胸腺素的潜在作用1为胶质母细胞瘤辅助治疗

文摘

恶性胶质瘤是高档,中枢神经系统恶性肿瘤,确诊后的12个月内几乎总是致命的。免疫疗法使用促炎细胞因子如或白介素- 2可以延长生存与胶质母细胞瘤。胸腺素-1 (Talpha1)是一个增加胸腺激素和immunemodulator - 2生产和t细胞增殖。我们检查治疗的潜在影响Talpha1在实验体内胶质母细胞瘤,Talpha1特征的体外抗肿瘤效果。Rar 9 l细胞()被植入右额叶的成年老鼠长埃文斯随后处理车辆,BCNU Talpha1或Talpha1 + BCNU从术后一天6。Talpha1 + BCNU显著降低肿瘤负担,提高治愈率。体外实验表明,Talpha1没有直接影响生存能力和线粒体功能,相反,它增加pro-apoptosis基因的表达,包括FasL FasR和肿瘤坏死因子r1(65.89%、44.08%和22.18%,分别地。),并增加9 l细胞对氧化应激的敏感性。此外,Talpha1增强9 l细胞敏感性Granzyme B -和BCNU-mediated杀人。研究结果表明Talpha1提高根除BCNUmediated恶性胶质瘤的体内,这Talpha1介导其影响通过激活pro-apoptosis机制,使肿瘤细胞更敏感的氧化应激和免疫介导杀死Granzyme B和化疗药物。

1。介绍

胶质母细胞瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤在成人中,占近75%的情况下。尽管稳步推进治疗由于改善神经成像,显微手术,恶性胶质瘤和辐射,仍无法治愈的(1- - - - - -5]。平均存活率不到一年从诊断、积极治疗后的5年生存率包括肿瘤切除总值小于10% (1,6- - - - - -8]。件导致死亡由于快速、积极和渗透性的增长,使得肿瘤不可切除的托托。其他问题加剧恶性胶质瘤治疗和治疗是相对耐放疗和化疗(1,2,6- - - - - -9),宿主免疫反应的肿瘤可能是无效的甚至根除人口较少常规治疗包括手术后的肿瘤细胞(10- - - - - -12]。

恶性神经胶质瘤细胞可以逃避检测通过宿主的免疫系统产生免疫抑制肽,扩散等影响t细胞功能和生产[- 210]。中枢神经系统也有些免疫特权,导致恶性肿瘤细胞的无限制的增长。招聘免疫治疗或治疗的免疫系统杀死恶性肿瘤细胞已经在许多研究模型。胸腺素分数5 (TF5),胸腺素-α1 (Talpha1 / thymalfasin)、干扰素-α,是许多相关的几种组件- 2研究了抗恶性肿瘤的能力。Talpha1 28-amino酸肽,一种合成的一种天然激素循环在胸腺(13- - - - - -15]。Talpha1胸腺肽激素刺激胸腺细胞生长和分化,2,T细胞受体- 2,干扰素-γ和干扰素-α(16- - - - - -26]。Talpha1被用于临床试验治疗乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染(13,27- - - - - -34),恶性肿瘤(14,15,35)、巨细胞病毒感染肾移植后(36],和艾滋病[13]。这些调查的有前景的结果,结合t细胞反应降低到恶性胶质瘤的证据,导致目前的工作评估的潜在治疗受益Talpha1免疫疗法治疗恶性神经胶质瘤,并确定Talpha1的机制发挥其抗肿瘤的效果。

2。实验设计

2.1。体内研究

实验是为了确定Talpha1交付单独或结合Bischloroethylnitrosourea (BCNU)可以显著减少胶质母细胞瘤的负担而BCNU单独治疗。体内实验使用一个模型生成的胶质母细胞瘤在成人(250 - 300克)长埃文斯老鼠。老鼠与单个腹腔内注射麻醉100毫克/公斤甲苯噻嗪和15毫克/公斤氯胺酮在14.2%乙醇。深麻醉下,头被剃准备和聚维酮碘和老鼠安全地放置在一个立体定位框架。中线切口毛刺是和一个3毫米孔钻在正确的额叶。汉密尔顿注射器配有26-gauge针固定在磨孔的中心。针被注射的深度3.5毫米细胞体积的2l .去除针后,伤口用无菌盐水洗,皮肤与self-resorbing缝合关闭。老鼠回到笼子里,观察到任何恶化的迹象包括减轻体重、减少食物和水的摄入量,偏瘫、癫痫、或不活动。经验的研究表明,颅内注射10000 9 l细胞杀死100%的老鼠在21天内植入。这些研究被寿命/批准的罗德岛州医院IACUC动物保健和使用委员会。应该注意的是,寿命/罗德岛医院IACUC动物保健和使用委员会指导原则不允许动物死于疾病的实验。因此,生存研究无法执行,相反,老鼠牺牲在预先确定的时间间隔来评估肿瘤负荷。

