文摘

趋化因子受体CXCR4是原发肿瘤细胞的趋化因子受体经常过表达。这些癌症转移器官分泌CXCL12,趋化因子受体CXCR4独特的配位体,刺激入侵和转移这些网站。类似于我们以前的工作与chemoprotective植物化学的,3,-diindolylmethane(暗),我们在这里展示,染料木黄酮也会使趋化因子受体CXCR4和CXCL12,随后降低了迁移和侵袭性乳腺癌和卵巢癌细胞的潜力。此外,染料木黄酮和昏暗的引起显著降低趋化因子受体CXCR4和CXCL12水平更大的累积效应比复合。我们的数据显示一个新奇的植物素的保护作用机制对癌症进展表明,组合,这些化合物可能更有效。

1。介绍

植物化学物质长期以来一直与癌症的保护作用。大豆和十字花科vegetable-enriched饮食似乎特别保护,但这个anticarcinogenicity的机制还没有完全理解。染料木素,饮食的异黄酮类植物雌激素属于黄酮类化合物,被认为有抗癌的活动,尤其是对乳腺癌和前列腺癌(1,2]。大豆饮食已被证实在小鼠通过抑制细胞增殖抑制前列腺肿瘤的生长,增加了细胞凋亡,减少了微脉管密度(3]。亚洲女性流行病学研究表明,食用传统饮食富含大豆带来显著的预防乳腺癌[4]。

3,-diindolylmethane(暗),glucobrassicins的分解产物,十字花科蔬菜中发现的,已被证明体内乳腺癌有保护作用[5]。我们先前已经表明,昏暗的降低水平的趋化因子受体CXCR4和CXCL12,趋化因子受体和其独特的配位体所需的乳腺癌的转移(6,7]。除了中介原发性乳腺癌细胞的定向寻的附属机构网站,趋化因子受体CXCR4和CXCL12是重要的在癌症发展的其他方面,如粘附、增殖和血管生成。这些影响不仅限于乳腺癌,趋化因子受体CXCR4相互作用和CXCL12是涉及许多不同类型的癌症的恶化。

染料木素是广泛的生物效应,包括抗氧化活性、弱雌激素/抗雌激素的活动,upregulation细胞凋亡,抑制血管生成,抑制DNA拓扑异构酶ⅱ,抑制蛋白质酪氨酸激酶(ptk)。染料木素已被证明对特定的性类固醇受体,抑制NFkB,表达下调TGF -β,抑制EFG-stimulated生长。此外,染料木黄酮抑制2、3、7日8-tetrachlorodibenzo -p全身的二恶英(二恶英)CYP1A1活动,和异黄酮可防止CYP1A1-mediated苯并绑定芘(DNA)代谢产物(8]。

我们以前的观测,昏暗的会使乳腺癌和卵巢癌细胞趋化因子受体CXCR4和CXCL12 chemoprotective代表一个新颖的机制影响植物化学的。在这里,我们表明,这些影响并不是唯一的暗淡,但也可以看到,染料木素。有趣的是,我们看到昏暗的综合效应和染料木黄酮引发的趋化因子受体CXCR4和CXCL12差别更大的对这些化合物,表明植物化学物质结合使用chemoprotective属性可能更有效。我们也证明像暗淡,染料木黄酮专门抑制乳腺癌和卵巢癌细胞的趋化和chemoinvasion CXCL12体外。

2。材料和方法

2.1。化学试剂和细胞培养

染料木黄酮是购自σ(圣路易斯,密苏里州,美国),昏暗的购买从LKT实验室(美国明尼苏达州圣保罗),和其余的植物化学物质是一种来自大卫·希博士的礼物(加州大学洛杉矶分校,加州,美国。BG-1细胞被慷慨地提供的Kenneth Korach博士(美国国家环境健康科学研究所、数控)。MCF-7和mda - mb - 231细胞从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。MCF-7 BG-1细胞保持在最小的重要媒介。mda - mb - 231细胞保持在杜尔贝科修改鹰谷酰胺中包含4毫米。所有的媒体都从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)和补充10%胎牛血清(的边后卫;美国加州ω,Tarzana), 100 U / 100 /毫升青霉素g / mL链霉素的解决方案(双子座生物制品、西萨克拉门托,加利福尼亚州,美国),和0.25 U /毫升两性霉素B(ω)。细胞被维持在低于5% C。对所有实验,化学物质溶解在DMSO和管理细胞最终在中DMSO溶液的浓度为0.1%。

