文摘
Engell介绍50多年以来,循环肿瘤细胞(ctc)一直在评估癌症患者和他们的检测与临床结果,在食道、胃和结肠直肠癌。精制技术的可用性,识别的ctc外周血正成为一个有用的工具对于恶性肿瘤的检测,监测疾病进展和测量对治疗的反应。然而,越来越多的证据表明各种因素负责疾病进展。分析一个CTC因此不可能准确预测疾病进展的标志有足够的分辨率和再现性。这里我们讨论当前ctc的概念,总结现有的技术检测和表征,并旨在提供一个全面的更新在ctc的临床影响胃肠道(GI)恶性肿瘤。
1。介绍
循环肿瘤细胞(ctc),也被称为“白血病阶段”的固体肿瘤,包括转移的血性的路线和与各种恶性肿瘤相关的临床结果,包括乳腺癌、食管、胃、结肠直肠癌。
肿瘤细胞脱离原发肿瘤,血液通过循环遥远的网站和旅游,在那里他们可能发展成二次肿瘤,可能导致转移病灶,癌症患者死亡的主要原因。恶性肿瘤细胞的检测血液自年以来建立的1],最近的研究证明了ctc的恶性性质(2,3]。这包括以下步骤;肿瘤的生长和肿瘤相关血管生成,血管新生肿瘤入侵和上皮间充质转变(EMT)内渗,传播,在机关逮捕,溢出,增殖,和远处转移的形成。肿瘤起源于上皮或造血表现出不同的倾向于转移;一些没有或延迟转移性肿瘤扩散,其他显示转移的诊断。
精制技术的可用性,识别的ctc外周血正成为一个有用的工具在某些恶性肿瘤的检测,监测疾病进展和测量对治疗的反应。本文将讨论ctc的当前值,总结当前可用的检测和表征技术,和应该提供一个全面的更新在胃肠道(GI)恶性肿瘤的临床意义。
2。循环肿瘤细胞的概念
尽管多数实体瘤患者进行多峰性治疗(例如,各种组合的手术、化疗、放疗),传播的恶性肿瘤细胞,和转移性疾病仍然是癌症相关死亡的主要原因。原发肿瘤生长,新血管形成和持续的肿瘤血管生成,形成新的血管内皮前体细胞,先决条件是固体恶性肿瘤的生长和进展(4]。最初,肿瘤生长为无血管的质量,可以在预先存在血管微环境内增殖。当肿瘤生长到一定大小约2 - 3毫米,肿瘤需要自己的新的和专用的脉管系统(5]。所谓的“血管生成开关”,诱导肿瘤血管或切换到一个血管生成表型,被认为是肿瘤恶性过程的特点和需要传播和发展6- - - - - -8]。肿瘤细胞可能侵入邻近的正常血管已经在原发肿瘤部位,或者他们可以使用new-formed毛细血管生长固有肿瘤由于肿瘤相关的血管新生。在这两种情况下,有一个组织和肿瘤特定诱导上皮间充质转变(EMT),细胞粘附分子的表达变化(如整合蛋白、层粘连蛋白)和蛋白酶的激活途径(如矩阵metalloproeteinases),最终使肿瘤细胞进入主机循环(9]。
斯蒂芬·佩吉特氏历史以来发现的“种子和土壤”概念,即ctc倾向于转移某些器官的网站,这是选择性的细胞来源于特定的肿瘤(10),在全球范围内的研究试图揭示潜在的分子机制,使“种子和土壤”一起促进转移(11,12]。当前定义的“种子和土壤”假设由三个原则;起初,肿瘤抑制基因不同的肿瘤细胞亚群,每个不同转移潜能。其次,将由这些细胞转移,将成功地完成所有步骤在转移过程中第三,具体选择的“土壤”主要是归因于肿瘤细胞和器官微环境之间的相互作用。这些交互包括肿瘤细胞特定的内皮细胞识别抗原和响应当地生长因子(11]。
2.1。免疫系统和CTC交互
因为ctc和其原发肿瘤通常被认为是外国组织患者免疫系统,他们有能力形成microtumors集群,从而逃避宿主的免疫监测和对当地细胞选择性生长优势在遥远的网站9]。事实上,5 - 10的聚合神秘ctc可以逃避宿主的免疫系统,这可能会推动proangiogenic招聘(增长)当地微环境因素和新的细胞表面标记物的表达13]。事实上,一些ctc显示异型的细胞表面标记物的表达模式相比,他们的主要肿瘤。因此,ctc可能影响与病人的免疫防御,有些难以预测的“生物的命运”CTC-derived microtumors [13]。
2.2。本地入侵、Tumor-Dissemination溢出/内渗和植入
