MMP9但不是EGFR,满足,ERCC1、P16, P-53与伴随的放疗反应,西妥昔单抗,每周顺铂在局部晚期头颈部癌症患者

文摘

伴随政府与顺铂的放射治疗或放疗似乎西妥昔单抗治疗的首选局部晚期头颈部癌症患者。在目前的回顾性分析,我们研究了几种生物标志物的预测作用在一个没有伴随患者的放射治疗,每周顺铂,西妥昔单抗(CCRT)。我们确定了37个病人使用这种方法,其中13例(35%)实现一个完整的响应和10(27%)达到了部分响应。严重的副作用主要是白细胞减少、吞咽困难、皮疹和贫血。肿瘤EGFR,满足,ERCC1, p-53蛋白质和/或基因表达没有与治疗反应相关。相比之下,高MMP9 mRNA表达与客观的反应被发现显著相关。总之,CCRT是可行的和积极的。MMP9是唯一的生物标志物检测,似乎西妥昔单抗治疗的患者的预测价值。然而,这是一个假设生成研究和结果不应该被视为决定性的证据,直到他们确认在一个更大的群体。

1。介绍

伴随chemo-radiotherapy,主要与顺铂是标准的形态相结合的方法治疗局部晚期鳞状细胞癌患者的头部和颈部头颈部鳞状细胞癌(),因为它延长生存和增加器官保存的机会比单独放疗(RT) (1- - - - - -3]。几个潜在的机制,通过顺铂作为辐射敏化剂,已报告了(4]。

单药顺铂(100毫克/每3周)管理与RT广泛应用以来,高剂量所带来的系统性影响,同时充当radio-sensitizer [5]。然而,治疗益处来自合并后的形态由限制性毒性抵消在很多情况下,主要神经毒性、耳毒性,呕吐,口腔炎(6]。为了减少cisplatin-related毒性,几个研究人员测试了顺铂的替代计划管理,如每日或每周的注入。支持使用这些不同的时间表体外数据显示低剂量顺铂和RT,结合时,协同作用在细胞杀死3]。在过去的几年里,调查人员在希腊合作肿瘤组(HeCOG)采取了每周的时间表的顺铂与RT(头颈部鳞状细胞癌治疗局部晚期患者7]。

能够很好的证明,表皮生长因子受体(EGFR)在42%到80%的例头颈部鳞状细胞癌(8,9]。表皮生长因子受体扮演关键的角色以及头颈部鳞状细胞癌的增殖和存活细胞及其超表达与晚期和糟糕的结果(10,11]。在先前的研究表皮生长因子受体表达,提出了作为一个更强的局部区域预测控制比T台(9]。因为这个原因EGFR抗癌药物的似乎是一个有吸引力的目标。此外,表皮生长因子受体是一个重要的决定因素的反应RT和授予保护致命的癌症细胞DNA损伤引起的电离辐射(12- - - - - -14]。

表皮生长因子受体的主要机制赋予导线最近审查(15]。体外研究表明,肿瘤可以敏化辐射通过阻断EGFR的辐射诱导核进口,通过表皮生长因子受体酪氨酸激酶的表达域激活突变或西妥昔单抗(艾比特思,Merck-Serono)的使用。然而,这种突变不常发生在头部和颈部癌症。

西妥昔单抗是一种IgG1单克隆抗体针对表皮生长因子受体的配体结合域。西妥昔单抗表皮生长因子受体结合,扣押的受体细胞质降解和最终目标。这已经证明体外抗体提高radio-sensitivity头颈部鳞状细胞癌的细胞(16,17)通过几个过程综述(18,19]。

因为患者头颈部鳞状细胞癌局部晚期复发本地通常在遥远的网站20.,21),它似乎是合理的EGFR overexpressing肿瘤患者接受局部区域的治疗更有效。这样一个RT与西妥昔单抗的治疗策略是随之而来的管理。这理由支持临床前模型,西妥昔单抗与RT行为表现为协同作用[22]。在一个关键的随机III期试验(23西妥昔单抗和RT的伴随政府改善局部区域控制和长期生存相比,RT独自在头颈部鳞状细胞癌局部晚期患者。

引入后的西妥昔单抗与RT头颈部鳞状细胞癌治疗局部晚期,希腊的肿瘤学家使用RT与伴随政府西妥昔单抗和每周的顺铂(这里叫CCRT),作为这类患者的治疗策略。这种方法背后的背景是,西妥昔单抗局部区域控制和增加这类患者的生存。因此,似乎逻辑加顺铂积极综合治疗方法进一步改善的结果,尤其是这种实证方法支持体外研究[24]。

它已被证明在体外和肿瘤标本,配体的表达肝细胞生长因子(HGF)散射因子及其受体HGFR(遇到)增加以及头颈部鳞状细胞癌的侵袭性生长期间和这个途径,通过既定的co-activating其他重要途径,转移过程中可能发挥重要作用的细胞(头颈部鳞状细胞癌25]。

ERCC1(切除修复cross-complementation组1)基因是一种16基因编码的蛋白质的核苷酸切除修复复杂,除去cisplatin-induced DNA加合物(26]。ERCC1所示是一个随机研究(27)是一个重要的预测因素完全切除非小细胞肺癌(NSCLC)患者接受cisplatin-based辅助化疗。在上面的研究中,只有ERCC1 -肿瘤患者显示从治疗中受益。多态性的utr ERCC1和编码区域的ERCC2 / XPD和XRCC1基因与疾病预后有关,对顺铂在患者头颈部鳞状细胞癌(28]。