2.2。RNA提取,互补脱氧核糖核酸的合成,实时PCR

RNA隔离,互补脱氧核糖核酸的合成,taqman多路实时PCR进行如前所述[6]。趋化因子受体CXCR4和CXCL12互补使用而被放大对需求分析(亲和力Bioreagents,科罗拉多州,美国;产品号Hs00607978_s1 Hs00171022_m1,分别地。专有的序列)。数量被规范化的36 b4核糖体看家基因。正向和反向引物用于36 b4量化-CCACGGTGCTGAACATGCT -和-TCGAACACCTGCTGGATGAC -,分别。36 b4探针序列德州Red-ACCATCTCCCCCTTCTCCTTTGGGCT-Iowa黑色,。所有的引物和探针买来集成DNA技术(珊瑚镇,爱荷华州,美国)。实时PCR进行了使用ICycler智商(美国加州BioRad,大力神)或7500快(美国应用生物系统公司,加州福斯特城)在标准协议。数据分析使用ICycler或ABI软件和Microsoft Excel和意义是通过学生的评价以及。

2.3。流式细胞术

的表面染色趋化因子受体CXCR4 CXCL12和细胞内染色,细胞融合增长到70%,染料木素处理24或48小时。在CXCL12量化的情况下,细胞也cotreated 1g / mL Brefeldin (GlogiPlug;BD PharMingen,富兰克林湖,新泽西,美国)的最后六个小时孵化抑制蛋白质的分泌。细胞收获和彩色如前所述6,9)与主CXCL12抗体(研发的猫。不。MAB350;明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国),主要趋化因子受体CXCR4抗体亲和力Bioreagents猫。不。opa1 - 01101;生病,美国)或适当的主要免疫球蛋白g同形像控制抗体,紧随其后的是染色与山羊antimouse或antirabbit IgG-FITC二级抗体(美国BD-PharMingen Caltag,加利福尼亚州卡尔斯巴德,职责)。荧光是使用FACScan量化分析流式细胞分析仪(Becton Dickinson,加州大学洛杉矶分校的流式细胞仪的核心设施)。数据分析使用FCS Express3 Lite软件(从头,Inc ., Thornhill,加拿大)。

2.4。趋化性和Chemoinvasion化验

细胞用染料木黄酮预处理、暗淡或组合,其次是趋化性和入侵检测,正如我们前面描述的执行(6]。迁移/入侵后,MTS化验(威斯康星州麦迪逊Promega)中执行每个transwell控制小细胞数量的变化。在490 nm有色甲产品的检测后,细胞插入洗了PBS和那些上层轻轻删除与prewet棉签。细胞降低层固定在100%甲醇和结晶紫染色。从插入膜是手动切除,安装在显微镜载玻片,分成8等份。每个部分的细胞在一个随机的视场数40 x放大,,平均计算。平均数量从每个插入被归一化等效MTS的值。数据表示为趋化性或chemoinvasion指数,它被定义为归一化的细胞实验组相对于对照组。使用双尾学生的统计分析以及。