老鼠从美国获得9 l胶质母细胞瘤细胞类型文化集合(华盛顿特区)和认证为无菌。细胞被维护在杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)补充heat-inactivated 5%胎牛血清(FCS), 2毫米谷氨酰胺,100M不必要的氨基酸(Gibco-BRL,宏伟的岛,纽约)。抗生素没有添加到培养基中。注入之前,细胞与磷酸盐(PBS)冲洗,脱离文化的表面和分离成单个细胞用0.25%胰蛋白酶/ 0.05% EDTA悬浮液。分离细胞在无血清DMEM洗3次,最后悬浮在无血清DMEM密度可行的细胞/毫升。活细胞密度决定用台盼蓝排斥和血细胞计数器室。

老鼠被分为6组,所有的治疗方法都给出或发起颅内9 l细胞接种后6天。组如下:车辆控制;低剂量(45克/公斤;)Talpha1;高剂量(200克/公斤;)Talpha1;低剂量Talpha1 + BCNU;高剂量Talpha1 + BCNU;BCNU只。BCNU(4.4毫克/公斤)管理作为一个单独的腹腔内注射(i.p)。指定Talpha1有连续3天的剂量腹腔注射。人类重组Talpha1用于这些实验。先前的研究表明显著immuno-modulating影响人类Talpha1老鼠细胞,在体内和体外37]。实验中使用了两种不同的终止点,每天17和21后9 l细胞接种。老鼠被ip牺牲注射戊巴比妥钠120毫克/公斤。大脑被收获,分段浸固定在Histochoice (Amresco有限公司,梭伦,俄亥俄州),和加工生成苏木精和伊红染色石蜡包埋部分评估组织病理学。

2.2。体外研究

2.2.1。细胞系和Talpha1治疗

评估影响Talpha1可行性,线粒体功能,和蛋白表达,9 l细胞被播种到96孔板的密度细胞每口井。为了演示Talpha1辅助细胞死亡机制,采用现有的肿瘤细胞系而非原发性脑瘤,因为所有化验和一致性在每个实验是必要的。此外,9 l细胞用于体内实验中,它是重要的理解Talpha1治疗促进大脑的抑制肿瘤的生长。一夜之间依恋和增长后,细胞暴露在10⁵M Talpha1 24小时,然后评估可行性或基因表达。研究慢性Talpha1治疗的影响,细胞在75毫米种子²烧瓶暴露在连续3日常治疗的10⁵M Talpha1(加入新鲜培养基),之后,这些细胞被使胰蛋白酶化然后到96孔板的密度可行的细胞每口井。24小时后进一步Talpha1治疗,细胞被评估可行性或基因表达。Talpha1的最佳浓度是确定从最初dose-toxicity研究9 l细胞和postmitotic主要鼠皮质神经元文化不同浓度处理的Talpha1从10 nM 50m .初级皮层神经元文化进行了研究,使选择Talpha1剂量,不会有毒非肿瘤的脑细胞。细胞生存能力和线粒体功能测定用结晶紫(CV)和MTT分析法,分别从先前的研究表明,简历和MTT吸光度线性与细胞密度增加来每口井的细胞(38- - - - - -40]。研究扩展到确定Talpha1治疗增加细胞对氧化应激的敏感性或BCNU暴露Talpha1-treated细胞H₂O₂(100米)或BCNU (25米)24小时,评估可行性和使用简历和MTT检测线粒体功能。

