文摘

背景。维生素A衍生物all-trans视黄酸(ATRA)被认为是一个有效的化疗药物调节细胞生长和分化的能力。我们研究ATRA的影响在MCF-7 MMP-2,人类乳腺癌细胞,可能受到影响的信号通路调节pro-MMP-2活动ATRA和表达。方法。明胶zymography、rt - pcr、ELISA、免疫印迹免疫沉淀反应,细胞粘附试验。结果。明胶zymography表明ATRA导致剂量依赖性抑制pro-MMP-2活动。EMMPRIN ATRA治疗会使MT1-MMP的表达,FAK, NF-kB, p-ERK。然而,钙粘蛋白的表达,RAR, CRABP增加ATRA治疗。结合细胞细胞外基质(ECM)蛋白纤连蛋白ATRA治疗后显著降低。结论。实验结果清楚地表明,抑制MMP-2 ATRA治疗活动。这种抑制作用的ATRA MMP-2活动在人类乳腺癌细胞(MCF-7)可能会由于其抑制作用MT1-MMP, EMMPRIN, upregulation TIMP-2。本研究重点是ATRA对MMP MMP-integrin-E-cadherin相互关系,以及药物的影响在不同的信号分子可能参与恶性肿瘤发展的进展。

1。介绍

视黄酸,包括维生素A和它的类似物,调节生长和分化。视黄酸抑制肿瘤形成动物和证明是有效的化疗药物在许多癌症。主要all-trans视黄酸(ATRA)及其立体异构体9-cis视黄酸被发现是非常有效的代谢物的视黄醇施加多效性的影响许多不同的生物过程。相比之下all-trans 13-cis, 9-cis视黄酸对细胞形态有更大的影响。据报道,13-cis视黄酸减少发展的主要肿瘤患者的头部和颈部癌症,而ATRA提供了一个具体的治疗急性早幼粒细胞白血病(1,2]。类维生素a的抗肿瘤效果通常归因于诱导分化,但这些化合物也显示阻止肿瘤细胞的生长,诱导细胞凋亡或加速衰老3]。维甲酸诱导分化的能力在癌细胞表明他们的潜在作用癌症化学治疗剂。

类维生素a施加其影响通过调制核受体基因表达的两个不同的类:视黄酸受体(RAR , , )和(RXR rexinoid受体 , , )。受体属于类固醇或甲状腺激素super-family [4]。这些受体熊六个领域:A / B ligand-independent transactivation,与两个锌指DNA结合C, D是一个铰链区和E与RXR负责二聚作用,配体结合,ligand-dependent transactivation,协会和辅阻遏物(软木)或辅活化因子(CoA)复杂。F的函数仍然是未知的(5]。配体结合时,受体结合视黄酸反应元素(罕见),特定的DNA序列,作为受体二聚体。ATRA高亲和力结合RARs (kd 0.2 - -0.4海里),但不是RXR,而9-cis视黄酸结合RXR高亲和力(4]。rar可能存在为和可以形成异质二聚体与rxr和罕见的相互作用6,7]。受体二聚体复杂的辅阻遏物仍是沉默的绑定。类维生素a配体与受体结合的二聚体复杂引起构象变化,消除了辅阻遏物和新兵辅活化因子,因此,促进转录的起始(8]。两种类型的细胞视黄酸结合蛋白CRABP I和II可以作为运输车的视黄酸促进胞质视黄酸的运输到细胞核中的导致互动(4]。

肿瘤侵袭和迁移,肿瘤细胞和主机协调调节矩阵退化,信息附件,附件和细胞矩阵。异常表达和活性基质金属蛋白酶与肿瘤细胞的恶性发展(9]。大多数基质金属蛋白酶的分泌细胞不活跃的形式。激活机制通常涉及乳沟的prodomain氨基的守恒cystein残渣后跟的活性部位的破损zinc-cystein债券(10]。明胶酶是杰出的存在一个FN-like区域,插入在催化领域。这个插入很重要在底物识别(11]。基质金属蛋白酶中明胶酶演示特定cell-MMP交互。例如,MMP-2与整合素结合 和MMP-9 CD44 (12]。整合素的表达 在细胞表面支持成熟和激活MMP-2 [13]。膜结合基质金属蛋白酶(MT-MMPs)的特点是一个c端跨膜部分和短furin-like序列之间的职业和催化领域。furin站点提供了一个替代裂解位点MMP激活(14]。