传播肿瘤细胞的许多方面仍有待确定。公认的不过是转移性疾病主要是由于肿瘤的分子特征(种子)和宿主微环境(土壤)10,11]。肿瘤的不受监管的增长归因于遗传事件的连环收购,至少部分特征的增强细胞增殖,沉默的基因参与细胞分化的抑制和绕过基因参与细胞凋亡(14]。成人肠上皮细胞分化程度证明只有短寿命一个完整的自我更新时间约为2 - 7天(15]。由于他们的长寿和自我更新属性“肿瘤干细胞”,一小群细胞恶性肿瘤,更倾向于积累这些致癌突变(16,17]。他们因此被认为是负责肿瘤的生长和发展18- - - - - -20.]。这使一个复杂的细胞间串扰的相邻结构,包括基质和癌细胞。甚至在癌症细胞穿透基底膜和成为入侵,他们成功刺激新血管形成基质膜的一边,显然通过调度血管生成因子,VEGF和EGF等(5]。此外,肿瘤坏死导致炎性细胞的招聘可以提高当地生产的趋化因子(引发IL1B)和由相邻的基质细胞生长因子(7,21]。因此,基质金属蛋白酶(MMPs)是由炎症细胞在相邻的基质和能够降解细胞外基质(ECM),进一步促进肿瘤局部侵犯及表型的改变,最终导致肿瘤细胞传播和转移性疾病(22]。
肿瘤细胞通过基底膜高度移动和快速穿透血管内皮或淋巴管(内渗),他们在遥远的器官循环ctc和可能溢出网站。这些循环肿瘤细胞显示基因族群和表型的变化。事实上,有越来越多的证据,他们中的一些人是凋亡,而另一些人则表示“多能祖细胞”的标志23,24]。一旦到达靶器官,ctc经常改变他们的更多上皮表型压制在EMT (25]。以这种方式mesenchymal-like ctc能接受mesenchymal-epithelial过渡(满足)和恢复增殖的能力26]。在某些情况下,肿瘤细胞也可以入侵多细胞集群或microtumors的过程称为“集体迁移”(27]。这些microtumors就像循环肿瘤微栓塞(CTM)和被认为是高转移潜能。因此,他们可能会产生转移没有溢出通过附加血管壁上和增殖在脉管系统和ultimatively诱导这些血管壁的破裂。因此微和macrometastasis可能要么来自,ctc从nonextravasated ctm或有限的增殖和血管壁破裂后(28,29日]。
3所示。方法考虑ctc的检测
各种方法目前用于浓缩和检测ctc从外周血3,29日]。然而,他们的检测和表征受到列举了使用,通常非特异性,或非敏感检测方法导致不一致的研究结果。事实上,目前没有理想的方法和一些限制适用于描述以下方法。然而他们中的一些人可能会克服,如果结合使用25,30.- - - - - -33]。最常见的CTC浓缩技术和检测讨论如下(表1)。
3.1。密度梯度分离单核的细胞
密度梯度分离单核的血液中细胞和ctc从其他细胞执行使用商用工具如Lymphoprep(奈科明,奥斯陆,挪威),OncoQuick(格林尼,Frickenhausen,德国),或其他类似的密度梯度的液体。这个过程生成一个分层分离基于细胞的细胞密度。离心后,从下到上、下面层发现:红细胞、中性粒细胞、密度梯度,单核细胞和血浆,顶层。虽然添加多孔隔板(OncoQuick)密度梯度阻碍了其与全血混合,用这种方法仍有局限性。这些特别包括迁移ctc的等离子体分数和聚合物的形成底部的梯度。
3.2。直接浓缩过滤的循环上皮细胞
上皮细胞的直接浓缩过滤是基于观察,绝大多数的外周血细胞属于人体中最小的细胞(8到11嗯)。它们可以消除通过血液过滤聚碳酸酯膜校准毛孔8嗯(29日]。尽管这种方法只涉及一个步骤,它不是高效的ctc浓缩的过程中。
3.3。Immunomagnetic细胞浓缩
Immunomagnetic细胞浓缩CTC浓缩的是最常用的技术。这种方法可以执行本身或与其他物理集成(密度梯度,直接过滤)或非物质等下游分子方法定量实时逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)或荧光原位杂交(鱼)。几个现在协议已经开发和商业化。他们的产量范围从-倍CTC浓缩和rt - pcr相比通常避免细胞裂解,从而使CTC的直接计数(29日]。这些系统依赖于样本的ctc的积极选择通过抗体与磁珠的绑定目标上皮或肿瘤特异性的细胞表面抗原,如细胞角蛋白(中正),人类上皮抗原,上皮细胞粘附分子,以及前列腺特异抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、人类上皮生长因子受体2 (her - 2)。