基质金属蛋白酶(MMPs)是一个家庭的zinc-dependent发挥重要作用的蛋白酶破坏和修复细胞外基质和基底膜的各种生理和病理过程,包括胃肠道炎症和致癌作用[29日,30.]。重要的是,基质金属蛋白酶的激活释放的生长因子extracellualr矩阵,包括表皮生长因子受体、FGFR和PDGFR配体(31日]。临床研究已经证明,MMP9在肿瘤导致血管生成中起着重要的作用,与肿瘤相关的炎症和基质细胞蛋白酶的主要来源。MMP9-mediated释放血管内皮生长因子(VEGF)和招聘周的血管生成血管被假定是MMP9-stimulated血管生成的主要过程(32]。

在目前的回顾性分析我们报告我们的经验使用CCRT头颈部鳞状细胞癌局部晚期患者。据我们所知这是第一个报告这个组合在这些病人的疗效。此外,我们评估了协会的各种潜在的肿瘤生物标志物CCRT观察反应。

2。患者和方法

2.1。资格和治疗

37个新诊断患者的医疗记录,组织学证实局部晚期肿瘤、头颈部鳞状细胞癌nonnasopharyngeal对待CCRT在四个中心,采用上述治疗策略,进行回顾性综述。为这种类型的病人的治疗的时代18年,性能状态(PS) 0 - 1在东部合作肿瘤组(ECOG)规模和足够的骨髓,忍受治疗的肝和肾功能。根据我们的标准做法,书面知情同意之前从每个病人获得收购生物材料为研究目的。

所有患者治疗的直线加速器意图获得明确的RT (70 Gy肿瘤区域和45 Gy其余的脖子)与顺铂每周40毫克/和每周400毫克/西妥昔单抗第一周期间,作为一个负荷剂量250毫克/在周2 - 7日。所有患者治疗管理之前,水化和给定标准术前用药法。所有病人的H3-antagonist被用作止吐剂。

药物剂量进行了修改根据副作用如前所述的年级7,33]。RT技术的细节,通常用于我们的中心,也被描述(7]。所有不良事件分级根据美国国家癌症研究所分析常见毒性标准(NCI-CTC,版本3.0)。肿瘤放射治疗组(RTOG)标准被用来评估RT-related毒性。

完成CCRT大约三个月后,所有患者进行了检查包括内窥镜检查,胸部x光片,超声波或计算机断层扫描(CT)扫描肝脏,和CT扫描或MRI的头部和颈部区域。在选定的病人,尤其是部分响应(PR),一个(¹⁸F] fluoro-deoxy-D-glucose (FDG)正电子发射断层扫描(PET) / CT扫描也推荐。基线和post CCRT扫描回顾性收集和审查由放射科医师(a .取)在头部和颈部拓扑和一个独立的放射学家。应对CCRT被RECIST标准评估。

2.2。组织微阵列(TMA)建设

Formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)从36例肿瘤组织用于蛋白质和基因分析。代表幻灯片(圆))综述了组织块由两个有经验的病理学家(g·k和m . b .)证实诊断,充足的材料和计算肿瘤在每种情况下的百分比。32标本排列(2芯每箱,1.5毫米直径)到受体蜡块(Paraplast麦考密克,圣路易斯,密苏里州,美国)使用手册数组(比彻仪器,太阳大草原,WI,美国)。TMA块还包括组织核心,在第一个和最后一列,从皮肤、扁桃体、胎盘、肾、甲状腺、卵巢癌、前列腺癌、移行细胞癌作为积极的和消极的控制。

2.3。免疫组织化学(包含IHC)

免疫组织化学标签根据执行标准协议用细微的修改(34在连续3米厚的部分,形成原始的块或TMA块。正如之前报道的(35),TMA免疫染色的重现性不同的蛋白质相比,从原始的整个部分石蜡块是非常高的。deparaffinization,抗原检索和EGFR染色程序(克隆31日七国集团(g7),酶(表达载体),卡尔斯巴德,CA,美国;稀释1:50),ERCC1(克隆8季,Neomarkers弗里蒙特、钙、美国;稀释1:450),p(克隆SPM304,春天生物科学、弗里蒙特、钙、美国;稀释)和p-53(克隆7,Dako、Glostup、丹麦;稀释1:50)进行使用债券马克斯autostainer(徕卡,位于德国)。肝细胞生长因子受体(HGFR /遇见)蛋白质研究使用抗体特定的β链的外部域满足蛋白质(克隆8季,Novocastra、纽卡斯尔、英国)。deparaffinization和抗原暴露后,幻灯片是在室温下培养1小时的会见了抗体的稀释1:50。洗后的主要抗体,幻灯片是孵化nonbiotin聚合物检测系统(BioGenex,圣拉蒙,CA)总共40分钟。抗原抗体复合物是可视化使用diaminobenzidine (BioGenex)作为发色体。幻灯片与梅耶尔的苏木精复染色5分钟(莱卡),在淡水洗,脱水和安装。

同时包含IHC部分完成的评估两个病理学家(g·k和m . b .)失明的患者的临床特点和生存数据,根据此前提议/建立标准用细微的修改。表皮生长因子受体反应强度是使用四个系统分36];0(负面),没有染色或背景染色;1 +,明确的胞质染色和/或弱不连续膜染色;2 +,温和的完整或不完整的膜染色;3 +,强大的完整的膜染色。情况下被认为是积极的时候10%以上的肿瘤细胞显示至少1 +染色,而2 + 3 +染色分为EGFR蛋白表达。

ERCC1评价核染色是根据提出的标准Olaussen et al。27]。上述系统是基于H半定量评分,结合染色强度和阳性肿瘤细胞的百分比。所有H的平均分数被选为分离的切断点正面的负面情况。