MMP的活动能引起肿瘤的生长或生存,入侵,血管生成,细胞迁移15]。基质金属蛋白酶在肿瘤细胞的表达调控以旁分泌的方式。肿瘤细胞产生的因素,如趋化因子、细胞因子、和细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN),进而上调基质金属蛋白酶(16]。基质金属蛋白酶是主要的蛋白水解酶,促进肿瘤细胞迁移的降解基底膜和其他组件的细胞外基质(ECM) (17]。在ECM的降解,肿瘤细胞入侵和迁移依赖receptor-dependent附件从矩阵和其他细胞并释放。直接调节MMP的活动信息和cell-matrix附件和调节细胞入侵和迁移的过程18]。整合蛋白在anchorage-dependent增长发挥核心作用,细胞凋亡、分化、迁移。整合蛋白不同调节基质金属蛋白酶的生产。在人类黑色素瘤细胞系, 5 1整合素和 整合素调节释放MMP-2和随后的入侵行为19]。减少细胞粘附是肿瘤转移的重大,可以通过多种机制影响E-cadherin-catenin复杂。这些包括减少或损失钙粘蛋白的表达、突变基因的组成分子,细胞内的钙粘蛋白的重新分配和上皮的脱落,等等,20.]。

在这种沟通中,我们报告多功能ATRA对(i) gelatinase-A表达式和活动,(2)各种信号分子,和(3)的细胞表面受体整合素组人类乳腺癌细胞,MCF-7。

2。材料

最小基本培养基(MEM),杜尔贝科修改公平的介质(DMEM)和胎牛血清(的边后卫)从英杰公司购买公司,美国。纤连蛋白(440 kDa)和G蛋白琼脂糖从罗氏公司购买,德国。明胶琼脂糖4 b珠子从Amersham购买生物科学,美国。All-trans视黄酸(ATRA)购买的σ。Anti-FAK、anti-TIMP-2 anti-NF - B (p65)、anti-EMMPRIN anti-MT1-MMP, anti-E-cadherin, anti-RAR, anti-CRABP, anti-ERK, anti-phospho-ERK,和抗vegf抗体购自圣克鲁斯,美国。碱性磷酸酶耦合的二次抗体(单克隆和多克隆),HRP-coupled二级抗体购自Calbiochem和硝基蓝四唑/ 5-bromo-4-chloro-3-indoyl磷酸(电视台/ BCIP,西方蓝色稳定对碱性磷酸酶底物),和四甲基联苯胺(三甲)从班加罗尔Genei购买,印度。RNAqueous 4 PCR(总RNA隔离设备)和Retroscript (rt - PCR试剂盒)从Ambion购买,美国。MMP-2 FAK, 5, 美国1引物是购买的操纵子。GAPDH引物和100个DNA碱基对梯来自精灵,班加罗尔。

3所示。方法

3.1。细胞培养

A375人类黑色素瘤细胞系和MCF-7人类乳腺癌细胞系来自国立细胞科学中心(国立),印度浦那。MCF-7细胞生长和维护在MEM包含10%的边后卫和A375细胞在DMEM补充10%的边后卫 孵化器在37°C。

3.2。药物治疗

7.5毫克视黄酸(美国购买的σ)溶解在5毫升DMSO准备5毫米股票的解决方案。ATRA添加浓度的实验菜10,20年,30 M。

3.3。细胞生存能力分析

A375细胞(300000 /毫升)和MCF-7细胞(300000/1.5毫升)是生长在无血清培养基(SFCM)没有(控制)和30的存在 M ATRA 24 (MCF-7)和48(以防A375)小时。控制和ATRA-treated细胞收集的胰蛋白酶化。10 L细胞悬液(控制和ATRA-treated) PBS和10 L台盼蓝添加进去。细胞悬浊液涨跌互现,保持3 - 5分钟。染色和清白的细胞数在一个血球计幻灯片。

3.4。Zymography

MCF-7细胞(300000/1.5毫升)最初生长在MEM petridishes补充10%的边后卫,用无血清培养基(SFCM)洗净,处理浓度增加ATRA (10 米,20 米,30 在SFCM M) 24小时。控制细胞生长没有ATRA但存在1% DMSO溶剂(ATRA) 24小时和SFCM收集。基质金属蛋白酶是分开SFCM使用明胶琼脂糖4 b珠子和摇动2小时在4°C。的珠子与Tris-buffered盐水洗x3 Tween-20 (TBS-T)和悬浮在50 L 1 x示例缓冲区(0.075通用三0.2通用SDS在10毫升水,pH值6.8)。暂停在37°C和孵化30分钟然后在3000 r.p.m离心机。3分钟。上层清液然后受到zymography 7.5% sds - page共聚凝胶为0.1%。凝胶被2.5% triton - x - 100年30分钟去除SDS和孵化一夜之间在反应缓冲区(50毫米Tris-HCl pH值7,4.5毫米CaC ,0.2 M氯化钠)。孵化后,凝胶Coomassie蓝色沾0.5% 30% 10%甲醇和冰乙酸。乐队是可视化使脱色凝胶和水。

3.5。酶联免疫吸附测定(ELISA)