3所示。结果

3.1。染料木黄酮会使趋化因子受体CXCR4和CXCL12在乳腺癌和卵巢癌细胞

MCF-7和乳腺癌mda - mb - 231细胞和BG-1卵巢癌细胞治疗与染料木黄酮的浓度从1 - 100(最终以恒定DMSO浓度)24小时,之后时间趋化因子受体CXCR4和CXCL12 mrna被实时PCR量化。在1趋化因子受体CXCR4 mRNA水平明显下降染料木黄酮在所有三个细胞株(数字1(一)- - - - - -1 (c))。是差别最大对这些出现在100年50米,米,30分别M染料木黄酮在每个细胞株。CXCL12 mRNA的差别明显对这些发生在50浓度染料木黄酮在MCF-7细胞和10染料木黄酮在BG-1细胞(数字1(一)- - - - - -1 (c))。有趣的是,低剂量的染料木黄酮(1 - 10米)显著增加CXCL12 MCF-7 mRNA水平细胞,但在这些剂量BG-1细胞相反的效果。mda - mb - 231细胞不表达检测CXCL12水平。

表面流仪分析被用来量化趋化因子受体CXCR4和胞内CXCL12表达。细胞治疗30、70年或100年M染料木黄酮24小时,收获,染色,分析表面趋化因子受体CXCR4的表达水平。相对于DMSO-treated控制,趋化因子受体CXCR4在MCF-7发现被染料木素表达下调,mda - mb - 231, BG-1细胞三剂(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。CXCL12细胞内表达的分析表明,相对于DMSO-treated控制细胞,CXCL12水平减少了所有三个剂量的染料木黄酮MCF-7和BG-1细胞(数字2(一个),2 (c))。

3.2。Downregulation趋化因子受体CXCR4和CXCL12治疗后染料木黄酮和暗比单独用复合

我们之前发现昏暗的会使趋化因子受体CXCR4和CXCL12 mrna和蛋白浸润性乳腺癌和卵巢癌细胞(6]。因此我们测试引起的差别是否对这些cotreatment暗淡和染料木黄酮添加剂或协同在这些细胞系。使用实时PCR,我们量化治疗后基因表达的mda - mb - 231(仅趋化因子受体CXCR4)或BG-1 (CXCR4和CXCL12) 20昏暗的,100染料木素,或组合。我们发现在这两种细胞系,趋化因子受体CXCR4的大差别的程度对这些治疗后(数据结合与植物化学物质3(一个)- - - - - -3 (b))。在mda - mb - 231细胞,昏暗的趋化因子受体CXCR4的水平降低了57%,染料木黄酮51%,和85%的组合(图3(一个))。BG-1细胞,昏暗的表达下调趋化因子受体CXCR4 49%,染料木黄酮79%,昏暗的+染料木黄酮90%。同样,昏暗的CXCL12的水平下降了50%,染料木素水平降低了84%,染料木黄酮91%(图3 (b))。这些影响不能归因于细胞毒性,因为无论是昏暗,染料木素,也在这些细胞毒性剂量的24小时时间(数据没有显示)。

3.3。染料木黄酮专门抑制乳腺癌和卵巢癌细胞的趋化和Chemoinvasion CXCL12

由于趋化因子受体CXCR4和CXCL12调解定向迁移,因为我们前面看到昏暗的抑制这些细胞的趋化和chemoinvasion,我们进行分析来确定染料木素可以抑制迁移通过纤连蛋白和/或入侵通过基底膜基质。我们发现,预处理染料木黄酮抑制MCF-7细胞的定向迁移,导致迁移率相似背景速度(DMSO-treated细胞暴露于没有CXCL12梯度,人物4(一))。然而,我们没有看到进一步减少迁移后cotreatment染料木黄酮和昏暗的,大概是因为这两种化学物质单独使用这些剂量完全迁移到背景水平降低。这个结果表明,染料木素的程度和昏暗的趋化因子受体CXCR4表达下调表面水平这些剂量可能足以显著影响乳腺癌细胞的导航领域的高CXCL12表达式。与暗如前面我们已经看到,染料木黄酮抑制趋化作用的具体影响向CXCL12迁移,因为一个抑制MCF-7细胞趋化作用的边后卫没有被观察到。

