文摘

局部区域复发患者中最常见的失效形式是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。我们回顾性41 HNSCC局部区域复发患者,用动能逆转录-聚合酶链反应(kRT-PCR),为了研究用来进行肿瘤信使核糖核酸(mRNA)水平的人类表皮生长因子家族成员HER1-4,血管内皮生长因子(vegf), B, C, D及其受体VEGFR1, 2、3。高VEGF-C VEGFR3肿瘤mRNA表达与复发以外的主要轨迹(脖子节点或软组织,)。与区域节点参与肿瘤诊断往往表现出高转录活动的VEGFR1和VEGFR3复发的时候()。52个月的中位随访时间的局部区域复发患者高VEGF-C肿瘤复发postrelapse更无进展生存(R-PFS 5和47个月,log-rank)和一个趋势下postrelapse总体存活率(log-rank R-OS 22和44个月)相比,低VEGF-C肿瘤。类似与可悲的结果被受体,VEGFR3 tumoural (log-rank mRNA水平)。相比之下,抑制肿瘤转录的VEGF-D与贫穷有关post-relapse生存,虽然没有达到统计学意义。活跃转录VEGF-C / VEGFR3轴周期性HNSCC与失败在颈部软组织/淋巴结伪劣post-relapse生存。

1。介绍

局部区域复发后是最常见的故障模式确定的治疗头颈部鳞状细胞癌(HNSCC),尽管形态相结合的方法将越来越多地使用化疗,放疗和手术局部晚期肿瘤患者的初始管理(1]。未能实现局部区域的疾病控制远处转移和妥协的可能性增加了患者的生存和生活质量。即使在死于远处转移性疾病的病人,不受控制的在主站点癌症或颈部被认为在90%的情况下(2]。在几家大型系列和多试验,局部区域复发的速度范围从20%到57%,失败的最重要的预测因子参与切除利润率,区域淋巴结转移、先进的T台,优质,神经源性/船入侵和p53基因突变(3]。在孤立的局部区域复发的发生,长期疾病控制是实现少数病人(10% - -25%),也就是说,那些能够接受手术抢救和/或re-irradiation。与头颈部鳞状细胞癌患者临床病理参数预测结果,局部区域复发已报告的研究,包括从诊断复发时间间隔,散装,网站和resectability复发,re-irradiate剂量> 60 Gy,能力和性能状态(4,5]。然而,没有数据可用分子肿瘤生物标志物的潜在的预后和预测意义局部区域复发性HNSCC患者的结果。几个调查人员公布超表达人类表皮生长因子受体(她)的家庭成员和活跃在HNSCC血管生成活动,因为针对这些细胞通路治疗化合物具有重要的影响。鉴于上述情况,我们研究了肿瘤转录活动的她和血管内皮生长因子(VEGF / VEGFR)在局部区域复发的发生途径,回顾性研究协会与临床病理的特点和分析他们的效用预测复发后患者的结果。

2。患者和方法

患者局部阶段》HNSCC管理2002年1月至2004年8月ENT部门亚里士多德大学塞萨洛尼基与潜在的治疗手术和/或激进的外部射线照射,随后经历孤立的回顾性确定局部区域复发。孤立的局部区域复发被定义为发生在一个主要网站,脖子节点或颈部软组织没有远处转移。这构成的标准病人识别和她/研究VEGF通路在新鲜肿瘤组织切片获得局部区域复发和snap-frozen。放弃同意使用生物材料生物伦理学委员会提供的亚里士多德大学的塞萨洛尼基。

完整的高质量RNA由管家基因的分析RPL37A 41用来隔绝与肿瘤细胞性肿瘤组织样本的至少70%。大约50毫克的用来进行肿瘤组织在液氮粉碎。RLT-Buffer(试剂盒、希尔登,德国)补充道,匀浆离心机通过QIAshredder列(试剂盒)。洗出液的总RNA分离使用RNeasy工具包(试剂盒)根据制造商的指示。RNA收益率是由紫外吸光度,核糖体RNA的RNA质量评估分析带完整的安捷伦2100生物分析仪RNA 6000 LabChip工具包(安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA)。动能逆转录-聚合酶链反应(kRT-PCR)申请的评估的信使核糖核酸(mRNA)表达HER1 (EGFR), HER2, HER3, HER4, VEGF-A(所有亚型),VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1 (FLT1) VEGFR2 (KDR)和VEGFR3 (FLT4)使用以下TaqMan-based底漆/探针集:

VEGF-A探针CACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCT

正向引物GCCCACTGAGGAGTCCAACA

反向引物TCCTATGTGCTGGCCTTGGT

VEGF-B探针CACATCTATCCATGACACCACTTTCCTCTGG

正向引物TGGCAGGTAGCGCGAGTAT

反向引物CCCTGTCTCCCAGCCTGAT

VEGF-C探针TTGAGTCATCTCCAGCATCCGAGGAAA

正向引物CCACAGATGTCATGGAATCCAT

反向引物TGCCTGGCTCAGGAAGATTT

VEGF-D探针TGACATTGAAACACTAAAAGTTATAGATGAAGAATGGCA

正向引物ACTAGGTTTGCGGCAACTTTCT

反向引物TCTCTAGGGCTGCACTGAGTTCT

FLT1探针TGCTGTCGCCCTGGTAGTCATCAAACA

正向引物CATGGGAGAGGCCAACAGA

反向引物AACCTTTGAAGAACTTTTACCGAATG

KDR探针TCTTGGCATCGCGAAAGTGTATCCACA

正向引物TTCCAAGTGGCTAAGGGCAT

反向引物CGTGCCGCCAGGTCC

FLT4探针TGCCTGCTTCCCTGGGTAGTCCC

正向引物GCACCCACTTACCCCGC

反向引物GAGTTTAACTCAGGTGTCACCTTTGA

四十放大应用周期,周期阈值(CT)目标基因的值确定。CT值被减去的CT值归一化看家基因RPL37A CT值的目标基因(ΔCT)。RNA结果被报告为40-ΔCT值,将相关比例目标基因的信使RNA表达水平。人类参考总RNA汇集从十人类细胞系(Stratagene拉霍亚,CA)是作为一个积极的控制。RNA-free从肿瘤组织中提取的DNA被用作消极的控制。

我们试图研究生物标记值的分布,生物标记各种临床病理参数的相关性起初诊断和复发的时候,协会生物标志物与诊断复发时间(不复发间隔,RFI),和他们的预测意义relapse-related无进展生存(R-PFS)和总生存期(R-OS)。RFI测量从最初诊断孤立的局部区域复发的时间之前,R-PFS从孤立的局部区域复发的时间直到验证疾病进展,从局部区域复发和死亡或持续接触和R-OS直到死于任何原因或日期的最后联系。疾病进展(R-PFS事件)被认为是提高肿瘤最大直径> 20%或新病灶的出现尽管抢救治疗。R-OS和R-PFS估计使用kaplan meier采用方法,使用生存率较和比较进行。

分类数据给出了计数和相应的百分比,同时综述了连续变量使用中位数和范围。分配研究基因mRNA表达值证实缺乏自然的否决频率直方图,而小样本量进一步支持使用中值作为最优截止。基因mRNA表达被认为是低或负当低于中位数的mRNA测量值和高或积极当高于中间值和作为分类变量的分析。对比mRNA表达和分类变量使用确切概率法进行。所有统计检验的显著性水平。进行了分析使用Windows的许可证,版本15。

3所示。结果

3.1。临床病理特征

41岁男性病人,大多是重度吸烟者和消费者的酒精,最初提出的年龄中位数65嘶哑和吞咽困难。的诊断检查导致诊断喉鳞状细胞癌的主要(90%的病例),主要阶段T1-3(88%的病例),更多的淋巴结阴性(85%),和较好的分化良好(61%)。最初管理包括手术切除的肿瘤局部切除(24%),节段性(19%),或全部(24%)喉头切除术,而三分之一的情况下只有一个活组织检查的程序是和激进的体外放射治疗管理。辅助化疗没有管理,除了一位病人。局部区域复发发生在中间的15个月的主站点(66%),颈部淋巴结(15%),或颈部软组织(19%)和管理通过手术切除(65%的患者)和/或照射(24%)和化疗(24%)。复发的时候,46%的患者通过手术只有19%,切除后跟辐照或化疗。中24%的患者接受了放射治疗在复发,体外放射治疗只有17%和7%的放化疗。没有病人收到re-irradiation。在五个病人化疗和可用的数据管理,三是与紫杉醇/脂质体阿霉素治疗,一个与紫杉醇/吉西他滨,一个每周与甲氨蝶呤。在第一次诊断和局部区域复发临床病理的特点列于表1。