MCF-7细胞(300000/1.5毫升)是生长在无血清培养基(SFCM)没有(控制)和30的存在 M ATRA(实验)24小时。收集的文化上层清液离心3000 r.p。3分钟。microtitre板井的涂层与50一式三份 L文化SFCM和50 g蛋白控制和实验设置和一夜之间保持在4°C(板被包裹在包装,以防止蒸发)。空井(缓冲暂停样品)也准备好了。第二天水井洗了阻断缓冲区(1% BSA在PBS)阻止非特异性结合位点和孵化1小时37°C。然后用洗井是洗了三次缓冲区(0.5% NP-40 & 0.5% BSA溶解在PBS)。Anti-TIMP-2、anti-E-cadherin anti-RAR, anti-CRABP主要抗体解决方案( 稀释)添加到井和孵化在37°C 1小时。井与洗涤缓冲洗了三次。各自的第二抗体解决方案( 稀释缓冲)添加到井和孵化在37°C 1小时。井与洗涤缓冲洗6次(3 - 5分钟洗)。衬底(三甲)添加到井(黑暗),只要需要(即。,直到颜色开发开始变得太强烈)。然后1米 停止在ELISA的解决方案是添加和阅读是读者在450海里。

3.6。rt - pcr

RNA提取的 MCF-7细胞生长在没有(控制)的存在和30 M ATRA对24小时。用于PCR引物的序列是:hMMP-2: 侠盗猎车手TTT手枪GGC ATC GCT CA - (向前)和 猫苑CTG CAA AGA ACA CA - (反向),hFAK: gcg CTG GCT GGA AAA AGA - (向前)和 tcg GTG GGT G - GCT GGC TGG标签 (反向),h 5: 猫TTC注册会计师GTC TGG GCC AA - (向前)和 CAA AAC AGC CAG CAA创新艺人经纪公司——标签 (反向),h 1: tgt柠檬酸GTG CAG AGC CTT CA - (向前), 有条件现金援助TCG猫行动得到TGA CC - (反向)。GAPDH引物 TCG CGG AGT CAA CGG ATT TGG答- (向前)和 agc CTT CTC猫GGT GGT棉酚GAC - (反向)被用作控制规范化mRNA完整性和加载。rt - pcr进行rt - pcr试剂盒使用两个步骤(美国Ambion)。组件在42°C孵化1小时10分钟和92°C(逆转录酶灭活)条件用于PCR由24个周期在94°C MMP-2 30秒,30秒63°C,和60秒72°C, 25周期FAK在94°C 30秒,60°C 30秒和72°C 分钟,28日周期 5、 在94°C 30秒,30秒58°C, 72°C 分钟和最后一个孵化72°C DNA热周期计7分钟。的预测大小PCR产品198个碱基对(bp) MMP-2, FAK的476个基点,为324 5、452 1,GAPDH和454。

3.7。免疫印迹分析MT1-MMP, EMMPRIN, FAK和NF - B

MCF-7细胞(300000/1.5毫升)是生长在无血清培养基(SFCM)没有(控制)和30的存在 M ATRA对24小时。相应的细胞被收集。细胞提取进行了使用细胞提取缓冲(37.5毫米三、75毫米氯化钠和0.5% triton - x - 100)和蛋白质含量的提取被洛瑞的方法估计。等量的蛋白质被和孵化1 x样品缓冲30分钟后跟5 - 8分钟孵化0.1卷 巯基乙醇在80 - 90°C。然后再对样本7.5% sds - page电泳。蛋白质是由免疫印迹转移到硝化纤维膜在300毫安3小时。1% BSA的膜被封锁,随后与TBS-T清洗三次。免疫印迹反应与anti-MT1-MMP, anti-EMMPRIN,反FAK anti-NF - 分别B和anti-Ig-G抗体( 稀释)1.5小时37°C其次是孵化与各自的碱性磷酸酶耦合的第二抗体。乐队是使用NBT-BCIP作为衬底。

3.8。免疫印迹分析ERK的Phospho-ERK和VEGF免疫沉淀反应

MCF-7细胞(300000/1.5毫升)是生长在无血清培养基(SFCM)没有(控制)和30的存在 M ATRA对24小时。这些细胞被收集。细胞提取进行了使用细胞提取缓冲和提取的蛋白质含量由洛瑞的方法估计。等量的蛋白质来自每个提取和ERK VEGF免疫沉淀反应的提取使用anti-ERK, VEGF, anti-Ig-G抗体和protein-G琼脂糖珠,一夜之间摇晃在4°C。结果免疫复合物在PBS洗了三次,悬浮在1 x样品缓冲和孵化37°C 30分钟,其次是孵化与0.1卷 巯基乙醇5 - 8分钟80 - 90°C。接受了7.5% sds - page电泳样品。蛋白质被免疫印迹转移到硝酸纤维素。1% BSA的膜被封锁,随后与TBS-T清洗三次。免疫印迹反应与anti-ERK抗体,anti-phospho-ERK抗体,抗vegf, anti-Ig-G抗体,分别 稀释,并将其保持在37°C 1.5小时。与TBS-T洗涤后,膜与碱性磷酸酶孵化以及各自的第二抗体( 稀释)。乐队是可视化使用电视台/ BCIP作为衬底。

