文摘
最近的研究表明,TJ-41,草本药物,具有化疗效果。因此,本研究进行探讨抗癌的TJ-41对人类乳腺癌细胞的影响。TJ-41抑制人乳腺癌细胞株的增殖剂量依赖性。流仪分析表明,DNA合成的减少与诱导细胞凋亡有关。在这两种细胞系,细胞凋亡caspase-9抑制剂Z-LEHD-fmk被废除,但被caspase-8抑制剂Z-IETD-fmk弱抑制,表明caspase-9激活参与TJ-41诱导细胞凋亡。此外,TJ-41刺激的磷酸化c-Jun NH2-terminal激酶(物)和预处理的乳腺癌细胞物抑制剂SP600125完全废除TJ-41诱导细胞凋亡。我们的数据也表明联合治疗TJ-41和研究者用大大强化了研究者用两种乳腺癌细胞株凋亡的影响。综上所述,这些数据表明,TJ-41可能提供一种新的化疗治疗乳腺癌。
1。介绍
尽管几个世纪的理论蜿蜒和科学探究,乳腺癌(BrCa)仍然是一种新兴的医学问题1]。据世界卫生组织统计,有超过120万人将每年在世界范围内被诊断出患有乳腺癌。BrCa新生的美国女性的平均寿命风险是12%,这个风险更高的患者的某些风险因素如初潮早,nullparity,绝经后期(2]。美国癌症协会估计,在216年000例新病例的乳腺癌诊断和大约40 000名妇女死于这种疾病。主要努力减少乳腺癌的死亡率和发病率是专注于开发更好的乳腺癌治疗。
在过去的几年里,它已成为明显的,癌症患者积极寻求补充/替代方法为与对抗疗法的辅助化疗或单独作为主要的替代疗法。在最近的一项研究评估补充和替代医学(CAM)的患病率在综合癌症中心,83.3%的患者使用CAM方法至少1和62.6%使用维生素和草本植物(3]。一些最近的研究支持一些草药公式的有效性和安全性。此外,这些研究表明,这些补救措施有效地工作在某些情况下,传统的西方治疗失败或被证明是不足以提供姑息治疗。nonblind,例如,随机控制临床试验在日本进行显示,sho-saiko-to,七种中草药的提取物,帮助防止肝硬化患者肝癌(4]。
中药药物的使用,一个广泛使用的历史(3000年)在中国近年来已经增加,因为他们的安全,几乎没有副作用(5]。许多草药配方被认为有滋补效果的身体功能。其中,TJ-41名叫Bu-Zhong-Yi——中国和日本Hochu-Ekki-To Qi-Tang,被认为是最好的在营养的重要energy-Qi [6],对抗化疗造成的不利影响7- - - - - -9]。细胞培养(10],动物研究[11,临床试验表明,TJ-41公式可能抑制肿瘤细胞增殖,提高免疫淋巴细胞的活性,改善癌症患者的幸福(12]。因此,本研究的首要目标是描述TJ-41对激素敏感和不敏感的影响乳腺癌细胞系(MCF-7和mda - mb - 231, resp)。。
5 -氟尿嘧啶(研究者用)是一种DNA损害药物通常被用作化学治疗剂启动细胞凋亡,抑制肿瘤生长。研究者用启动细胞凋亡通过瞄准thymidylate合成酶(TS),和直接的研究者用代谢物DNA和RNA (13]。这种药物已普遍用于治疗各种类型的癌症包括乳腺癌、头,胃和结肠癌。理想情况下,化疗药物应该只专门针对癌细胞通过诱导细胞毒性或抑制细胞生长的效果,从而减少了肿瘤的生长而不影响正常细胞。传统化疗的有效性遭受由于缺乏特异性,快速的药物代谢,内在和获得性耐药以及由于高剂量诱导的副作用。这产生一个瞬变的患者的生活质量下降。这些问题可以克服低剂量治疗的药物组合与其他天然化合物或药物,这可能提高抗增殖效果。因此,本研究的第二个目的是探索研究者用的综合效应和TJ-41 MCF-7和mda - mb - 231细胞系。
2。方法和材料
2.1。制备TJ-41
