的诊断,“亚细胞生物化学31卷,第262 - 205页,1998年。视图:谷歌学术搜索
12. k . Pantel g . Schlimok m . Angstwurm et al .,“方法论的分析采用筛查传播上皮肿瘤细胞在骨髓,“Hematotherapy杂志,3卷,不。3、165 - 173年,1994页。视图:谷歌学术搜索
13. t . Fehm a . Sagalowsky e·克利福德et al .,“患者细胞遗传学证据表明,循环上皮细胞癌是恶性的,”临床癌症研究,8卷,不。7,2073 - 2084年,2002页。视图:谷歌学术搜索
14. j . a . Schardt m . Meyer c·h·哈特曼et al .,“基因组分析单一cytokeratin-positive细胞从骨髓揭示了早期乳腺癌突变事件,“癌症细胞,8卷,不。3、227 - 239年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. r . Gangnus兰格s、e·布莱特k . Pantel和m . r . Speicher”基因组分析的可行和增生性micrometastatic细胞早期乳腺癌患者,”临床癌症研究,10卷,不。10日,3457 - 3464年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. s . Maheswaran l . v . Sequist s Nagrath et al .,“检测表皮生长因子受体突变的肺癌细胞传播,”《新英格兰医学杂志》上,卷359,不。4、366 - 377年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. m . Cristofanilli博士g·t·巴德·m·j·埃利斯et al .,“循环肿瘤细胞、疾病进展和生存在转移性乳腺癌,”《新英格兰医学杂志》上,卷351,不。8,781 - 791年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. m . Cristofanilli博士d·f·海耶斯g·t·巴德et al .,“循环肿瘤细胞:新诊断转移性乳腺癌的预后因素,”临床肿瘤学杂志,23卷,不。7,1420 - 1430年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. J.-Y。Pierga c . Bonneton a Vincent-Salomon et al .,“采用免疫检测肿瘤细胞的临床意义使用数字显微镜在乳腺癌患者外周血和骨髓,“临床癌症研究,10卷,不。4、1392 - 1400年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. s·j·科恩,c . j . a .赌注:业务et al .,“关系循环肿瘤细胞的肿瘤反应,无进展生存,和转移性结直肠癌患者的总生存期,“临床肿瘤学杂志,26卷,不。19日,3213 - 3221年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. j .即将m . l .大师j .朋地et al .,“循环肿瘤细胞在结直肠癌:与临床和病理相关变量,“《肿瘤学,19卷,不。5,935 - 938年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. d . Marrinucci k·伯特利,r·h·布鲁斯et al .,“案例研究的循环肿瘤细胞的形态学变化,“人类病理学,38卷,不。3、514 - 519年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. b . Molnar a . Ladanyi l . Tanko l .爆炸回流和z . Tulassay”外周血循环肿瘤细胞集群的结直肠癌患者,”临床癌症研究,7卷,不。12日,第4085 - 4080页,2001年。视图:谷歌学术搜索
24. k . Pantel r·h·Brakenhoff b·布兰德,“检测、临床意义和特定的传播肿瘤细胞的生物特性,”自然评论癌症,8卷,不。5,329 - 340年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. r·t·Krivacic A . Ladanyi d . n .咖喱et al .,“rare-cell探测器对癌症,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷101,不。29日,第10504 - 10501页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. m . Bockhorn r . k . Jain, l·l·穆恩”主动与被动机制转移:癌细胞爬进血管,还是推?”柳叶刀肿瘤学,8卷,不。5,444 - 448年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2010 Dena Marrinucci等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。