2.2.2。定向运动分析

定向运动测量使用Boyden箱内文化插入8米孔膜(41]。钱伯斯是坐在24-well盘子。10⁵可行的细胞在无血清培养基放入参议院。中补充1% FCS放置在远低于提供营养刺激迁移。迁移被允许进行4小时。ATPLite(帕卡德仪器公司,梅里登,CT)被用来量化可行的细胞密度的上表面膜(不动的),下面的膜附着力(迁移),和底部的迁移,不依从。简而言之,不动的细胞从膜的上表面使用棉签。细胞被立即淹没拭子细胞溶解到200年L的ATP溶解稀释溶液的黑色96 -微型板块。完整性的显微镜下细胞收获监控。细胞附着的底面膜被淹没收获和细胞溶解在200年被膜L ATP溶解稀释溶液在第二个黑色微型板块。细胞远低于文化插入resuspended和直接添加到25L(未稀释的ATP溶解溶液在第三个黑色微型板块。与搅拌5分钟后孵化,确保完整的细胞裂解,ATPLite衬底(25L)被添加到每个。2分钟的反应是混合搅拌温柔的平台。随后,盘子是暗适应5分钟然后发光测量TopCount标(帕卡德仪器公司,梅里登,CT)。运动型附着的百分比,能动的不依从,能动的细胞总数计算每室(41]。对于每一个实验,复制4 - 6进行了化验,结果统计分析。在初步研究中,我们表明,ATPLite发光10之间的线性增长细胞数量³和细胞,所表示的制造商。

2.2.3。微量滴定采用ELISA(老鼠)测定

老鼠试验是一种快速、敏感的量化方法在96 -小文化区和免疫反应性结合了酶联免疫吸附试验的优点和采用原位染色允许敏感蛋白表达的量化值归一化细胞密度(38]。短暂,固定细胞permeabilized Tris-buffered皂素0.05%生理盐水(50毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5,0.9%氯化钠;TBS),阻止Superblock-TBS(皮尔斯,罗克福德,IL),然后孵化一夜之间在4°C主要抗体增殖细胞核抗原(PCNA)、bcl - 2, p21 / Wwaf-1 p53, FasL, FasR, TNF-R1,或GAPDH,每个稀释到0.5 1毫克/毫升TBS Tween-20包含0.05%和0.5%牛血清白蛋白(TBST-BSA)。免疫反应性检测用辣根过氧化物酶共轭二次抗体(皮尔斯,罗克福德,IL)和三甲可溶性底物(皮尔斯,罗克福德,IL)。反应是停在1 M H₂所以₄和吸光度测量在450 nm Spectracount标(帕卡德仪器有限公司,梅里登,CT)。随后,细胞密度是衡量与Coomassie蓝色染料染色细胞附着和筛选了染料的吸光度测量38]。指数计算的老鼠比三甲和Coomassie蓝色吸光度测量相同的文化。均值±。爱的结果来自16个复制文化井用于群际统计比较。

2.2.4。Granzyme-B实验

T细胞和自然杀伤(NK)细胞利用两个主要的细胞毒性通路包括perforin-granzyme-mediated坏死和肿瘤坏死因子(TNF)家庭ligand-mediated凋亡[42- - - - - -48]。以确定Talpha1是介导的抗肿瘤的效应通过穿孔素/ Granzyme B-induced杀戮,我们采用新颖的体外试验量化Granzyme B-mediated杀死没有要求添加特征明显,激活细胞毒性T细胞和NK细胞。为此,9 l细胞第一次接受Talpha1或车辆24小时,之后他们收获,受移植者进入96 -黑色板(细胞/ 75信用证),暴露于20000单位/毫升链球菌溶血素O物资货柜+ 100 ng重组Granzyme B(反应卷100L) 1或3小时。穿孔素的SLO是用来代替permeabilize细胞(49),重组Granzyme B被用来规范分析。控制研究包括平行反应,SLO Granzyme B,或两者都被省略了。活细胞密度测量使用ATPlite化验(帕卡德仪器公司,梅里登,CT),具有广泛的线性动态范围之间关联相对光单位细胞密度10³到10⁶细胞每文化。

2.2.5。试剂的来源

重组体人Talpha1提供从Sciclone作为礼物,Inc .(旧金山,CA)。单克隆抗体PCNA、p53、bcl - 2, FasR, FasL, TNF-R1, p21和购买从圣克鲁斯生物技术,Inc .(圣克鲁斯,CA)和单克隆抗体glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)从Chemicon购买国际有限公司(泰梅库拉,CA)。Granzyme B是来自CalBiochem (CA)卡尔斯巴德。链球菌溶血素O从Sigma-Aldrich购买,圣路易斯,密苏里州。

2.2.6款。统计分析

数据图表中所示表示均值±。爱的结果。组间比较用学生的以及方差分析和费舍尔或者至少意义事后意义测试使用统计人员统计系统(杰里·l . Hintze Kaysville, UT)。