TJ-41从西安购买国家中药合作,由原油标准化提取物10草药。植物材料和其特定的比率(克)公司文献中描述黄芪(10.0克),人参(10.0克),白术lancea粉末(10.0克),Angelicae sinensis(7.5克),柴胡根(5.0克),甘草glabra根(3.8克),粉末升(2.5克),Ziziphus zizyphus(5.0克),柑橘unshiu皮(5.0 g)生姜(1.3 g)。七十五克提取TJ-41倒在一起的玻璃容器和浸泡24小时2000毫升自来水在冰箱里。第二天,混合煮超过35分钟减半原来的体积。煎煮时过滤滤锅热,和体积调整冷却后用水1000毫升。调整后的汤是离心机(8.000转10分钟)和上层清液被按顺序传递通过0.45 -消毒m和0.22 -m过滤器。的股票解TJ-41(75毫克/毫升)整除为50毫升离心管和存储C。
2.2。细胞培养
人类乳腺腺癌(MCF-7)和ER(mda - mb - 231)从写明ATCC细胞系得到。MCF-7细胞系(雌激素受体阳性)是来自乳腺癌胸腔积液和MDA-MB 231 (雌激素受体阴性)是来自另一个乳腺癌患者的肺转移。细胞系生长在单层培养的DMEM(杜尔贝科修改鹰的介质)补充10% (v / v)胎牛血清,和1% (v / v) antibiotic-antimycotic代理。细胞融合在增长C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司2在空气中,通过每周用0.25%胰蛋白酶。实验进行了对数期细胞的增长。
2.3。扩散试验和可逆性研究
人类乳腺癌(BrCa)细胞系被播种密度在24-well组织培养菜肴和允许附加在一夜之间。细胞周期同步,BrCa细胞在无血清培养基培养24小时。一式三份样品的细胞TJ-41处理时间和浓度表示的实验。在过去的6个小时的治疗,细胞脉冲与(3H]胸苷(1Ci毫升−1据布)和处理et al。14]。结果表示为代表的一部分3H]胸腺嘧啶核苷掺入从一井与控制未经处理的样品。可逆性研究,MCF-7和mda - mb - 231细胞BrCa如上所述除外,治疗后细胞周期的同步与375年他们孵化TJ-41 g / mL。2天后,介质被和细胞进一步孵化新的无毒介质2天。在实验中,介质取代科汉解释说新鲜的含药或无毒介质每24小时。孵化的末尾,细胞增殖是评估公司的3H]胸苷如上所述。化验,每个浓度(每次),一式三份井和至少三个独立的实验。
2.4。通过流式细胞术DNA的分析内容(Hypoploid细胞)
MCF-7和mda - mb - 231细胞的密度被播种在six-well文化菜肴。细胞周期同步,BrCa细胞在无血清培养基培养24小时。细胞被接受或没有75g / mL TJ-41和0.5研究者用(西格玛奥德里奇有限公司圣路易斯,密苏里州,美国),并通过胰蛋白酶化后48小时。细胞在2000转离心5分钟,用磷酸盐(PBS)和70%乙醇固定,然后进行流仪分析(Epiccs XL-MCL,贝克曼库尔特)后propidium碘标记。这个试验进行至少3独立乘以每个治疗组。每个实验条件最少细胞进行了分析。数据是使用Expo32Acquision软件(应用Cytomety系统,贝克曼库尔特,迈阿密,佛罗里达州)。细胞的百分比subdiploid DNA被世博会32 ADC量化(Cytomety应用系统,贝克曼库尔特,迈阿密,佛罗里达州)软件通过绘制荧光强度和细胞的数量。细胞的比例位于左边的G1峰、诊断亚二倍的细胞失去了DNA,是作为凋亡细胞的比例15]。实验使用抑制剂、细胞使用10物抑制剂SP600125 M, caspase-9特定抑制剂Z-LEHD-fmk或10M caspase-8特定抑制剂Z-IETD-fmk TJ-41前2小时凋亡的治疗和评估。这个实验中使用的抑制剂都购自Calbiochem圣地亚哥,加州,美国。
2.5。胞质提取物的制备和免疫印迹分析细胞色素c的释放