MCF-7细胞不会入侵通过基底膜基质(合成细胞外基质),因此我们无法评估入侵这些细胞的潜能。然而,乳腺癌mda - mb - 231细胞入侵和我们能够量化这个细胞系趋化因子和chemoinvasive潜力。我们发现,染料木素,昏暗,结合显著地抑制这些细胞的趋化和chemoinvasion CXCL12,但不是对il - 6,一个已知的对mda - mb - 231细胞体外化学引诱物(数字4 (b)- - - - - -4 (c))。这一结果表明,昏暗的抑制效应和染料木黄酮特定CXCL12-induced chemoattraction / chemoinvasion,不仅仅是影响迁移或入侵。类似的结果是与BG-1卵巢癌细胞,也是入侵体外(图4 (d))。这些细胞不迁移通过基底膜基质对il - 6(数据未显示),但却表现出温和chemoinvasion的边后卫。

4所示。讨论

染料木素的抗雌激素的活动可能调解,在某种程度上,大豆对乳腺癌和其他癌症的保护作用[10]。尽管其他nonestrogenic机制抑制拓扑异构酶2的行动如PTK和可能发挥作用在这些保护作用,我们在这里描述一个额外的小说机械途径中染料木素和其他可能可以保护植物化学物质。我们发现,染料木黄酮会使趋化因子受体CXCR4在雌激素受体阳性乳腺癌细胞系(ER +), MCF-7, ER阴性(ER−)乳腺癌细胞系,mda - mb - 231和ER +卵巢癌细胞系,BG-1。此外,CXCL12趋化因子受体CXCR4独特的配位体,是由染料木素表达下调MCF-7和BG-1细胞。我们在随后的结果差别表明,该对这些抑制这些细胞的迁移和入侵CXCL12体外。

我们发现以前暗淡会使趋化因子受体CXCR4在MCF-7 CXCL12, mda - mb - 231, BG-1细胞(6]。我们这里显示,当结合使用时,昏暗的影响和染料木黄酮趋化因子受体CXCR4和CXCL12 mRNA水平大于仅用化合物,表明植物化学物质结合使用可能会增加保护作用的效果。在20暗淡,70染料木素,我们并没有发现相结合,进一步抑制乳腺癌或卵巢癌细胞的趋化性或chemoinvasion因为这些植物化学物质的浓度完全抑制这些过程。然而,在稍低剂量的1050 M暗淡,染料木素,结合似乎是更有效地抑制mda - mb - 231细胞的趋化作用。在这些后者剂量,个体植物化学物质不完全减少这些细胞的趋化性背景水平。因此这些结果表明,低剂量的植物化学物质结合使用可以同样或更有效的保护以免比高剂量的一个单一的植物化学的。

昏暗的作用机制的差别和染料木黄酮对这些趋化因子受体CXCR4和CXCL12仍有待确定。暗和染料木黄酮作为弱雌激素受体受体激动剂/拮抗剂,和因此可能的化合物可以通过相同的机制。的差别不过重要的是,我们看到对这些趋化因子受体CXCR4和随后的抑制趋化性和chemoinvasion mda - mb - 231细胞,不表达雌激素受体。另一方面,昏暗的气道高反应性的配体,而气道高反应性染料木黄酮没有显示绑定在细胞系,我们使用。染料木黄酮是一种特定PTK抑制剂以及拓扑异构酶ⅱ抑制剂,并可调节TGF -β信号转导(11,12]。有趣的是,染料木黄酮和昏暗的已知抑制NFkB乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌细胞(13- - - - - -15]。自NFkB趋化因子受体CXCR4在转录水平调节,似是而非,靠微弱的差别的趋化因子受体CXCR4 / CXCL12机制对这些基因和/或染料木黄酮可能通过NFkB失活(差别或对这些16,17]。