3.9。细胞粘附试验

microtitre板井被涂上一层纤连蛋白(1.56 3.125 g, 6.25 g, 12.5 g, g, 25 g纤连蛋白/)。配体被允许绑定为1.5小时37°C。井被封锁与缓冲C (1% BSA、CaC 1毫米 德国,1毫米 在PBS) 1小时37°C。控制和30 M ATRA-treated完全培养基(24小时)MCF-7细胞是从文化trypsinised盘子,洗,悬浮在缓冲C,添加到microtitre板(50000个细胞/),并允许绑定在37°C 1.5小时。井被洗 3与缓冲区c细胞trypsinised,指望血球计,表示为%的附着力。

3.10。统计分析

统计分析与学生的完成 以及控制和治疗组之间的比较。

4所示。结果

4.1。ATRA对细胞活力的影响

细胞生存能力MCF-7(图1(一))检查ATRA治疗前后细胞使用锥虫蓝染色(0.4%)。在控制的情况下113个细胞在0.1(平均3实验) L(控制)算作是可行的,处理3的实验显示110细胞/ 0.1的平均水平 L(治疗)是可行的。然而, 以及显示,没有统计上的显著差异( 两组之间)。因此,没有观察到变化在细胞的可行性控制和ATRA-treated。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
细胞生存能力分析:MCF-7(300000细胞/ 1.5毫升)(图1(一))和A375(300000 /毫升)(图1 (b))细胞生长在无血清培养基(SFCM)没有(控制)和30的存在 M ATRA(图24小时(治疗)1(一))和(图48小时1 (b))。收集细胞,0.4%台盼蓝的解决方案是添加在控制和ATRA-treated细胞悬液。的蓝色细胞和nonblue细胞数量和计算 以及做是为了获得 值。Zymographic pro-MMP-2活动的分析:MCF-7(300000细胞/ 1.5毫升)细胞生长在无血清培养基(SFCM)没有(控制)(lane C)和10(巷1),20(巷2),30(巷3) M ATRA(图24小时1 (c))。文化上层清液收集和基质金属蛋白酶是集中使用Gelatin-sepharose 4 b珠子。明胶酶筛选了从珠样品缓冲和受到zymography 7.5% sds - page copolymerised 0.1%明胶。酶谱处理2.5% triton x - 100 30分钟其次是孵化20小时的反应缓冲和沾coomassie蓝色。定量测定的酶谱(图1 (c))是由使用图像J发射器(1.4.3.67版)。(C)显示了在控制细胞的SFCM pro-MMP-2活动。(1)的代表SFCM pro-MMP-2活动10 M ATRA-treated细胞。(2)和(3)代表了在20和30 SFCM pro-MMP-2活动 M ATRA-treated细胞(24小时),分别。

图1 (b)显示A375细胞的细胞生存能力。在138年控制、细胞/ 0.1 L(平均3实验)和134个细胞/ 0.1处理 L(平均3实验)是可行的。 表明细胞中没有统计上的显著差异的可行性ATRA治疗(控制)和ATRA-treated(治疗)细胞。

4.2。ATRA对Pro-MMP-2活动的影响

比较酶谱(图1 (c))的控制(lane C) MCF-7细胞和MCF-7细胞治疗10 M(巷1),20 M(巷2)和30 米(巷3)ATRA 24小时显示明显的减少30 SFCM pro-MMP-2活动 M ATRA-treated MCF-7细胞比的控制。10后Pro-MMP-2活动没有明显抑制 M和20 M ATRA治疗24小时。Pro-MMP-2活动控制,30 M ATRA-treated(12小时)MCF-7细胞SFCM gelatinolytic活动没有明显的变化。

4.3。ATRA对TIMP-2蛋白表达的影响

当文化上层清液控制和30 M ATRA-treated MCF-7细胞化验MMP-2和组织抑制剂MMP-2 (TIMP-2)蛋白ELISA(图2),发现ATRA TIMP-2蛋白水平明显提高。 ( )表示获得的数据是十分重要的。


图2
ELISA TIMP-2,钙RAR和CRABP:MCF-7(300000细胞/ 1.5毫升)细胞生长在无血清培养基(SFCM)没有(C)和30的存在 M ATRA (E)为24小时。文化收集上层清液和油井的ELISA板涂有50 L SFCM(用于TIMP-2)和50 g蛋白(钙RAR & CRABP)控制和ATRA-treated细胞并将其保持在4°C的过夜。第二天的内容和水井洗井就被随手丢弃,阻断缓冲区。然后50 L阻止缓冲区被添加到每个好,保持在37°C 1小时。阻断缓冲区丢弃和水井洗了洗缓冲区。井被anti-TIMP-2反应(图2),anti-Ecadherin(图5 (c)),anti-RAR(图8(一个)),反CRABP(图8 (b))抗体,分别保存在37°C 1小时。井洗了洗缓冲和反应各自HRP-coupled二次抗体和保存在37°C 1小时。井洗了洗缓冲然后三甲基质添加到每个颜色发展好。颜色反应停止了1米 解决方案和OD的测量在450海里。表达水平的OD表示TIMP-2 ( ( 在控制和治疗MCF-7细胞)。
4.4。ATRA对MT1-MMP表达的影响