冰冷的PBS和BrCa细胞被洗两次刮掉这些盘子。细胞被收集在500 g离心10分钟。细胞颗粒resuspended于500年L提取缓冲区包含210毫米甘露醇,70毫米蔗糖,20毫米HEPES-KOH, 50 mM氯化钾,EGTA 5毫米,2毫米MgCl2,二硫苏糖醇1毫米,0.1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物和蛋白酶抑制剂(完整的鸡尾酒;罗氏分子生化药剂,印第安纳波利斯,印第安纳州)。在冰上孵化了30分钟后,细胞用30秒。匀浆在离心机5分钟c .上层清液收集并进一步离心机30分钟C细胞溶质。25微克的总蛋白,由布拉德福德(Bio-Rad)方法,解决在12% SDS-polyacrylamide凝胶电泳和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。膜被5%的脱脂奶粉TBS(20毫米Tris-HCL 8 g / L氯化钠,pH值7.4)1小时在室温下,紧随其后的是孵化与1g / mL主要单克隆抗体anticytochrome c TBS一夜之间包含5%脱脂牛奶c膜和TBS洗了三次,涂抹与二次抗体结合辣根过氧化物酶(1:10.000稀释、细胞信号技术,丹弗斯,质量)在室温下30分钟。蛋白质是可视化使用ECLplus (Amersham增强化学发光,皮斯卡塔韦,NJ)洗后在TBS的三倍。
2.6。物的免疫印迹检测磷酸化
治疗后,BrCa细胞被洗与500年与冰冷的PBS和细胞溶解L(裂解缓冲(10毫米Tris-HCL, pH值7.4,50 mM氯化钠,30毫米焦磷酸钠,50 mM氟化钠,100毫米原钒酸钠,2毫米碘乙酸、5毫米氯化锌,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,Trition——0.5%100)。的溶解产物被经过均质22克针三次,并保持在冰上30分钟。匀浆离心机在12 000克15分钟c .整个细胞溶解产物的蛋白质浓度由Bio-Rad蛋白质化验设备。等量的蛋白质(50g)当时决定SDS-polyacrylamide凝胶10%,转移到PVDF膜。5%脱脂奶粉的膜被TBS 1小时在室温下培养过夜C 10L (anti-phospho-JNK(刺183 / Tyr185) (稀释,细胞信号技术)。与初级抗体杂交后,膜与TBS洗了三遍,然后用辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体(稀释,细胞信号技术)在室温下30分钟和TBS清洗三次。最终的检测进行了ECL试剂(Amersham,皮斯卡塔韦,新泽西)。
2.7。统计分析
所有的数据进行了分析使用Sigmastat软件(SPSS,芝加哥,IL)。所有治疗都没有治疗或研究者用治疗组相比使用单向方差分析。如果方差相等和显著差异(观察),Holm-Sidak方法与对照组(使用的多重比较16]。数据与不平等的方差,克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析在使用。如果一个显著差异()是观察,与对照组进行多重比较使用邓恩的方法。
3所示。结果
3.1。抗增殖效果TJ-41 BrCa细胞系
我们首先研究了TJ-41对雌激素受体阳性的生长的影响(MCF-7)和雌激素受体阴性(mda - mb - 231)乳腺癌细胞株体外通过测量3H-Thymidine合并。如图1(一),暴露出这些细胞系TJ-41 48小时诱导剂量依赖性降低细胞增殖与未经处理的细胞的增殖。TJ-41 75的浓度g / mL造成50%和57%增长抑制mda - mb - 231和MCF-7细胞,分别。我们也检查了时间响应的关系上TJ-41细胞系(数据没有显示)。孵化这些细胞与媒体包含TJ-41 24、48、72小时也有类似的抑制细胞生长,结果未达到统计上的显著水平。