因为没有可用的抗体是100%的肿瘤或组织特定的(45),假阳性(specifity)和假阴性(灵敏度)结果继续实施与immuno-magnetic检测技术的一个重要问题。最近,负选择的白细胞CD45和CD61特定抗体除了提到的积极的选择方法应用,以进一步提高特定浓缩的ctc外周血(CellSearch Veridex LLC,美国力登,新泽西,美国)(33,36,46]。显微镜的使用半自动的设备筛选大量的应用幻灯片已经帮助增加的速度和再现性immuochemical分析(47]。在商用半自动的方法,CellSearch系统(美国新泽西州Veridex LLC,美国力登),已被联邦食品和药物管理局(FDA)——批准用于转移性乳腺癌和结肠癌患者,最近获得了相当大的关注,因为它允许基于自动化immunomagnetic上皮细胞粘附分子(EpCAM)浓缩,以及cyotokeratin染色CTC的血液样本。尽管这种技术消除了大部分白细胞,nonepithelial细胞和ctc的存在,不表达上皮抗原(EMT)仍被认为是这种方法的主要缺陷。immunomagnetic分离的主要优势是ctc的直接可视化和定量的检测活细胞无细胞溶菌作用的需要,因为它是如此的pcr方法。
3.4。逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)
检测癌症患者的外周血常规ctc的逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)据报道几个基因,例如,东航,CK-19,或-2048,49]。大约20年前推出以来,rt - pcr技术已成为最常见的用于检测ctc (25]。这种方法的主要优势是它的灵敏度,目前被认为是高于其他协议。尤其如此协议,信使rna分离浓缩后ctc从全血(31日]。因此,rt - pcr通常被认为是最敏感的化验检测肿瘤特异性分子标记。此外,rt - pcr也提供高specifity,感兴趣的特定基因的引物设计和整个基因组DNA或RNA可以分析在一个单一的反应。此外,rt - pcr的肿瘤特异性mRNA的特点是高灵敏度相比,蛋白质通常方法和范围的探测范围内1到10之间的肿瘤细胞血液单核细胞(50,51]。然而,rt - pcr的灵敏度高,尽管重要的临床使用,遇到假阳性结果的时候是有问题的,因为它与样品污染(基因组DNA与互补),非法的转录(低级的某些基因的特异性的转录),或放大假基因(52,53]。mRNA标记的选择使用另一个限制,因为理想的标记可能会高过表达在所有肿瘤细胞从一个给定的肿瘤,但不表达在白细胞和nonepithelial循环细胞。确实有几个研究报告检测CK19、CK20,东航,PSA在循环nontumerous(上皮)细胞38,51- - - - - -55]。因此,它是非常重要的仔细设计引物和探针,选择“正确的候选基因”和理想结合上述的一些物理浓缩技术与rt - pcr等分子为基础的方法或鱼(33]。
3.5。微芯片技术(CTC-Chip)
新方法浓缩最近报道,利用微流体平台(“CTC-chip”)能够有效和可行的ctc的选择性分离从末梢全血样品56]。Nagrath等人描述之间的“CTC-chip ctc在全血中使用EpCAM涂布microposts和层流条件控制,以确保最佳的细胞和microposts之间的交互。自从CTC-chip可以直接处理全血,作者声称的纯度,是100倍高于其他技术可以实现提供(56]。然而,在前瞻性临床试验进一步验证是必要的。
4所示。ctc在胃肠道恶性肿瘤的临床意义
ctc的存在转移癌患者通常是与临床疗效不佳(9]。最初,这已被证明在消化道恶性肿瘤,如乳腺癌。Cristofanilli博士等人表明,转移性乳腺癌患者可以隔离成有利和nonfavorable团体(参照PFS-progression自由生存和OS-overall生存)根据CTC计数。这是一个评估immuno-magnetic分离技术(CellSearch Veridex LLC,美国力登,NJ)导致FDA批准用于转移性乳腺癌(2005年36]。