研究pro-MMP-2激活的状态复杂,我们研究了膜1型MMP (MT1-MMP)表达式通过免疫印迹使用anti-MT1-MMP多克隆抗体。结果(图3(一个))表明,30 M ATRA-treated (lane E) MCF-7细胞表现出更低的表达MT1-MMP比未经处理的MCF-7细胞(lane C)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
免疫印迹MT1-MMP EMMPRIN:MCF-7(300000细胞/ 1.5毫升)细胞生长在没有(lane C)和30的存在 M ATRA SFCM (lane E) 24小时。这些细胞被收集和提取细胞提取缓冲。50 克蛋白质控制和ATRA-treated细胞提取运行在7.5% sds - page和蛋白质被免疫印迹转移到硝酸纤维素。膜与反MT1-MMP(图孵化3(一个))和EMMPRIN(图3 (b))抗体然后洗后膜与各自的碱性磷酸酶耦合的二次抗体孵化。乐队是可视化使用NBT-BCIP作为衬底。Ig-G作为内部控制。免疫印迹(数据的定量测定3(一个)和3 (b))是由图像J发射器(1.4.3.67版)。(C)是控制MT1-MMP和EMMPRIN表达的细胞,分别,(E) 30 MT1-MMP和EMMPRIN表达的数量 M ATRA-treated(24小时)MCF-7细胞,分别。
4.5。ATRA对EMMPRIN表达的影响

治疗30 M ATRA 24小时(lane E)在MCF-7 EMMPRIN表达相比,差别细胞表现出明显的对这些分析的控制(lane C)免疫印迹(图3 (b))。

4.6。ATRA对MMP-2基因表达的影响

分析ATRA是否会影响MMP-2通过调控在转录水平,我们通过rt - pcr学了MMP-2 mRNA的表达。图4演示了一个减少MMP-2 mRNA表达MCF-7细胞治疗后30 M ATRA 24小时(lane E)比较控制(lane C)。


图4
rt - pcr的MMP-2:MCF-7(300000细胞/ 1.5毫升)细胞生长在没有(lane C)和30的存在 M ATRA SFCM (lane E) 24小时。细胞被洗在PBS和总RNA提取(RNAqueous PCR, Ambion)。两步rt - PCR (Retroscript Ambion)用等量的总RNA使用特定MMP-2 PCR引物。20 L的PCR产品运行在紫外线下呈现2.5%的琼脂糖凝胶和乐队。GAPDH引物被用来证实等于加载。文档是在凝胶做医生(图像主VDS公司,法玛西亚,生物技术)。
4.7。ATRA对整合素的影响Receptor-Ligand交互

图5(一个)显示30的效果 M ATRA 24小时MCF-7粘附的细胞基质蛋白(纤连蛋白)。绑定的细胞纤连蛋白显著降低对ATRA治疗24小时而结合细胞纤连蛋白保持几乎不变的12小时ATRA-treated细胞(结果未显示)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图5
(一)细胞粘附试验:MCF-7细胞(300000细胞/ 1.5毫升)是生长在没有(控制)和30的存在 MEM M ATRA对24小时10%。Microtitre井被涂上一层各种浓度的纤连蛋白和保持在37°C 1.5小时。1% BSA的解决方案是用来阻止非特异性的网站。控制和ATRA-treated胰蛋白酶化和50000年收集的细胞细胞被添加到每个。1小时后孵化的井被彻底清洗,结合细胞数量统计血球计,%的细胞坚持配体进行了计算。(b)rt - pcr的 5、 1:MCF-7(300000细胞/ 5毫升)细胞生长在没有(lane C)和30的存在 M ATRA SFCM (lane E) 24小时。两个步骤rt - pcr (Retroscript Ambion)之前是使用特定的引物与等量的总RNA 5、 1。GAPDH是作为内部控制。(c)ELISA的钙粘蛋白:钙粘蛋白ELISA与anti-E-cadherin抗体进行控制(C)和ATRA治疗(E) MCF-7细胞。 ( )表明,钙粘蛋白表达的差异之间的控制和ATRA治疗MCF-7细胞具有统计学意义。
4.8。ATRA对 和 整合素受体的表达

rt - pcr分析(图5 (b))的控制和ATRA-treated细胞表现出显著的监管 5 ATRA-treated细胞中表达。 1的表达也在30个表达下调 M ATRA治疗24小时。

4.9。ATRA对钙粘蛋白表达的影响

图5 (c)代表的状态粘附在控制(C)和30 M ATRA-treated (E) MCF-7细胞。当钙粘蛋白的表达水平控制和30 M ATRA-treated(24小时)由ELISA测定,结果表明,钙粘蛋白表达显著增加对ATRA治疗。 ( )在钙粘蛋白表达之间的控制和统计上的显著差异ATRA-treated细胞。