(一)
(b)
进一步描述在BrCa TJ-41细胞系的影响,我们进行了实验,看看抗增殖影响是可逆的。当MCF-7和mda - mb - 231细胞暴露在375年克/毫升TJ-41 48小时,MCF-7增长率减少72% (mda - mb - 231)和74% ()。在清除的药物2天,增长率增加,虽然仍以较慢的速度初始(图48小时1 (b))。综上所述,这些研究结果清楚地表明,TJ-41 BrCa细胞产生抗增殖存在剂量依赖的相关性影响,这种反应是可逆的。重要的是,这是ER-independent抗增殖作用。
3.2。TJ-41增强5 -氟尿嘧啶的功效(研究者用)
TJ-41传统规定减轻化疗的副作用;因此,我们进行下一个实验,以评估是否TJ-41可以增强抗增殖行动研究者用。确定细胞毒性活动的研究者用MCF-7和mda - mb - 231细胞,剂量实验(数据没有显示)。结合实验的理想剂量的研究者用(0.5和TJ-41(75米)g / mL)。如图2、治疗MCF-7和mda - mb - 231细胞,研究者用(0.5米)48小时显著减少了注册的3H]胸苷MCF-7约41% (mda - mb - 231)和59% ()。当细胞被cotreated研究者用和TJ-41他们测量(51%和73%)MCF-7和mda - mb - 231,分别。这些结果表明,TJ-41可能提高抗增殖能力的研究者用ER和ERBrCa细胞系。
3.3。TJ-41凋亡和强化研究者用的凋亡效应
确定TJ-41诱导生长抑制的机制,我们研究了影响测试化合物对细胞凋亡的诱导BrCa细胞。MCF-7和mda - mb - 231细胞生长在twelve-well盘子和治疗TJ-41和研究者用孤独和48小时。细胞死亡是由propidium化验碘染色和受流仪分析。如图3治疗MCF-7和mda - mb - 231细胞与TJ-41研究者用导致细胞周期阶段分布的减少与相应细胞s阶段在sub-G增加细胞的主要部分1阶段(数据3(b) -3(g))。在两个细胞系,TJ-41和研究者用sub-G导致显著增加1细胞群(数据3(d)和3(h))而没有治疗(数据3(一)和3(e))。一个直方图总结sub-G的百分比1一部分细胞如图4。对于BrCa细胞系,cotreatment TJ-41和研究者用导致sub-G的比例更大的增加1比任何一个细胞群。TJ-41 (75g / mL)治疗产生sub-G的百分比显著增加1细胞群(控制细胞:MCF-7 4±1%和10对mda - mb - 231±2%;TJ-41:MCF-7和mda - mb - 231)。同样,研究者用sub-G的治疗也产生了明显抬高1细胞群(控制细胞:MCF-7和mda - mb - 231;研究者用:MCF-7和mda - mb - 231)。TJ-41和研究者用组合时,sub-G的增加1细胞群更明显(控制细胞:MCF-7和mda - mb - 231;TJ-41研究者用:MCF-7和mda - mb - 231)。
3.4。TJ-41诱导细胞色素c的释放
检查的可能作用线粒体在凋亡的死亡MCF-7 TJ-41引起的mda - mb - 231细胞,细胞色素c的存在在细胞溶菌作用的胞质分数是衡量。细胞治疗与75年48小时g / mL TJ-41导致显著增加数量的细胞色素c从线粒体膜渗漏到细胞溶质在两个MCF-7(图5(一个)(图)和mda - mb - 2315 (b))细胞。符合流仪分析,综合治疗的研究者用和TJ-41导致一个更大的细胞色素c的释放。
(一)
(b)
3.5。TJ-41诱导物激活和抑制物和Caspase-9废除TJ-41-Induced细胞凋亡