3.2。协会生物标志物与临床病理的参数

高与低HER1-4基因的mRNA表达,VEGF-A, B, C, D基因和受体VEGFR1 R2, R3检查对饮酒,烟草消费,年龄,并在初始节点状态诊断、复发间隔,网站,大小和年级复发。

高复发与取向VEGF-C转录显著相关以外的主要网站:50%的患者复发高tumoural VEGF-C mRNA表达在淋巴结复发或软组织和只有15%的那些包庇VEGF-C较低的肿瘤(测试,)。同样的观察协会tumoural VEGFR3和受体的转录VEGF-C:肿瘤高mRNA的表达VEGFR3复发在脖子节点或软组织复发病例的53%,而那些低表达在只有10%的复发()。Tumoural VEGF-C / VEGFR3 mRNA表达可能偏爱的一个标志在区域淋巴结复发/软组织而不是主站点。

与区域节点参与肿瘤诊断往往表现出高转录活性VEGFR1或VEGFR3复发的时候(测试,)。高mRNA的表达在肿瘤异形VEGFR1或VEGFR3复发,区域节点参与发生在大约20%的情况下,最初的报告。与此形成鲜明对比的是,没有出席首次诊断淋巴结转移情况tumoural VEGFR1 VEGFR3 mRNA表达或复发很低。这初步发现值得进一步调查,剖析似乎VEGFR1和VEGFR3 HNSCC患者初步诊断可能是潜在价值预测节点参与或局部区域复发。

此外,这一趋势被发现高VEGFR1 tumoural表达式的复发与取向有关节点或软组织失败(测试,),对高VEGF-B历史的高酒精消费()。其他临床和统计学意义关联研究的生物标志物与临床病理的特点。表2总结了生物标志物与临床病理的最重要的关联数据,而她的家庭的所有关联的基因与临床病理的数据如表所示3。

3.3。对射频识别预测意义

转录活动的任何相关的生物标记物研究没有明显的早期或晚期局部区域复发(RFI少和超过12个月)。此外,转录的研究生物标志物不能预测复发的时机,即使后者是研究连续时间变量(Mann-Whitney U测试,)。

3.4。预测意义R-PFS

52个月的中位随访时间的局部区域复发(范围8-53月),她的转录活动和VEGF / VEGFR家庭成员检查复发的预测为生存意义直到进展或死亡(R-PFS)。高VEGF-C mRNA表达的肿瘤局部区域复发的时候明显有关无进展存活期较短(log-rank,)。肿瘤患者怀有VEGF-C mRNA表达较低的平均R-PFS 47个月与平均R-PFS只有5个月的患者肿瘤表达高VEGF-C(图1)。此外,信使rna表达水平的受体,VEGFR3,有关病人结果趋势统计学意义(log-rank,)。高肿瘤转录的VEGFR3复发患者达到中等R-PFS只有12个月,相比那些窝藏VEGFR3 mRNA表达较低的肿瘤,在他们中间R-PFS没有达成时的分析(图2)。协会肿瘤VEGF-D表达和R-PFS推测,尽管没有发现统计学意义(log-rank,)。低肿瘤VEGF-D mRNA表达与平均R-PFS只有10个月,而高VEGF-D平均R-PFS 47个月(图3)。

3.5。预测意义R-OS

在所有研究生物标记,只有VEGF-C tumoural转录在复发表现出显著的趋势与复发患者的存活期(log-rank,)。肿瘤患者怀有VEGF-C高复发的平均R-OS 22个月,而低级的肿瘤患者VEGF-C平均生存时间(图44个月4)。值得注意的是,高VEGF-D在局部区域复发的肿瘤表达水平与改善病人的结果,尽管不是统计学意义(log-rank,),如R-PFS一直如此。在肿瘤VEGF-D水平较低情况下,中位数R-OS只有17个月,在不同情况下具有高VEGF-D肿瘤mRNA表达,中位数生存没有达到,52个月的随访中值(图5)。