HGFR(遇到)蛋白表达是评估使用intensity-adjusted评分系统(染色的结合比例和强度)根据及其et al。37]。简单、强度得分范围从0到3(0 =没有染色,1 =弱阳性,2 =适度积极的,和3 =强阳性染色),和染色模式基于积极的肿瘤细胞的百分比范围从0 - 3(0 = 0至5%,1 = 6至25%,2 = 26%至50%,3 = 51%到100%)。染色的本地化是胞质或胞质膜的。情况下总得分至少2被认为是积极的(表达的肿瘤),而总分数的情况下0 - 1被组合在一起,被认为是负面的或低表达肿瘤。核和/或胞质染色的25%的肿瘤细胞被认为是积极的(38]。p-53蛋白表达,例得分是正面的还是负面的,如果10%的核或10%的细胞核染色,分别39]。

2.4。荧光原位杂交(FISH)

鱼是4.5上执行m厚TMA的部分或整个部分FFPE档案组织样本使用LSI EGFR / CEP7双颜色探测器,(美国雅培分子、德斯普兰斯IL), LSI D7S486 / CEP7双颜色探测器,(雅培分子)和HGFR /认识基因的特定地区7问,波塞冬重复免费满足/ SE7探针(Kreatech诊断、阿姆斯特丹、问)。表皮生长因子受体探针,检测300 kbp基因组区域跨越7 p12的表皮生长因子受体位点,和LSI D7S486检测200 kbp的基因组区域,区域7问,与SpectrumOrange贴上标签,着丝粒7特定探测器(CEP7)与SpectrumGreen贴上标签。LSI D7S486 / CEP7双颜色探测器是用来确定删除7问头颈部鳞状细胞癌中,经常发现了病人,表明肿瘤抑制基因的存在(40]。HGFR /基因探针直接贴上会见PlatinumBright550和SE7(染色体7卫星枚举)与PlatinumBright495探针。

鱼是根据制造商的协议与小修改。短暂,探针deparaffinized组织部分在柠檬酸溶液孵化,pH值6.0 10分钟在98°C。洗后2分钟的两倍,对待蛋白酶K的解决方案10分钟37°C做好(Dako),洗5分钟和1分钟2 xssc解决方案和脱水(75年、85年和100%的乙醇,每1分钟)。5 - 15L探针的混合物被应用于每个幻灯片,幻灯片被覆盖,覆盖与fixogum橡胶水泥密封,热变性5分钟在72°C (LSI EGFR / CEP7和LSI D7S486 / CEP7)和80°C(遇到/ SE7)热板,和杂化至少16 h 37°C湿度室。移除覆盖会孵化后清洗缓冲(NP-40 SSC, 0.3%),幻灯片7分钟洗了洗缓冲区在72°C。随后,幻灯片脱水在70%、90%和100%的乙醇,每1分钟,风干免受光,最后核计数器与DAPI染色进行了/不变色的解决方案(ZytoVision)。

在3例,由于材料不足鱼化验我们执行顺序茎荧光原位杂交(SML-FISH)根据Walch et al .,与幻灯片修改(41]。图像采集后,幻灯片之前杂化LSI D7S486 / CEP7被加热部分SSC清洗解决方案在75°C 16小时,其次是变性在73°C 5分钟70%甲酰胺/ SSC。然后,幻灯片与DAPI和检查复染色荧光(x100石油镜头),以确保没有荧光信号。杂交,posthybridization和核复染色过程遇到/ SE7探针进行如上所述。

幻灯片与EGFR / CEP7杂交探针进行了分析使用蔡司荧光显微镜(HBO Axioskop 2 + 100)配备高质量的目标和一个合适的滤波器组。幻灯片杂化与大规模集成电路D7S486 / CEP7和满足/ SE7探针进行了分析使用尼康80我荧光显微镜(尼康GmbH,杜塞尔多夫,德国)机动4滑阶段,配备高质量的目标(尼康所有形式),一套合适的四个过滤器(DAPI, doublePath FIRC / TRITC ZyGreen类似的雅培分子SpectrumGreen Kreatech PlatinumBright550,阿博特和ZyOrange类似于分子SpectrumOrange和Kreatech PlatinumBright495(所有从浓度技术公司,为Rockingham市增加,VT,美国)]和一个超灵敏的黑白相机(打印大师、萨里、BC、加拿大)。的荧光照明,X-cite 120(加拿大安大略省EXFO光子解决方案公司)配备长寿命120瓦的金属卤化物短弧灯使用。

鱼的评估分析,在大多数情况下,超过字段(x100)是由计算机控制的数码相机捕获和处理商用软件系统(鱼成像仪Metasystems、Altlussheim德国EGFR / CEP7和XCyto-Gen, Alphelys,整容项目,法国LSI D7S486 / CEP7和满足/ SE7)。后者探测、顺序、数字图像捕捉到DAPI堆栈电动机(1或2飞机在0.50.85米),ZyGreen(5飞机米或1.15 4架飞机飞机在0.85 m)和ZyOrange (5米或1.15 4架飞机m)过滤器设置,和由此产生的图像重建的蓝色、绿色和红色的假彩色。六十不重叠的完整核侵袭性肿瘤进行评估的一部分的每种情况下根据形态学标准使用DAPI染色。

鱼的评价部分是同时由两个观察员(g·K和m . B)。对于每一个标本,绝对和平均每个DNA探针的拷贝数每个细胞,细胞的总数和比例为零,一个,两个,三个,4份相应的探测器,纯合子和杂合的删除,预断和多体性,以及基因/ CEP7比率计算。