4.10。ATRA对FAK的表达的影响

粘着斑激酶(FAK)位于上游的信号级联,尤其是涉及FAK信号转导途径。为了确定ATRA影响MCF-7 FAK通路细胞,细胞培养在缺席(lane C)和30的存在 M ATRA (lane E) 24小时然后FAK地位是由rt - pcr和免疫印迹分析。结果表明,FAK(数字6(一)和6 (b))表达了对ATRA治疗。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
(一)FAK的免疫印迹分析:MCF-7(300000细胞/ 1.5毫升)细胞生长在没有(lane C)和30的存在 M ATRA SFCM (lane E) 24小时。这些细胞被收集和提取细胞提取缓冲。50 克蛋白质控制和ATRA-treated细胞提取运行在7.5% sds - page和蛋白质被免疫印迹转移到硝酸纤维素。膜是孵化anti-FAK抗体孵化与碱性磷酸酶耦合的二次抗体紧随其后。乐队是可视化使用NBT-BCIP作为衬底。免疫印迹的定量测量是通过使用图像J发射器(1.4.3.67版)。(C)代表各自的控制细胞中蛋白质的表达而在30 (E)代表表达式 M ATRA治疗细胞。(b)rt - pcr的FAK:图6 (b)显示的状态FAK mRNA表达控制(lane C)和ATRA治疗(lane E) MCF-7细胞。rt - pcr(图的定量测定6 (b))是由使用图像J发射器(1.4.3.67版)。(C)代表FAK的表达而控制细胞(E)代表FAK表达30 M ATRA治疗细胞各自的数据。
4.11。ATRA对NF-kB表达的影响

核因子kB (NF-kB)是一种重要的信号分子影响pro-MMP-2的激活。因此,NF-kB控制的状态(lane C)和30 M ATRA (lane E)治疗MCF-7细胞被免疫印迹化验。Figre7(一)的免疫印迹的代表NF-kB表明NF-kB蛋白质的表达明显减少30 M ATRA治疗24小时MCF-7细胞。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图7
(一)免疫印迹的NF-kB:NF-kB表达式控制(lane C)和ATRA治疗(lane E) MCF-7细胞被免疫印迹分析观察到使用前anti-NF - B主要抗体。免疫印迹的定量测量通过使用图像J发射器(1.4.3.67版)。(C)代表各自的控制细胞中蛋白质的表达而在30 (E)代表表达式 M ATRA治疗细胞。(b)、(c)和(d)免疫印迹分析ERK的p-ERK, VEGF:MCF-7细胞(300000细胞/ 1.5毫升)生长在没有(lane C)和30的存在 M ATRA SFCM (lane E) 24小时。细胞被收集和提取细胞提取缓冲。从150年ERK和PI-3K免疫沉淀反应 克蛋白质控制和ATRA-treated细胞提取物anti-ERK & g蛋白琼脂糖珠(数字7 (b)和7 (c))和抗vegf & G蛋白琼脂糖珠(图7 (d)一夜之间),使样品在4°C。在每种情况下产生的免疫复合物被三次与PBS和相应的蛋白结合的抗体筛选了使用1 x从琼脂糖珠样品缓冲。样品被孵化 巯基乙醇10分钟90°C。样品受到7.5% sds - page电泳。蛋白质被免疫印迹转移到硝酸纤维素。膜与anti-ERK孵化(图7 (b)),anti-phospho ERK(图7 (c)),抗vegf抗体(图7 (d)),分别。免疫印迹被孵化与碱性phosphatase-coupled二级抗体和乐队被电视台/ BCIP衬底可视化。Ig-G(图7 (e))是用来证实等于加载。免疫印迹的定量测量通过使用图像J发射器(1.4.3.67版)。(C)代表各自的控制细胞中蛋白质的表达而在30 (E)代表表达式 M ATRA治疗细胞。
4.12。ATRA对ERK和p-ERK

数据7 (b)和7 (c)显示比较ERK(图7 (b))和p-ERK(图7 (c))表达的免疫沉淀反应ERK和p-ERK完整的细胞提取物抗ERK和反p-ERK抗体免疫印迹紧随其后。结果表明,ATRA治疗会使ERK的磷酸化,但ERK表达不是发现ATRA治疗后显著改变。p-ERK的表达是ATRA-treated少得多(lane E) MCF-7细胞提取与未经处理的(lane C) MCF-7细胞提取。

4.13。ATRA对VEGF表达的影响

当VEGF蛋白的表达在ATRA-treated化验(lane E)和未经处理的(lane C) MCF-7细胞,免疫印迹(图7 (d))表现出明显的降低VEGF蛋白表达在30 M ATRA-treated MCF-7细胞,而控制的细胞。

4.14。ATRA对RAR和CRABP表达的影响

ELISA进行观察RAR(图的状态8(一个))和CRABP(图8 (b))对ATRA治疗和发现RAR和CRABP表达明显增加30 M ATRA-treated (E) MCF-7细胞,而细胞(C)的控制。 ( )表明,控制治疗细胞之间的差异具有统计学意义。