4所示。讨论

局部区域复发的影响与头颈部鳞状细胞癌的病人,是毁灭性的在几个方面:功能,手术美容,生活质量,最重要的是,生存。标准建立的临床和病理因素对病人预后意义结果报告:切除利润率,区域淋巴结转移、先进的T台,优质和神经源性/船入侵(6,7]。不过,20% - -30%的患者局部t1 - t2疾病管理与负缘切除,节点间隙,最终辐照时间均发生在颈部(1,2]。表皮生长因子受体(HER1), HER2, HER3 HER4跨膜受体对扩散至关重要,能动性,和恶性肿瘤细胞的入侵,前两个研究更加广泛了。HNSCC肿瘤率呈现免疫组织化学(包含IHC)蛋白质过度被发现HER2 [EGFR和4% 80% -90% -39%8,9]。尽管EGFR和HER2包含IHC蛋白表达是显示为亚临床结果的预后价值,他们受益于靶向治疗的可靠预测代理(10]。尤其是表皮生长因子受体表达在几乎所有HNSCC肿瘤,符合鳞状细胞表型,而其蛋白免疫组织化学染色是一个主观的分析缺乏定量评价的动态范围。EGFR和她的家庭其他成员的形式形成配体结合,激活细胞内的信号级联控制生存、增殖,能动性,集群恶性肿瘤细胞的血管生成。最近的大型III期试验显示总体生存受益anti-EGFR单克隆抗体的结合西妥昔单抗与放疗或化疗患者的局部晚期或转移性HNSCC [11,12]。这种临床突破使得迫切需要识别的生物标志物预测肿瘤的反应或抵抗EGFR-modulating代理。

VEGF蛋白过度评估包含IHC发现HNSCC肿瘤的90%,与2倍的死亡风险在两年13]。五个VEGF配体(VEGF-A, B, C, D, E)与二聚体三种类型的交互VEGF受体(VEGFR1, 2和3)发现内皮细胞和肿瘤细胞。受体人类——或者heterodimerisation启动复杂的细胞内信号机制导致形成新肿瘤血管(VEGFR1和2)或淋巴管(VEGFR3) [14]。治疗药物针对VEGF受体配体或抑制肿瘤血管生成,优化剩下的脉管系统,减少孔隙流体压力,作用杀死肿瘤细胞时结合化疗或放射治疗在临床前模型(15]。贝伐单抗,一个结合VEGF单克隆抗体,和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂目前正在评估在HNSCC患者中,随着生物标记,可以预测等受益于靶向治疗。Seiwert等人最近报道,磷酸化VEGFR2比总VEGFR2,通过免疫荧光测量,预测反应的患者复发或转移性HNSCC接受贝伐单抗/埃罗替尼联合治疗(16]。

基因的信使RNA转录分析通过实时kRT-PCR提供了一个定量评价方法,不受观察者变异或众所周知的影响包含IHC技术局限性。为了屏幕HNSCC复发患者的分子预测结果,我们研究了用来从41名患者肿瘤局部区域复发风险相对较低的疾病表现:肿瘤大小中值为2厘米,68%的病例被T1-2 N0, 85%和61%的中度分化良好。尽管样本量小,转录的激活VEGF-C / VEGFR3轴外的复发与原发部位(颈部节点或软组织)伪劣从复发无进展生存和整体边际统计学意义。此外,肿瘤,在表示VEGFR1较高和node-positive VEGFR3 mRNA表达水平在复发。尽管这些发现的初步性质,在小型回顾性队列中,血管生成抑制剂的出现显著关联的结果,在肿瘤患者最初呈现低风险,提示临床意义的存在,一种更健壮的相关性,如果样本容量大。