因为所需的物途径已被证明是化疗药物引起的细胞凋亡(17],可想而知,物途径也可能发挥关键作用在BrCa TJ-41-induced凋亡细胞。为了验证这一点,我们进行免疫印迹分析研究磷酸化的物(p-JNK)的蛋白质。p-JNK蛋白表达检测最早TJ-41治疗后的1小时细胞系;然而,激活达到峰值MCF-7细胞24小时和6小时mda - mb - 231细胞(图6)。
(一)
(b)
进一步阐明TJ-41引发的凋亡信号通路,我们调查的影响SP600125(物抑制剂),Z-IETD-FMK (caspase-8抑制剂)和Z-LEHD-FMK (caspase-9抑制剂)TJ-41诱导细胞死亡。细胞分析流式细胞术和细胞凋亡的程度是由与sub-G测量细胞的比例1DNA含量。如图7、治疗的BrCa细胞物抑制剂SP600125仅1小时相比可以忽略不计的对细胞凋亡的影响没有治疗组。然而,当细胞治疗的组合SP600125(1小时)和TJ-41(47小时),细胞发生凋亡的比例显著低于那些TJ-41alone,表明抑制物激活防止TJ-41凋亡的影响。同样,联合治疗的细胞与caspase-9抑制剂Z-LEHD-FMK TJ-41导致细胞发生细胞凋亡率显著降低。然而,在Z-IETD-FMK caspase-8抑制剂的存在,TJ-41 proapoptotic效应没有影响。从而激活物和caspase-9但不是caspase-8是必要且充分的应对TJ-41诱导细胞凋亡的治疗。
4所示。讨论和结论
乳腺癌造成重大的发病率和死亡率,是一个重大公共问题在美国越来越多的发展中国家。等传统化疗药物5 -氟尿嘧啶(研究者用)广泛应用于癌症治疗,但非特异性和获得性耐药以及由于高剂量药物抗性诱导副作用仍然是一个主要障碍在临床的设置。因此,大部分注意力都集中在天然产物作为新型抗癌药物的潜在来源在过去的几十年里(18]。年仅出售价值5200万美元的日本,TJ-41严重规定治疗一般疲劳和食欲不振等条件来帮助促进总体物理恢复后操作。通过营养血液和调理胃肠道(GI)系统,管理TJ-41报道能够补充或减轻癌症化疗的不良事件19]。尽管TJ-41的主要用途是缓解压力和疲劳,提高免疫力,并加快经济复苏的体内白细胞计数,这个主音公式可能也有额外的chemopreventive或治疗对乳腺癌的影响。在这里,我们报告TJ-41可以有效地抑制激素敏感和不敏感的乳腺癌细胞系(MCF-7和mda - mb - 231,职责。),加强研究者用的功效。
浸润性乳腺癌可分为两个亚型基于肿瘤细胞是否表达雌激素受体(ER)。ER的地位是很重要的,因为,当循环雌激素结合,它刺激细胞分裂和肿瘤的生长20.]。很多策略已经开发多年来抑制雌激素使促有丝分裂的途径。众多研究表明,激素疗法显著延长寿命,虽然他们很少治疗雌激素受体阳性患者(ER)乳腺癌,促有丝分裂的途径是完整的,但他们在ER阴性(ER是无效的)疾病,途径是不活跃的20.]。有三个总体目标更好的治疗在乳腺癌,改善治疗疾病,寻找治疗ER预防疾病,特别是扩大治疗包括ER−疾病。在目前的研究中,我们的研究结果表明,TJ-41的水溶性成分,在75年的浓度g / mL,显示对MCF-7 (ER抗增殖的影响)和mda - mb - 231 (ER)乳腺癌细胞系。重要的是,这种抗增殖作用是可逆的,独立于雌激素受体状态。TJ-41用于我们的实验的浓度时一样的血药浓度达到7.5 g (TJ-41的推荐剂量)的口服药物。TJ-41组件中,升粉末(BrCa),甘草根(BrCa),据报道和人参体外抑制乳腺癌细胞株的增殖(21- - - - - -23]。因此合理假设的直接抑制作用TJ-41在乳腺癌细胞系中显示我们的研究可能是由于这些活性成分,或许更多未知的成分。