前瞻性多中心研究的Cristofanilli博士et al . 177可衡量的转移性乳腺癌患者(如评估根据世界卫生组织的标准)是检测血液水平的ctc,之前治疗的患者开始一个新行,第一个后续访问。了研究的结果显示在基线水平的循环肿瘤细胞,也就是说,在开始一个新的治疗转移性疾病的患者。患者的ctc水平等于或高于5每7.5毫升的全血,与集团相比少于5循环肿瘤细胞/ 7.5毫升,较短的无进展生存(2.7个月和7.0个月,P 措施)和总生存期(10.1个月和短18个月,P 措施)。这个区别组织坚持(无进展生存,2.1个月和7.0个月;P 措施;和总生存期,8.2个月18个月;P 措施)的时候第一个后续访问,表明患者的比例(从49%到30%)组与不利预后显示从治疗中受益。作者得出结论,CTC的治疗之前的数量是一个独立的预测PFS和操作系统在转移性乳腺癌患者36]。
与乳腺癌相比,有更少的研究在GI-cancer和结果不一致(表2)。然而,鉴于最近专注于k - ras基因突变如何影响转移性结直肠癌的临床结果和anti-EGFR疗法与西妥昔单抗(39- - - - - -41,57),评价k - ras基因突变的病人正迅速成为常规检查的一部分在临床肿瘤学目前主要依靠formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织。外周血循环肿瘤的DNA测试筛选突变居民在父肿瘤(血液活检)是不受很多因素限制的测试FFPE-derived标本。因此,血液是方便,而不是倾向于选择性偏差,并提供一个连续的DNA来源。因此,测试循环肿瘤DNA能够筛选突变,如k - ras基因突变的癌基因和当时存在的治疗与依赖归档组织样本的测试之前(被收购42,58]。
4.1。ctc在食道癌
尽管不是很多研究已经进行和结果不一致,大多数的研究探索ctc作为临床的分子标记结果已经证明了他们的临床实用程序(31日,43,59,60]。刘等人的事实上,最近的一项研究,旨在建立一个定量评估系统ctc的角色从病人外周血手术切除治疗食道癌的43]。一百五十五年53食道癌患者外周血样本收集手术前(),(B0)后立即手术,术后第三天(B3)。直接实时定量rt - pcr方法基于癌胚抗原(CEA)信使rna基因表达检测设计的ctc。作者表现出显著的差异和B0 (之间),和()。百分之五十的患者(= CTC的比例B0)显示肿瘤手术后1年内复发,而患者的概率只有14.3%()[43]。这些发现符合最近的一份报告对我们组的成员从外周血探索CTC的直接定量rt - pcr方法,评估使用CTC survivin-mRNA表达式作为CTC计数外周血(代理31日,60]。在他们的初步研究结果,作者可以表明生存素mRNA表达的直接定量实时rt - pcr分析胃肠道癌症患者外周血的技术上是可行的,生存素mRNA水平下降价格fi后,不能完整的手术切除(根据UICC R0-resection)和可能是一个有前途的分子标记的完整性手术切除(分子R0标记)31日]。同一组的后续研究分析了62名食道癌患者的外周血样本,病人安排手术切除。25例(40.3%)患者鳞状细胞癌和37(59.7%)腺癌。24例(38.7%)患者新辅助放化疗进行局部晚期疾病。全血是一天前的操作,在所有的病人R0-resection后10天。术后生存素水平明显低于41.2%的切除患者术前的水平。在接受新辅助放化疗的病人中减少术后存活素mRNA表达与腺癌中发现83.3%的患者相比,50%与鳞状细胞癌(Mann-Whitney测试:),这表明生存素水平特别是减少腺癌后,新辅助化疗和手术切除。由同一组其他研究显示,食道癌患者显示较小的组织病理学反应新辅助radiochemotherapy证明显著更高的CTC水平评估的ERCC1 mRNA-expression水平在他们的血液44]。此外,类似的结果可以显示死亡率蛋白激酶(DAPK)和腺瘤息肉病杆菌基因(APC)甲基化地位评估methylation-specific实时rt - pcr。事实上,36的59例(61.0%)与食管癌可检测水平的甲基化DAPK或APC启动子DNA和术前检测与不利预后显著相关的多变量模型(44]。
4.2。ctc在胃癌