宽恕的一般使用染料木黄酮作为补充这一点争议。大豆产品广泛使用在亚洲人口没有明显的不利影响,但是实验数据导致担忧染料木黄酮和其他成分的大豆的安全性。虽是耐受性良好,高剂量的染料木黄酮在长期的研究中引起肾脏的重量的增加,脾、肾上腺、睾丸雄性老鼠和增加肝、肾、脾、卵巢、子宫重量在雌性老鼠18]。在相同的研究中,组织学变化在雄性和雌性大鼠的生殖器官。这些发现是由雌激素染料木黄酮的性质。染料木黄酮能像一个雌激素和抗雌激素和雌激素的净效应的化学已被证明难以量化(11]。慢性接触研究最近由美国国家毒理学计划有显著提高乳腺腺瘤和腺癌的发病率(组合)19]。重要的是,政府似乎显著影响的时间是否染料木黄酮引发保护性,不利,或没有影响20.]。例如,dimethylbenzanthracene (DMBA)全身的乳腺癌症在青春期前的减少和染料木黄酮青春期前的和成人管理相结合,但不是prenatal-only或成人治疗后(2]。

剂量发挥了至关重要的作用在生物染料木素的影响;尽管剂量大于10M /一段时间抑制ER +和ER的生长−乳腺癌细胞,低剂量的染料木黄酮(1米)似乎刺激ER +乳腺癌细胞的生长(21,22]。有趣的是,CXCL12已被证明调解雌二醇在乳腺癌细胞的增殖的影响(23]。我们注意到显著增加CXCL12信使rna与低剂量治疗后(1 - 10米)MCF-7染料木素的细胞,虽然并没有观察到这种效应在mda - mb - 231或BG-1细胞。CXCL12的upregulation低剂量的染料木黄酮在组织仍有待确认,作为常见的网站转移,如肺和骨。然而,根据已知的毒性和潜在致癌染料木素的影响,这一观点强调了全面的安全分析的重要性之前纵容植物化学物质作为膳食补充剂的使用。特别是,它强调剂量的重要性,尤其是在组织层面,当评估染料木素的影响在乳腺癌和其他癌症的开发和发展。

这里描述的剂量的染料木黄酮和昏暗的可能实现人类的补充,特别是在组织级别。染料木黄酮总等离子体浓度高达20μ米后得到喂养人类志愿者染料木素补充剂(24- - - - - -26]。此外,染料木素被发现在某些器官积累相当高的浓度(27),这可能是脂肪组织,如乳腺癌,特别是。当老鼠注射单剂量口服昏暗的血清浓度约为5M。更高浓度累积在某些器官(28]。因此,染料木素的浓度和暗淡,用于我们的研究可能会反映在人类实现剂量。

由于趋化因子受体CXCR4和CXCL12涉及许多不同的癌症的进展,它是确定感兴趣的昏暗和/或染料木素表达下调这些蛋白质在癌症细胞系的起源。也会是重要的植物化学物质调查CXCL12是否下调组织作为首选网站这些癌症的转移,如肺和骨。此外,由于许多其他植物化学物质与癌症的保护,这将是谨慎地确定植物化学物质除了昏暗和染料木黄酮对趋化因子受体CXCR4和CXCL12水平起到类似的作用。最后,结合植物化学物质应被测试体内是否能取得疗效的影响。

5。结论

昏暗的被建议作为一种潜在的ER +乳腺癌化疗。然而令人惊讶的是,我们发现昏暗和染料木素表达下调趋化因子受体CXCR4和CXCL12 ER +和ER−细胞系,表明这些植物化学物质可能是有效的早期和晚期乳腺癌的治疗。有效治疗疾病缺乏先进、和化合物的潜在使用无害的植物化学物质——早期或晚期癌症的治疗是一个有吸引力的选择。此外,趋化因子受体CXCR4靠微弱的差别和CXCL12对这些反应的增加,染料木黄酮结合可能是有用的在体内引起强效应和也许允许优化相关的生物反应。

确认

这项研究是由美国癌症研究协会批准号441450 - 58819哦,加利福尼亚大学的虹膜Cantor妇女健康中心和加州大学洛杉矶分校临床营养研究单位。