最近,药理操纵恶性细胞的生长抑制和抗增殖效应诱导的细胞凋亡被认为是一种新颖的战略识别和筛选潜在的化疗药物。许多化疗药物保留发现了细胞凋亡的活动(25,26]。目前的研究表明,生长的抑制效应TJ-41似乎与诱导细胞凋亡(图有关3)。证实了TJ-41-induced凋亡流仪分析(数据3和4)。
目前有两种途径提出了调节中扮演主要的角色在哺乳动物细胞凋亡:一个外在途径由一个或多个死亡受体和内在途径介导的线粒体27]。在外在死亡受体/配体通路,半胱天冬酶激活发生死亡受体结扎的直接后果,与上游caspase-8裂开,激活下游蛋白酶caspase-9和caspase-3等。内在线粒体通路,伯灵顿,bcl - 2家族的一员,扮演了主要角色。伯灵顿通常存在于胞质处于静止状态。凋亡刺激后,伯灵顿易位到线粒体和促进细胞色素c的释放28),可能会形成一个孔(29日)或压敏电阻器在线粒体外膜离子通道。一旦进入胞液,细胞色素c激活Apaf-1,然后激活procaspase-9,这反过来,激活caspase-3,引发细胞凋亡。目前的研究发现,TJ-41引起线粒体细胞色素c的释放在两个细胞系。TJ-41-induced细胞死亡是降低了caspase-9抑制剂特定(Z-LEHD-fmk),但细胞死亡并不是减少接触Z-IETD-fmk,抑制剂特定caspase-8,强烈表明,内在从事TJ-41-induced细胞凋亡的线粒体途径。
的激活物途径已被证明是一种普遍现象在凋亡细胞死亡(30.- - - - - -33];然而,这种激活似乎不同的重要性在细胞凋亡引起的不同的代理。所需的物途径是由生长因子,细胞凋亡诱导热休克,辐射,和神经酰胺(32,34,35]。相比之下,物可能不是必不可少的受体介导细胞凋亡(例如,Fas -和肿瘤坏死factor-mediated凋亡)(36]。在这项研究中,我们将演示的参与物TJ-41-induced凋亡,表明干扰物通路抑制TJ-41-induced细胞死亡。这一结果表明,诱导物活动不是一个一般的事件由压力引起的细胞死亡,而是这是一个特定的现象与凋亡细胞死亡有关。
研究者用最活跃的和广泛使用的化学治疗剂乳腺癌,以前未经治疗的患者的反应率为40% (37]。它插入DNA碱基对之间,导致DNA链断裂,并抑制DNA生物合成和拓扑异构酶II活动(38]。它也形成自由基39),导致其细胞毒性和大量的抗癌活性40,41]。然而,在大多数情况下,研究者用不减轻乳腺癌和与重要生理和心理的副作用42]。此外,耐药表型的发展仍然是一个重要的限制其临床应用。自然诱发的细胞凋亡的发现将是发展的基础chemopreventive潜在天然材料(43]。膳食成分,通常有一个潜在的化学预防和安全。化学预防研究的一个新的方面是决定预防制剂可以使化疗效果更好。本研究检验了的分子证据证明化疗疗效抗癌药物的联合治疗和天然化合物为了发展模式克服耐药性乳腺癌治疗和细胞毒性的影响。我们的研究表明,TJ-41提高MCF-7的易感性和mda - mb - 231细胞,研究者用诱导细胞凋亡。细胞凋亡的增加,而TJ-41或研究者用孤独,证实了流量仪分析以及增加caspase-3/7活动(数据未显示)。本研究首次提出TJ-41可以有效地用于结合研究者用。
总之,我们已经证明了,第一次,TJ-41亚洲草药混合物,展品直接对人类乳腺癌细胞的体外抑制作用。抑制效应可以归因于TJ-41诱导细胞凋亡的能力。从我们的结果我们推断暴露TJ-41乳腺癌细胞导致环境压力与后续的激活物进而激活通过线粒体凋亡通路(图8)。此外,结合TJ-41与研究者用表明潜在的治疗应用于乳腺癌。进一步调查其可能的临床应用在乳腺癌治疗中应实施,特别是关于改善化疗的结果ER乳腺癌。
确认
作者感谢瓦莱丽·肯尼迪与流式细胞术的技术援助。这项工作是由南卡罗莱纳大学的研究项目。