(一)
(一)
(b)
(b)
图8
ELISA的RAR&CRABP:RAR(图的状态8(一个))和CRABP(图8 (b))控制(C)和ATRA治疗(E) MCF-7细胞,ELISA分析使用前anti-RAR anti-CRABP主要抗体和相应二级抗体。OD表明RAR(图的表达水平8(一个); ( ))和CRABP(图8 (b); ( )在整个细胞中提取。

5。讨论

在这个沟通我们报告的影响all-trans视黄酸(ATRA)对基质金属蛋白酶的表达和活动和可能的机制,可能会影响药物发挥作用。与ATRA治疗MCF-7细胞表现出明显的抑制pro-MMP-2酶的表达和活性。治疗细胞30 M ATRA显示重要的感应TIMP-2 SFCM蛋白表达。基质金属蛋白酶的活性在胞外空间是专门被组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)。TIMPs绑定到高度保守的锌结合位点的活跃在摩尔等效基质金属蛋白酶。过表达TIMP-2可以抑制MMP-2的活动(21),它还能抑制肿瘤细胞的侵袭性和转移性行为。Braunhut等人发现视黄酸调节TIMP-2表达内皮细胞(22]。其他的研究也显示出明显的感应TIMP-1蛋白质,维生素a (23,24]。rt - pcr结果表明基因表达显著减少MMP-2 30 M ATRA治疗24小时。因此,ATRA可以抑制gelatinolytic酶活性通过调节MMP-2基因转录。Pro-MMP-2激活在通过一个独特的多步途径涉及到细胞表面 整合素,MT1-MMP TIMP-2。MT1-MMP充当pro MMP-2受体和活化剂。然而,MT1-MMP不能直接绑定pro MMP-2, TIMP-2作为衔接分子调解pro MMP-2绑定通过形成三元复杂。TIMP-2的n端结构域结合pro MMP-2的血液结合素像域。乳沟pro MMP-2需要自由MT1-MMP除了复杂的存在(25,26]。我们的结果表明ATRA介导减少MT1-MMP蛋白表达可能导致ATRA-treated pro-MMP-2激活降低MCF-7细胞。细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN), 58 kD i型跨膜蛋白是已知的在ECM重塑发挥作用通过激活MMP的生产(27]。EMMPRIN展品可能诱发MMP-2表达式(28]。ATRA EMMPRIN表达的差别在这项研究中对这些基因可能导致减少pro-MMP-2活动的SFCM ATRA-treated MCF-7细胞。

细胞粘附蛋白之间的相互作用在ECM提供信号影响形态、活性、基因表达和贴壁细胞的生存29日]。之间存在的关系,整合素受体、纤连蛋白和MMP的表达是特别感兴趣的。纤连蛋白是一种原型细胞粘附蛋白。它存在在ECM聚合物纤维网络和可溶性原体体液。两个地区在每个细胞纤连蛋白亚基具有约束力的活动: 和 。纤连蛋白位于RGD主题 和是最重要的识别网站的大部分已知的整合蛋白(30.]。整合蛋白,细胞表面受体,调解细胞ECM的依恋和发起的一系列信号事件,最终激活蛋白酶如明胶酶。整合蛋白调节信息和cell-substratum粘附和信号29日,31日]。整合素受体的绑定到纤连蛋白可以发起组织的细胞骨架和焦接触和影响基因表达的信号。纤连蛋白通过与相应的交互 整合素受体调节的活动和表现MMP-2和MMP-932- - - - - -34]。绑定到ECM分子,整合蛋白被认为接受构象变化,使胞内域的 蛋白质亚基与粘着斑。新生病灶粘连FAK似乎本地化。激活后,FAK结合Src和FAK / Src信号通路和促进细胞迁移35,36]。我们的研究表明,治疗MCF-7与ATRA会使表达的细胞 和 反映细胞粘附试验的结果,显示了ATRA治疗后肿瘤细胞纤连蛋白的蛋白结合ECM时间依赖方式。我们以前的研究表明,ATRA治疗会使 5和 1亚基的表达 SiHa细胞受体(37]。粘着斑激酶(FAK)第一次被证明是与信号转导当它被确认为一个主要的酪氨酸磷酸化的底物。有人建议,ρ,Ras-like三磷酸鸟苷结合蛋白调节焦点粘连和肌动蛋白应力纤维的形成,可能参与FAK的激活。因此,多个癌细胞生存刺激信号通过不同途径收敛于诱导的酪氨酸磷酸化常见的基质,FAK [38]。此外,FAK诱发MMP-2分泌细胞内部的介质(39,40]。ATRA治疗引起显著降低FAK表达MCF-7细胞。它可能导致细胞的能动性和白明胶酶活动通过调节分泌减少MMP-2 SFCM。改变肿瘤细胞的粘附特性可能发挥关键作用的开发和发展的恶性表型的肿瘤类型。粘附分子密切参与控制等过程的形态分化,细胞增殖,入侵和殖民在遥远的器官41]。钙粘蛋白依赖信息粘附的维护是很重要的上皮钙粘蛋白表达的结构完整性和已被证明与浸润性癌细胞系和人的潜力增加肿瘤样本(42]。最近的数据表明,肿瘤相关基质金属蛋白酶可以调节信息附着力裂开钙粘蛋白(43]。证据表明可能存在钙粘蛋白和整合蛋白之间的相互作用。Anticadherin抗体已被证明,以防止丢失 和 整合蛋白在晚期区分角化细胞44]。积极的钙粘蛋白可以降低细胞粘附纤粘连蛋白的表达通过转录抑制部分 整合素基因(45]。我们的研究结果表明,ATRA治疗上调MCF-7细胞钙粘蛋白表达可能下调 和 表达和可能归因于cell-matrix粘附的抑制,因此反过来抑制pro-MMP-2活动。过度的钙粘蛋白减少MMP-2活动在前列腺癌细胞和MT1-MMP鳞状细胞癌细胞(46]。因此,钙粘蛋白的过度ATRA-treated MCF-7细胞可能下调pro-MMP-2 SFCM ATRA-treated细胞的活动。