鱼模式定义的表皮生长因子受体基因(如前所述)(42]。D7S486轨迹的状态评估如下:如果删除35%的肿瘤细胞核含有一个信号;三染色体细胞/多染色体如果10%的肿瘤细胞显示两个或更多的副本D7S486轨迹和染色体7。HGFR /满足基因状态分类根据Cappuzzo et al。43)由六个鱼地层如下:(1)二体性(2册90%的细胞);(2)低三染色体细胞(2册40%的细胞,3册10 - 40%的细胞,4册10%的细胞);(3)高三染色体细胞(2册40%的细胞,3份40%的细胞,4册10%的细胞);(4)低多体性(4册10 - 40%的细胞);(5)高多体性(4册40%的细胞);和(6)基因扩增(定义的存在紧密的表皮生长因子受体基因集群和表皮生长因子受体基因的染色体2或15每细胞表皮生长因子受体的副本分析细胞的10%)。

2.5。表皮生长因子受体、ERCC1、MMP9 mRNA的表达

回顾性研究,完整的高质量的RNA,由RPL37A管家基因的分析,从33 FFPE孤立肿瘤组织样本采用实验方法基于专有的磁珠从西门子医疗诊断(德国科隆),如前所述[44]。恶性细胞的数量代表至少30%的所有有核细胞每节,核实,hematoxylin-eosin染色。动能逆转录-聚合酶链反应(kRT-PCR)申请评估的信使核糖核酸(mRNA)表皮生长因子受体的表达,ERCC1和基于使用以下TaqMan MMP9的底漆/探针集:

表皮生长因子受体探针CCTTGCCGCAAAGTGTGTAACGGAAT正向引物CGCAAGTGTAAGAAGTGCGAA反向引物CGTAGCATTTATGGAGAGTGAGTCTERCC1探针TCCTCGCCTGGAGCCCCGA正向引物AGGAGCTGGCTAAGATGTGTATCCT反向引物CCAGGTACCGCCCAGCTTMMP9探针CAGGCAGCTGGCAGAGGAATACCTGTAC正向引物CCCTGGAGACCTGAGAACCA反向引物CCACCCGAGTGTAACCATAGC

RPL37A和GAPDH是用作家务(规范化)基因。四十核酸扩增循环应用和循环阈值(CT)值目标基因的识别。CT值被减去的CT值归一化看家基因RPL37A CT值的目标基因(ΔCT)。RNA结果被报告为40-ΔCT值,相关比例目标基因的信使RNA表达水平。

人类参考总RNA汇集从十人类细胞系(Stratagene拉霍亚,CA)是作为一个积极的控制。RNA-free从肿瘤组织中提取的DNA被用作消极的控制。

2.6。ERCC1、ERCC2 / XPD和XRCC1基因多态性

外周血DNA和FFPE组织正常化20 ng / uL。使用以下Taqman SNP基因分型检测(应用生物系统公司、Biosolutions雅典,GR): C_3145050_10,检测ERCC2 Asn312Asp (AAC / GAC)多态性(rs1799793);C_3145033_10,检测ERCC2 Lys751Gln亚美大陆煤层气有限公司/ CAG多态性(rs13181));C_622564_10,检测XRCC1 Gln399Arg (CAG / CGG)多态性(rs25487);和C_2532948_10,检测ERCC1 C8092A / CD3EAP Q504K (Gln /赖氨酸)多态性(rs3212986)。值得注意的是,这个序列被测定(CACAGGCCGGGACAAGAAGCGGAAG [C / A] AGCAGCAGCAGCAGCCTGTGTAGTC),匹配先前的报道(45),包括一个多态性utr ERCC1基因,同时位于结束CD3EAP编码区域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=3212986),因为这些基因在19 q13.3坐落在相反的方向。因此,CTG > (G / T变化)是总部ERCC1向前序列,对应于反向CAG >亚美大陆煤层气有限公司在CD3EAP (C /改变)。在重复运行进行了10与40 L反应ng DNA输入,放大了40周期在标准条件下在一个ABI7500实时PCR系统配备了SDS v1.4软件保持默认参数(应用生物系统公司、Biosolutions雅典,GR)。负控制没有提供放大曲线,而样品扩增曲线被认为是进行进一步分析,如果发现产品的周期阈值(Ct)38。差异意味着Cts (dCt)的两个等位基因检测分析是:0.47 1.93 ERCC1 C8092A, ERCC2 N312D, 1.55 ERCC2 K751Q, 1.34, XRCC1 Q399R,所有这种类型的分析在可接受的范围内(2)(应用生物系统公司)。

2.7。表皮生长因子受体和kRAS突变分析

基因组DNA是源自FFPE肿瘤如前所述45]。样品组成的75%的肿瘤细胞被认为是符合DNA提取和序列分析,否则macrodissection增加肿瘤细胞的内容执行75%。

我们放大外显子18、19、20和21的表皮生长因子受体酪氨酸激酶域从基因组DNA(原发肿瘤组织DNA)和生殖系DNA(外周血DNA) Invisorb旋转的血液中提取Midi设备(Invitek GmbH,柏林,德国)根据制造商的指示。进行了PCR的如前所述[46]。突变都再度确认PCR扩增和分析一个独立的DNA分离。外显子18、19、20和21后在所有病人中被确认为窝藏突变。生殖系DNA分析两次外显子18、19、20日和21日患者突变,为了证实表皮生长因子受体突变体细胞和生殖系。kRAS突变分析的基码如前所述[执行12和1347]。

所有PCR产品被固相净化可逆固定化化学双向dye-terminator荧光测序紧随其后。所有外显子测序与内心的正向和反向引物用于PCR。序列分析和爆炸的色谱手册评审,和比较:表皮生长因子受体信使rna参考序列加入纳米005228和/或加入表皮生长因子受体基因序列数量AF288738;RAS mRNA GI 34485723和/或RAS基因序列GI 14277199 (http://www.ncbi.nlm.nci/)。