胃腺癌是最常见的一种癌症,全世界癌症死亡的第二大原因(61年]。尽管联合放化疗后完整的手术切除提供了适度的改进操作系统和PFS (MAGIC-trial) [62年),肿瘤复发后治疗切除仍然是一个严重的问题在本地化胃腺癌患者的管理。为了识别标记肿瘤复发Miyazono等人调查57胃癌患者的血样ctc的存在(63年]。ctc密度梯度分离后,CEA-specific实时rt - pcr和相关执行时间进程在外科手术和肝肿瘤复发的出现。有趣的是,作者可能表明CEA-mRNA无法检测到对照组的健康志愿者和15良性疾病患者。相比之下,共有21个胃癌患者(36.8%)CTC作为检测到阳性CEA-specific rt - pcr和积极率与肿瘤浸润深度有关。此外,作者发现胃癌患者高水平的东航更可能罹患系统性疾病。最近,Ikeguchi Kaibara证实这些发现;尽管作者指出,ctc可能很快被淘汰东道主循环,因此可能出现只有很短的时间内64年]。其他团体也报告了类似的结果相对异型的研究人群胃肠道恶性肿瘤患者(65年]。
4.3。ctc在结肠直肠癌
ctc一直在研究结直肠癌(CRC) (30.,66年)和最近的研究表明患者的临床效用转移CRC (33,67年]。她们在一次前瞻性多中心临床试验中,430名患者开始一个新的第一、二、三线系统性治疗外周血获得枚举的ctc (CellSearch Veridex LLC,美国力登,新泽西,美国)在基线(预处理)和随后的时间点。作者的经验显示,CTC计数在基线,并在治疗期间,是最强的独立预后标志与其他临床因素相比PFS和操作系统(33]。病人的人口是异构在这项研究中,作者报道在同一研究对象与延长随访时间来评估基线CTC计数的预后意义的疗法,类型的治疗,和其他重要的临床特点67年]。有趣的是,结果仍然非常一致的原始试验相比,近一倍的PFS和操作系统对患者有利与不利基线ctc。此外,基线升高CTC计数在病人和临床亚组与不良临床结果在所有子组。PFS也是一般劣质升高患者基线ctc,尽管这个发现没有达到统计学意义的水平。因此,作者认为虽然东航升高可切除的CRC(可能是一个糟糕的预后因素68年),不支持显示数据转移CRC的预后价值。因此,作者认为下一个大型转移CRC试验评估新的系统性治疗应该利用ctc作为操作系统的分层因素(67年]。
5。总结和未来的角度
癌症生物学的进展已经导致扩大我们的理解癌症的分子和细胞机制的发展,癌症转移,抵抗癌细胞(广播)的化疗。尽管检测最近的进步,手术切除和(neo)佐剂(电台)化疗,选择最有利的治疗策略在胃肠道恶性肿瘤仍然是一个挑战,也是因为缺乏验证预测和预后分子标记(68年]。一个多学科的方法,包括手术、定制(广播)化疗,单独或结合将有必要改善胃肠道癌症患者的结果。此外,肿瘤耐药性的高发病率仍然是一个有效的癌症治疗的主要障碍。对临床医生来说,这是非常重要的区分预后和预测分子标记。预测标记与特定的治疗,主要是评估通过临床反应,时间进程,或毒性。相比之下,预后标志物反映疾病的自然/进取,独立于特定的治疗,通常是评估的操作系统。在某些情况下,预测标记可以携带预后重量(69年),都扮演了一个重要的角色在未来的评价对于一个给定的治疗方案。
在过去几十年已经发现了几个候选分子标记。然而,对于几乎所有这些标记必须获得至少为分子分析肿瘤组织活检。相比之下,非侵入性的分子标记,如ctc (67年),生殖系多态性(70年),或dna甲基化71年)可能会提供一个快速、无创的方法。例如,监测和术后CTC survivin-mRNA水平可能提供重要的临床实用程序的完整性在预测手术切除(分子R0标记)31日]。尽管肿瘤标记物CEA等广泛用于胃肠道恶性肿瘤患者的随访,缺乏敏感性仍然没有解决。因此,检测和表征ctc可能提供了一个新颖的方法,可用于评估肿瘤复发和转移性疾病的风险分层患者化疗,新型治疗靶点的识别和监控系统性抗癌疗法。然而,越来越明显的是,疾病进展取决于众多复杂的途径,并且分析一个CTC-marker不可能精确地预测疾病进展的有足够的准确性和重现性。此外,目前的研究受到小样本大小、异构的患者群体,最重要的是缺乏标准化的方法检测和表征的ctc。正在进行的和未来的临床试验将承诺为进一步改进优化并指定(电台)单独化疗,不仅延长生命,而且提高生活的质量。