3所示。结果

3.1。胶质母细胞瘤模型

颅内接种的成年老鼠长埃文斯10000 9 l鼠胶质母细胞瘤细胞不断产生肿瘤逐渐增大,造成在21天内死亡。在未经治疗的老鼠,肿瘤生长的时间进程和相关的临床症状特点如下:(1)增加身体活动在第七天与肿瘤直径4 - 5毫米;(2)第14天高反应性的肿瘤直径的7 - 8毫米和频繁的关联intratumor出血;(3)嗜睡的肿块伴有脑疝白天21 - 10 - 12毫米。组织学部分与苏木精和伊红染色证实大肿瘤的存在渗透性的恶性肿瘤细胞组成的群众。组织病理学研究日冕部分在整个大脑在第一个24小时内接种证明,没有严重可见肿瘤可以被检测出来。然而,5天之后,9 l细胞已经形成小肿块,局部表面的皮层和上覆软脑膜。在10天内,肿瘤扩展到更深层次的结构包括基底神经节和侧脑室的墙壁和与中度水肿有关,但没有形成疝(中线结构的转变)。第14天,发现肿块扩展深入大脑半球内占据近50%的横截面积的部分相关的水肿和早期的突出。尽管大尺寸,肿瘤质量和脑实质之间的界定仍然锋利。 By day 21 or 22, the tumor masses occupied nearly the entire right frontal lobe with variable degrees of extension to the contra-lateral hemisphere. The extensive tumor mass was associated with marked cerebral edema, hemorrhage, and herniation.

3.2。影响Talpha1和BCNU胶质母细胞瘤增长(图1)

半定量的组织学分级量表是用来评估肿瘤负荷组间比较:0:没有残余肿瘤;1:显微镜下肿瘤局限于表面的皮层;2:肿瘤质量占据不到25%的半球截面;3:肿瘤质量占据高达50%的半球截面和扩展到深层结构;4:大规模与参与的50 - 90%的肿瘤负荷侧半球截面与跨中线肿瘤扩展到对侧半球。的部分被调查人员的两个同时编码和分级(SMD和)治疗组没有知识。验证评分的一致性,所有样本和rereviewed代码。

自自发肿瘤拒绝的初步研究中,并未观察到,所有实验都是在天17日或21日终止后9 l细胞植入。代表的数据从一个实验(重复三次)如图3。使用标准化的分级方案评估肿瘤负荷,我们表明,100%的vehicle-treated老鼠白天4级肿瘤负担(图171),类似于没有治疗的影响(数据没有显示)。相比之下,老鼠接受BCNU表现出显著减少肿瘤相对于vehicle-treated质量控制。17天,肿瘤负荷在75%,二年级和三年级在那些只接受BCNU的25%;而在21天,25%的集团都有成绩4或2肿瘤负荷,和50%的三年级肿瘤负担。从本质上讲,BCNU的有效性与近一半的非均匀组织展现没有明显的治疗反应,而另一半的预期肿瘤负担相对于控制减少了50%。只有在小白鼠身上Talpha1有肿瘤生长和临床恶化率相似的控制(数据未显示)。此外,在小白鼠身上只有45克/公斤和200Talpha1 g / kg剂量,临床过程是由极端复杂颅内肿胀以及突出的显著更大程度的脑组织(突出通过磨孔)相比,所有其他组织。同样,在老鼠接受BCNU + 200克/公斤Talpha1,显著度引起的脑肿胀增加发病率和死亡率。因此,研究使用Talpha1单独或200克/公斤Talpha1 + BCNU被迫中止。值得注意的是,45克/公斤Talpha1 + BCNU组显著降低意味着肿瘤负担相对于vehicle-treated BCNU-treated老鼠,17和21天时间点(;参见图1)。17天,44.4%的情况下表现出2级肿瘤负担,33.3% 1级,22.2%被治愈。21天,20%有三级肿瘤负担,40%有2级肿瘤负担,有1级肿瘤负担13.3%,26%是治愈。治愈率老鼠中对待Talpha1 + BCNU被明显高于其他组。