L858R EGFR 21外显子突变,也分析了PCR / RFLP基于新的存在Sau96I限制网站创建的突变。删除外显子19也分析使用高性能凝胶电泳(2.5%琼脂糖)。

2.8。人乳头状瘤病毒检测

检测hpv 16和HPV-18 DNA是由作者之一(a . l .)和基于放大的E6地区采用Ogura et al。48),小的修改。简单地说,每一个反应包含0.2 - -0.4g DNA模板在10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值8.3,50 mM氯化钾,1.5毫米MgCl₂,200毫米核苷酸,1.5单位TaqDNA聚合酶(Fermentas),和100点的每个引物总量的50l .意义和反义引物序列为hpv16 E6-AAGGGCGTAACCGAAATCGGT -和-GTTTGCAGCTCTGTGCATA -,分别。同样意义上底漆用于HPV-18 E6。反义引物序列为HPV-18 E6-GTGTTCAGTTCCGTGCACA -。

描绘的反应受到使用GeneAmp PCR扩增PCR系统9700热循环(ABI)。PCR循环条件包括7分钟在96°C和1分钟在72°C,紧随其后的是35周期,包括变性步骤30年代在94°C,一个退火步骤在55°C 30年代和一个伸长的步骤在72°C 45 s。最后在72°C扩展步骤进行。为了避免假阳性和/或负面结果控制(没有模板DNA)和HPV阳性DNA样本都包括在内。

2.9。统计分析

选定的病人或肿瘤特征的数据,和急性毒性得到记录。综述了反应的患者数量和相应的百分比。比较反应者的数量根据生物标志物使用确切概率法进行。

总生存期(OS)测量从治疗开始到病人的死亡或持续接触。无进展生存(PFS)是衡量从治疗开始到验证疾病进展,死亡或持续接触。PFS的分析,死亡未经验证进程遇到的是事件。操作系统和PFS kaplan meier估计的方法。比较,是水平的意义。

3所示。结果

3.1。病人的依从性和毒性

完全,包括37例满足合格标准的回顾性分析。有27个男人和十个女人的平均年龄60年(表1)。35例患者(95%)CCRT完成。一个病人停止CCRT完成后6周由于三年级血小板减少症的治疗。一个病人,一位74岁的老人,有心绞痛病史的房颤和死于急性心肌梗死在沿第二周回顾临床数据的过程中,5例患者发现有3个月期间发布CCRT致命事件。更多的分析,患者于进步的疾病之一,而第二个病人,一个60岁的老男人一个不起眼的病史,从心脏骤停,CCRT一周后完成。解剖拒绝了他的亲戚。第三个病人,一个46岁的男人,死于大出血的aerodigestive卡车,11周CCRT。尸检表明致命事件是归因于对正确的梨状窦粘膜溃疡出血。没有证据表明肿瘤被发现。后者的病人,即使没有执行post CCRT扫描,被认为是目前分析应答器完成。 The fourth patient, a 60-year-old man, alcoholic and heavy smoker, was at the initiation of CCRT on treatment for pulmonary tuberculosis with isoniazid and rifambicin. He died 7 weeks post CCRT. Further medical information about the cause of death could not be obtained. The fifth patient, a 56-year old man with alcoholic cirrhosis died 12 weeks post CCRT from massive bleeding due to the rupture of esopharyngeal varices. The above patients were included in the analysis for response on an “intent to treat” basis. Severe side effects most commonly noticed were leukopenia (70%), dysphagia (62%), skin rash (65%), and anemia (51%) (Table2)。

3.2。应对CCRT和生存

完成CCRT后,反应是评估根据RECIST标准37例(图241)。6这些病人反应是评估的宠物。的病人,响应被归类为部分RECIST,虽然宠物免费的肿瘤,因此这个病人被认为是一个完整的响应器的总体响应的评估。在一个额外的情况下,反应是评估通过只宠物。

剩下的12 non-evaluable病人,一个没有CT检查,5例CT检查不能用于中央审查,而6例死在他们的反应评价。然而,对于后者的一个病人尸检了,没有证据表明肿瘤被发现。这个病人被认为是一个完整的应答。

总体而言,11例(30%,95%置信区间16% - -47%)实现CR和11(30%,95%置信区间16% - -47%)公关。稳定的疾病出现在3例(8%,95%置信区间2% - -22%)和进步疾病5例(14%,95%置信区间CI 5% - -29%)。一个病人的CT检查并不可用,因此没有评估响应。值得注意的是,在三个患者进行了摄影/ CT辐射公关,其中一个有一个消极的考试。因此,这个病人被认为是一个完整的响应者在最后的分析。考虑到一个没有证据表明肿瘤患者尸检,13个病人被认为是实现CR(35%, 95%置信区间8% - -52%)和10实现公关(27%,95%置信区间CI 14% - -44%)。

平均随访21.3个月后,15个患者PFS事件(10患者疾病进展和5死于其他原因),而总共9病人已经死了。一年期无进展,总体存活率是63%和80%,分别。

3.3。免疫化学和鱼

个人表皮生长因子受体、ERCC1、满足,,p-53包含IHC和鱼数据选择病人特点和反应在表3和4。总之,31个32肿瘤样本(97%)被发现表皮生长因子受体阳性,而在22(69%)表皮生长因子受体是过表达(数据样本2(一个)和2 (b))。之间没有联系表皮生长因子受体超表达和完整的反应被发现(9/22 CRs患者表皮生长因子受体超表达与2/10 CRs患者没有表皮生长因子受体超表达;)。一个样本EGFR放大(数据3(一个)和3 (b))。

ERCC1蛋白表达(数字2 (c)和2 (d)在27日33个肿瘤样本中(82%)。没有发现ERCC1表达和响应之间的联系(9/27 ERCC1积极患者反应者与2/6 ERCC1 -患者反应者;)。