在我们的研究中,我们发现NF -的表达下降 B在ATRA-treated MCF7细胞。NF - B是活跃在核,通过其封存在细胞质中抑制剂的抑制 (我 我)。 B激酶(IKK)会降低 B,从而释放NF - B从抑制47]。NF - B介导MT1-MMP诱导和pro-MMP-2激活。骨桥蛋白,膜蛋白诱发NF - 通过我B介导pro-MMP-2激活 B / IKK磷酸化[48]。因此,通过抑制NF - B蛋白表达ATRA可能下调pro-MMP-2激活。此外,本构激活NF - B很可能发挥抗凋亡作用在乳腺癌和前列腺癌的细胞49]。本构的抑制NF - 通过减少NF - B激活 B表达ATRA-treated MCF-7细胞可能因此提高基底细胞凋亡率。

双特异性磷酸酶6 (DUSP6 shp)脱去磷酸激活ERK和块生长刺激信号。DUSP6 shp和RGS16(蛋白信号调节器16)转录upregulation抑制肿瘤细胞增殖和ERK磷酸化和作为负监管机制来防止进一步的ERK的磷酸化。刘等人显示RA诱导upregulation DUSP6 shp & RGS16 [50]。我们的研究表明减少p-ERK ATRA-treated细胞水平。减少ERK磷酸化可能结果由于ATRA诱导转录激活DUSP6 shp RGS16。激活ERK在MT1-MMP的表达中扮演着重要的角色51,52]。降低激活ERK可能导致较小的表达MT1-MMP ATRA-treated细胞。

血管生成是最重要的一个恼人的步骤在癌症的发展。各种血管生成因素调节癌症。proangiogenic的一些因素,如凝血酶, 肝细胞生长因子,血管内皮生长因子(VEGF)是已知的贡献的激活和释放MMP-2 [53,54]。在配体(VEGF)绑定到其受体VEGFR-2酪氨酸激酶信号级联得到刺激。由于这个信号级联,扩散/生存因素(bFGF),迁移因素(icam / VCAMs /基质金属蛋白酶),和血管渗透性因素(以挪士)生产55]。VEGF表达的Downregulation ATRA-treated MCF-7细胞可能导致减少pro-MMP-2活动细胞治疗。

All-trans视黄酸进入细胞后,其条目从细胞质核是通过CRABP I / II。在原子核结合特定受体RAR / RXR和施加其影响通过调节不同的基因转录。几项研究表明,RAR / RXR和CRABP表达了增加当细胞接受ATRA治疗(56,57]。我们的研究也表明老年病的RAR和CRABP表达ATRA治疗MCF-7细胞。

总之,目前的研究表明ATRA对pro-MMP-2活动的抑制作用和可能的分子机制。实验研究结果强烈表明,ATRA诱导抑制pro-MMP-2活动可能导致由于TIMP-2表达的增加,FAK的差别,对这些MT1-MMP, EMMPRIN, NF-kB表达式。ATRA可能干扰加整合素信号改变pro-MMP-2的表达和活动。

缩写

ATRA: All-trans视黄酸
MMP的: 基质金属蛋白酶
TIMP: 的金属蛋白酶组织抑制剂
MT1-MMP: 膜型基质金属蛋白酶
EMMPRIN: 胞外基质金属蛋白酶诱导物
FAK: 粘着斑激酶
NF-kB: 核因子kB
兵: 胞外信号调节激酶
p-ERK: Phospho-ERK
PI-3K: 磷脂酰肌醇3激酶
p-PI-3K: Phospho-PI-3K
VEGF: 血管内皮生长因子
RGD: Arginine-Glycine-Aspartate
RAR 视黄酸受体
CRABP: 细胞的视黄酸结合蛋白。

确认

作者希望表达他们的感谢导演,Chittaranjan国家癌症研究所为他连续的灵感和财政支持。