我们的观察牵连tumoural VEGF-C / VEGFR3信号节点/软组织复发和穷人post-relapse结果是符合最近发表的证据。几个调查人员报告协会蛋白质或mRNA表达与淋巴转移和入侵VEGF-C HNSCC,胃,前列腺癌,乳腺癌细胞系和小病人系列(17- - - - - -19]。值得注意的是,一等人发现tumoural VEGF-A / VEGFR1和2转录与远处转移的发展,而VEGF-C / VEGFR3局部区域复发(20.]。此外,O-Charoenrat等人报道,相比其他VEGF配体,VEGF-D mRNA在HNSCC抑制肿瘤。临床数据表明,活跃HER1/2信号上调VEGF-A和C会使VEGF-D转录在肺腺癌和HNSCC细胞系(21]。我们观察到劣质R-PFS和R-OS窝藏VEGF-D mRNA表达较低的肿瘤的病人相比,那些高VEGF-D,虽然没有达到统计学意义。VEGF-D可能对肿瘤neovascularisation产生拮抗作用,形成与VEGF-A形成,B, C和调制VEGFR1的活动,随着neuropilin受体2和3。这一现象counter-regulation可能是极其重要的血管生成的微调。VEGF-Ab最近,强大的剪接变体proangiogenic VEGF-A配体,被证明起到抗血管新生作用在正常组织和各种固体肿瘤22]。

的不良预后影响的机理VEGF-C / VEGFR3信号可能包括传播肿瘤细胞在淋巴结/体循环和逮捕遥远的网站,直接增强lymph-angiogenesis,和建立一个宽松的环境诱导肿瘤进展的粘附分子,生长因子和蛋白水解酶。VEGF-C相比,她的信号并没有显著预测病人的结果,尽管体外数据强调其关键作用在细胞周期的控制,入侵,感应VEGF-A C-mediated血管生成。的确,在一个HNSCC病人系列,表皮生长因子受体的蛋白表达HER2无法预测受益于化疗或靶向治疗(8- - - - - -11]。只有表皮生长因子受体基因扩增激活表皮生长因子受体基因突变和截断的存在形式的EGFRvIII蛋白与临床病人利益或结果(10]。虽然我们的信使rna的方法不可能屏幕对于这些生物标志物,Agulnik等人发现表皮生长因子受体基因复制数量过剩只有37例4,和Willmore-Payne等人报道HER1/2突变与头颈部鳞状细胞癌在不到10%的患者(23,24]。相比之下,钟等人观察表皮生长因子受体基因扩增75年58%的复发或转移性HNSCC患者报告了与贫困的结果(25]。然而,EGFR拷贝数状态不与蛋白质或mRNA的表达。这可以解释我们无法找到任何预后意义EGFR mRNA水平在我们的研究中。事实上,HER1 / HER2基因扩增可能是一个早期的致癌事件,与大多数基因副本以后成为转录活性。交替剪接EGFR的成绩单,不被我们的信使rna探针,也可以提供另一种解释(26]。此外,EGFR / HER2基因可能携带预后信息与他们无关放大状态本身,而是作为替代标记的遗传不稳定或其他coamplified基因(27]。值得注意的是,Seiwert等人报道,内皮而不是肿瘤细胞表皮生长因子受体蛋白水平与应对贝伐单抗+埃罗替尼(16]。此外,减少VEGFR2和表皮生长因子受体结合蛋白表达在肿瘤endothelia但不是肿瘤细胞。信使rna分析,尽管基于冻结部分70%的肿瘤细胞结构,不会区分肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞。

总之,VEGF-C / VEGFR3 mRNA表达的复发可能潜在价值作为一种新的生物标志物预测节点/软组织区域复发和HNSCC患者复发后的不良预后显著相关。应该强调的主要肿瘤的分子分析是必要的为了获得在诊断预后信息。比较初级和匹配的复发性肿瘤的分子概要文件需要得到安全的结论并没有在我们的研究中。然而,我们的研究结果可以作为存活率存在数据,如果验证在较大的潜在系列,可能证明更激进的脖子管理报告和治疗HNSCC患者表现出高VEGF-C mRNA表达靶向治疗(anti-VEGF-C抗体,VEGFR3酪氨酸激酶抑制剂),前期或复发,为了优化他们的结果。

确认

作者要感谢格鲁吉亚Vourli女士(硕士)统计分析和女士Silke Claas优秀技术援助。第一两位作者贡献了同样的工作。