遇到了蛋白表达(数字2 (e)和2 (f))在14个33个肿瘤样本中(42%)。大都会博物馆发现了蛋白质膜的不连续或完成染色和/或胞质染色。在少数情况下,内皮细胞间质血管显示轻度至中度的染色。之间没有联系了蛋白表达和完整的反应被发现(4/14完成救援人员遇到了积极的患者与7/19完成急救员遇到负面的患者;)。然而,当考虑到客观缓解(CR或公关),一个重要的协会是认同了蛋白表达(5/14反应者在遇到积极病人和15/19急救员遇到负面的患者;)。

遇到了基因在23日获得观察31例(74%)。更具体地说,低三染色体细胞中检测出16例,6例多体性较低,而高多染色体被确定在1例(数字3 (c)和3 (d))。基因状态不存在有关会见了响应(正常满足基因状态患者2反应者在8和9之间的反应患者23基因获得会面,)。

的蛋白质中检测出8检查30例(27%)。此外,22 - 5的情况下,p16是高度发育不良的鳞状上皮中表达。其中两个显示p16表达主要发育异常的上皮和分散小学位渗透性的肿瘤细胞。没有发现协会之间p16和hpv 16 ()。此外,p16没有发现相关的响应(4反应者在8阳性患者p16地位与7对22位患者的急救员- p16状态,)。

p-53蛋白被发现(图表示2 (g)和2 (h))在22个33例(67%)。无显著联系完成反应被发现(6/22完成p-53阳性患者反应者与5/11完成反应p-53阴性患者;)。

此外,没有明显的关联D7S486轨迹的状态(数据3 (e)和3 (f))和响应被确认。

3.4。表皮生长因子受体、ERCC1、MMP9 mRNA的表达

个人的表皮生长因子受体,ERCC1和MMP9 mRNA数据选择病人特点和响应提出了表3和4。为所有三个基因中值被用作一个预定义的截止以分类肿瘤高(中位数以上)或低(低于中位数)mRNA的表达。中值归一化表皮生长因子受体信使rna表达为34.9 (29.6 - -39.5)。表皮生长因子受体信使rna表达高,不存在与完整的响应(4/17完成反应患者表皮生长因子受体信使rna表达较低,与8/16完成反应患者高表皮生长因子受体信使rna表达;)。

同样,规范化ERCC1 mRNA表达中值为34.8(30.0 - -39.5),虽然没有高ERCC1 mRNA表达之间的联系和完整的响应被确认。具体地说,在组患者17低ERCC1 mRNA表达4病人实现一个完整的反应,与患者8完成反应者在16高ERCC1 mRNA表达()。

最后,规范化MMP9 mRNA表达中值为34.3 (29.5 - -39.5)。只有4的17名患者低MMP9 mRNA表达实现一个完整的响应,而8 16患者高MMP9 mRNA表达了一个完整的对治疗的反应()。尽管MMP9 mRNA表达不存在显著相关,完整的反应,一个重要的协会与客观缓解(CR或公关)被确定(6/17反应患者低MMP9 mRNA表达与14/16反应患者高MMP9 mRNA表达,)。

3.5。ERCC1、ERCC2 / XPD XRCC1基因多态性

等位型36例样本被认为,包括从肿瘤组织10只,3只从外周血(生殖系)和23个来自匹配外周血和肿瘤组织。等位基因组合的发病率在生殖系和肿瘤组织如表所示5,而个人数据ERCC1、ERCC2和XRCC1基因多态性在桌子上4。简而言之,杂合的多态等位基因都是常见的目标;关于纯合子的组合,C8092C是最频繁的ERCC1基因型,Asp312Asp和Lys751Lys ERCC2 / XPD Arg399Arg XRCC1。在2/10无与伦比的肿瘤组织样本,等位型数据可以获得ERCC1但不是ERCC2 XRCC1,可能由于FFPE DNA质量差。总的来说,等位变异的发生率在本研究按照以前的有关数据28]。

生殖系基因型并不总是匹配肿瘤基因型在同一个病人,推导出从高dct(5.8, 7.3,和7.9在3例)在各自的肿瘤样本或等位基因的扩增目标负的匹配外周血样本。肿瘤基因型的变化观察在反复测试与匹配4/23(17%)的患者外周血和肿瘤样本可供比较(表4)。生殖系heterozygocity被homozygocity取代在一个案例中罕见的一个/一个等位基因的ERCC1 C8092A / CD3EAP Q504K,表明赖氨酸/ CD3EAP赖氨酸的基因型的肿瘤。在两个额外的情况下,生殖系由G / G / G取代ercc2 - 312 (Asn变化/ Asp为Asp / Asp在肿瘤)。在另一起案件中,生殖系ercc2 - 312 Asp / Asp(没有放大Asn目标)取代Asn / Asp (dCt = 1.1)匹配的肿瘤组织。

3.6。突变分析

只有一个患者体细胞表皮生长因子受体突变的外显子20,D770insGF插入。没有发现患者的kRAS基因密码子突变12/13。此外,没有一个病人认同L858R EGFR突变或密码子19删除方法。

3.7。人乳头状瘤病毒检测

我们检查了hpv 16和18 E6 PCR在30个病人。完全,6 30样品(20%)检测hpv 16是积极的(一个喉,3口腔和2口咽肿瘤)。所有样本被证明是HPV-18负面的。有趣的是,4 6 hpv 16阳性患者,要可评价的响应,实现了CR CCRT。

4所示。讨论

本报告描述了我们的集体经验CCRT头颈部鳞状细胞癌局部晚期患者。在这种异构的CR率组患者为35%。此外,10位病人(27%)被认为是一个公关。有趣的是,一个病人与公关有消极的正/ CT CCRT完成后,被认为是CR。众所周知,评估应对chemo-radiotherapy头颈部鳞状细胞癌患者是不准确的,因为很多人认为放射科医生局部反应,由于治疗后的剩余异常CT扫描。在过去的几年中FDG PET / CT扫描被越来越多地用于头颈部鳞状细胞癌的肿瘤反应初始阶段和评估(49]。一些调查表明,正/ CT可以更准确地预测缺乏残留病在主站点和颈部(100%,阴性预测值敏感性100%,特异性96%)(50,51),因此被认为是一个有价值的以及头颈部鳞状细胞癌的临床工具的管理。

临床资料的回顾表明,治疗的依从性是可行的,病人是令人满意的,因为除了两个完成了rt,众所周知,大多数属于低社会经济地位,头颈部鳞状细胞癌患者是酒鬼,重度吸烟者,承受严重的并发症。此外,chemo-radiotherapy的严重不良后遗症,如脱水、感染、营养不良、过度减肥恶化他们的一般健康状况和可能导致致命的事件。意想不到的严重不良事件的发生率高,包括致命的事件,被费等。52]在第二阶段的研究,证实了在我们的头颈部鳞状细胞癌没有人口的回顾性分析。这些病人应该被密切监视CCRT后立即CCRT和期间。

发现治疗的预测因素,如RT与西妥昔单抗,是至关重要的,因为这个方案正在成为头颈部鳞状细胞癌患者的新标准。不幸的是,到目前为止这种分子的识别预测仍然是难以捉摸的。在目前的分析,我们评估的潜在关联EGFR,满足,CCRT ERCC1、MMP9反应。

尽管据报道高EGFR蛋白表达预测增加治疗头颈部鳞状细胞癌患者的肿瘤反应与常规分离(9)或加速(53,54RT,这个发现患者的随机研究中尚未得到证实与吉非替尼治疗头颈部鳞状细胞癌复发和/或转移(55]或顺铂和西妥昔单抗(56]。与预期相反,低到中度患者EGFR蛋白表达表现出更高的反应率顺铂和西妥昔单抗的结合比EGFR高表达。在我们的回顾性分析,我们无法找到一个CCRT EGFR蛋白表达之间的相关性和响应。

我们也评估了表皮生长因子受体基因拷贝数的鱼。我们发现,在大多数肿瘤的表皮生长因子受体多染色体而不是放大很明显;然而,它并不与响应。这些与其他试验结果一致,表明EGFR放大的患病率较低[头颈部鳞状细胞癌57,58)和表皮生长因子受体基因拷贝数不与头颈部鳞状细胞癌患者复发性/转移性肿瘤反应,但对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)埃罗替尼、吉非替尼59,60]。据报道,在nonsmall细胞性肺癌(NSCLC)、表皮生长因子受体酪氨酸激酶域内的突变,主要在外显子18、19和21,赋予敏感性TKIs (61年]。然而,这种突变在头颈部罕见,从1%到7%不等的白种人/白人和亚洲患者,分别为(60,62年,63年]。134年的一项研究,肿瘤、头颈部鳞状细胞癌DNA直接测序不能识别任何突变(58]。符合这些发现,我们对EGFR外显子的突变筛选肿瘤31日18日19和21只能够识别一个病人窝藏一个EGFR突变。显然,由于发病率非常低,表皮生长因子受体突变不能作为预测响应anti-EGFR头颈部鳞状细胞癌治疗。

显然,还需要进一步的研究来全面阐明敏感性和耐药性的机制西妥昔单抗或EGFR TKIs。有可能是其他因素在EGFR通路下游的相互作用和/或EGFR通路与其他激活途径更重要比单纯的表皮生长因子受体在调节反应anti-EGFR治疗。

此外,我们评估由包含IHC蛋白表达和基因拷贝数的鱼。据我们所知,这是第一个研究试图联系会见了响应与顺铂相伴RT和西妥昔单抗。遇见蛋白表达是在14 33的肿瘤研究和基因放大5的病人。看来,在非小细胞肺癌(64年,65年),满足基因扩增和头颈部鳞状细胞癌是一种罕见的事件与应对CCRT无关。

有趣的是,目前的回顾性分析是一个很少有研究调查潜在的关联ERCC1蛋白表达和应对CCRT头颈部鳞状细胞癌患者。这是值得注意的,这些知识对于头颈部鳞状细胞癌中ERCC1的作用是非常有限的。最近,Handra-Luca et al。66年)报道,低ERCC1蛋白表达与更高的肿瘤反应率(分别为79%和56%,)和降低癌症特异性死亡的风险(风险比0.42,)治疗头颈部鳞状细胞癌患者cisplatin-based诱导化疗。然而,这种积极的协会没有确认类似的研究最近由我们组(67年),在目前的分析。造成这种差距的原因,关于ERCC1的预测作用,尚不清楚。小样本大小,不同的治疗方案,缺乏标准化IHC方法评估ERCC1蛋白表达,和病人的差异特征,也许几个阶段,肿瘤位置,但肯定不是唯一因素相互矛盾的结果负责。

目前的回顾性分析的一个重要发现是,高MMP9 mRNA表达,评估kRT-PCR,明显与客观的反应。之间的正相关性一直观察MMP9 mRNA表达水平以及头颈部鳞状细胞癌的转移性传播肿瘤(68年]。过度监管MMP9在某种程度上可能是通过核因子k B (NF-kB) [69年]。此外,人类乳头瘤病毒感染引起的炎症过程可能激活基质金属蛋白酶,进而解放表皮生长因子受体配体的细胞外基质,从而促进HNSCC肿瘤恶化通过增加表皮生长因子受体信号。因此,看来,MMP9积极对EGFR抑制肿瘤可能尤其敏感。这个概念是完全同意与我们发现高MMP9 mRNA表达明显相关的目标包含化疗对西妥昔单抗。然而,需要进一步分析noncetuximab头颈部鳞状细胞癌治疗的患者,评估是否MMP9可能是一个“可怜的预后标记”转到“改进反应标记”的西妥昔单抗RT或CCRT。

关于四个常见多态的研究网站ERCC1、ERCC2 / XPD XRCC1,有意思的是识别不整合肿瘤组织/外周血基因型。这可能是值得考虑当评估多态性预测标记肿瘤预后/,因为大多数这样的可用数据,包括切除修复基因多态性,源自决定在外周血DNA(生殖)28,45,70年]。减少一个等位基因的存在显示的实时PCR、不和谐的基因型在3 4例可能对应的杂合性丢失(LOH)相应等位基因的肿瘤。可以推断在LOH SNP-genotyping [71年]。这一发现需要进一步验证,其生物的影响,如果有的话,目前未知,因为LOH ERCC1头颈部鳞状细胞癌和ERCC2 / XPD尚未研究。LOH似乎并不是一个共同的或重大事件在结直肠致癌作用72年]。然而,其他比之前报道的28),我们没有观察到肿瘤切除修复基因多态性与病人的结果,可能是由于小样本大小,而调查ERCC1的多态性不是与相应的mRNA和蛋白表达有关。

重要的是这是第一次报告的敏感性,头颈部鳞状细胞癌HPV-associated cetuximab-containing CCRT。有大量的分子证据表明人乳头状瘤病毒(主要是HPV 16和HPV-18)中发挥着重要作用,特别是头颈部鳞状细胞癌的发病机理的口咽肿瘤73年,74年]。hpv 16在头颈部的最普遍的基因型,占阳性病例的90%以上(75年]。我们通过PCR评估人乳头状瘤病毒的存在,因为这个检测方法可能比其他方法更敏感,如原位杂交(76年]。人乳头状瘤病毒的出现的频率,主要HPV 16基因型,在希腊口咽或喉癌患者是43%和40%,分别为(77年,78年]。最后有一些证据表明,头颈部鳞状细胞癌HPV-associated HPV-negative患者头颈部鳞状细胞癌预后比,可能是因为增强radio-sensitivity或缺乏专业癌化(79年]。这些数据完全根据我们的研究发现,在这只hpv16 DNA检测在6(20%)的患者。值得注意的是,4这些患者可评价的反应和他们所有人证明了CR CCRT完成后。观察到的高响应性的患有乳腺癌患者可能是由于MMP9的激活。所有4以上的患者表现出一个CR高MMP9 mRNA的表达。激活MMP9可以从细胞外基质解放表皮生长因子受体配体,从而促进HNSCC肿瘤恶化通过增加表皮生长因子受体信号。MMP9阳性肿瘤可能因此,正如前面所讨论的,特别敏感和西妥昔单抗EGFR抑制。

p16过度报道与hpv 16的存在无关,与先前的研究[80年,81年]。正如前面所示的,p16超表达不仅限于hpv 16阳性病例(82年),因为少量的例HPV -基因型显示很高的p16的表达。此外,发现hpv 16 - p16超表达的肿瘤可能oncogene-driven细胞衰老的结果或感染其他病毒,抑制视网膜母细胞瘤蛋白表达(38]。以上结合少量的p16阳性病例可以解释缺乏联系和hpv 16积极性公布在我们的研究中。然而,其他因素,如不同的抗体特异性和免疫组织化学的局限性和PCR检测不能排除在外。

所示与非小细胞肺癌患者,患者在结直肠或胰腺癌anti-EGFR靶向治疗了(83年),有一个小组特别受益于这种治疗方法的患者,也就是说,那些发展典型acne-like或斑丘疹的皮疹(57]。在目前的分析,皮疹的年级是没有找到与应对CCRT有关。同样,缺乏相关性的发展皮疹和响应在另外两个研究报道了西妥昔单抗的患者复发性/[头颈部鳞状细胞癌转移性84年,85年]。然而,在这些研究中,皮疹是生存的预测和在其中的一个84年)时间(TTP)进展,。是否发现皮疹与TTP显著相关或与再后续生存仍有待观察。值得注意的是,没有一个病人停止CCRT由于严重RT-induced皮炎,也偶尔被报道治疗头颈部鳞状细胞癌患者的RT与西妥昔单抗(86年]。然而,密集的治疗应该由有经验的皮肤科医生提供给病人,因为在一些情况下有一个相当大的二次皮肤感染的风险。

总之,似乎从目前的回顾性分析,CCRT头颈部鳞状细胞癌局部晚期患者是可行的。然而,非常严重的并发症,患者需要密切监测CCRT和3个月后治疗期间,因为这样的病人死于:相关原因的高风险。的状态中所有基因进行分析,除了MMP9,不是CCRT的预测价值。高MMP9 mRNA表达,评估kRT-PCR,被发现与客观反应显著相关。看来MMP9可能与西妥昔单抗治疗的患者头颈部鳞状细胞癌的预测价值。然而,它必须记住,鉴于目前的回顾性本质分析和相对较少的患者,选择性偏差不能被排除在外。因此,我们的研究结果应该被认为是确定的,而是假设产生未来的前瞻性试验。

确认

作者要感谢格鲁吉亚Vourli,理学,统计分析,玛丽亚女士Moschoni协调数据管理、塔利亚女士Spinari协调肿瘤组织集合(所有HeCOG数据办公室,雅典),索菲娅Chrisafi,博士,优秀的技术援助,斯特拉女士Dallidou秘书协助。转化研究支持了HeCOG研究格兰特:他R5A / 06。

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