组织病理学的研究被用来评估BCNU的影响和Talpha1 + BCNU体内肿瘤的生长。vehicle-treated控制老鼠的肿瘤增长与人口细胞肿瘤病灶的自发的坏死,频繁的有丝分裂,著名核多型现象(细胞大小和形状变化),和不规则渗透边界(数据没有显示)。BCNU-treated老鼠肿瘤的生长,减少肿瘤坏死的组织病理学研究显示大疫源地伴随单核巨噬细胞和淋巴细胞组成的炎性细胞浸润。老鼠接受45毫克/公斤Talpha1 + BCNU,显著降低肿瘤负荷是大片的空洞的坏死和附带的单核巨噬细胞和淋巴细胞组成的炎性细胞浸润。在没有残余肿瘤被发现的情况下,只有小疤痕或蛀牙前肿瘤的位置。

3.3。9日Talpha1 l细胞生存能力的影响

体外实验来确定体内Talpha1对9 l胶质母细胞瘤细胞生长的影响被直接细胞毒性动作或间接介导机制。进行这些研究9 l细胞被播种在96孔板和暴露于Talpha1 24小时,之后分析了文化对使用结晶紫分析可行性,并用MTT测定线粒体功能。线粒体功能测量因为细胞死亡可以由线粒体功能障碍而不是细胞凋亡或坏死。虽然轻微减少可行性存在剂量依赖的相关性和MTT观察活动,整个细胞毒性的影响Talpha1相对温和(图2(一个))。类似的结果对初级皮层神经元文化(图2 (b)),以及其他细胞系,其中包括293名肾细胞和SH-Sy5y神经母细胞瘤细胞(数据没有显示)。值得注意的是最高浓度的Talpha1用于体外实验(50毫米),产生的平均水平下降20%生存能力和线粒体功能,几乎高出1000倍的剂量用于体内实验观察肿瘤负担大幅减少。这些结果表明,Talpha1并不直接对9 l胶质母细胞瘤细胞的细胞毒性的影响,而其他因素导致了辅助治疗效果观察到体内。

3.4。研究Talpha1对9 l细胞活性的影响

定向运动分析是用来确定Talpha1的生长抑制作用被降低细胞介导的能动性和侵袭性。ATP-Luminescence-based蠕动试验使量化迁移细胞总数的百分比,以及迁移的粘附和迁移的百分比不依从的亚种。治疗Talpha1不会大幅改变9 l细胞运动性或粘性(migrated-adherent细胞百分比(图)2 (c))。同样,在293年进一步研究使用人类肾脏或人类SH-Sy5y神经母细胞瘤细胞,Talpha1治疗被发现没有显著影响定向运动性或细胞粘附(数据没有显示)。因此,它不太可能降低肿瘤质量Talpha1-treated老鼠是由于抑制肿瘤细胞迁移、粘附或侵入性增长。

3.5。在Proapoptosis和Prosurvival Talpha1基因表达的影响

自从Talpha1没有直接细胞毒性影响,我们探索其他潜在机制Talpha1可能功能抑制恶性胶质瘤的生长。在这方面,我们对基因产物的表达,促进细胞凋亡或细胞生存,和评估管家基因表达控制。在96 -孔板进行了研究使用微量滴定采用ELISA(老鼠)测定生成数据从多个复制的文化。Talpha1治疗24小时导致显著增加FasR水平(44.1%),FasL(65.9%),和TNF-R1(22.2%)相对于vehicle-treated控件(;参见图3)。相反,bcl - 2的表达水平,p21 / waf1 p53,增殖细胞核抗原(PCNA)和glyceraldehy-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)没有显著影响Talpha1治疗。相似的研究表现与人类293年肾或SH-Sy5y bcl - 2神经母细胞瘤细胞表现出显著减少(42%和36.7%,分别地;),但在FasR的水平没有显著变化,FasL或TNF-R1表达式(数据未显示)。

3.6。Talpha1增加9 l细胞对氧化应激的敏感性和BCNU治疗

proapoptosis机制的激活或抑制的生存途径可以增加细胞氧化应激和细胞毒性药物的敏感性。因此,研究了确定Talpha1-treated细胞呈现更敏感BCNU氧化应激或杀害。细胞治疗H。100毫米₂O₂或10毫米Talpha1表现出相似的生存能力相对于平均水平vehicle-treated控制细胞(图4)。治疗BCNU单独导致28%的细胞损失相对于控制。预处理与Talpha1 24小时导致显著降低生存文化,随后被暴露于次致死量(100毫米)的H₂O₂ 文化,大大增强细胞损失处理Talpha1 + BCNU BCNU只处理与文化(即H₂O₂、Talpha1或车辆(图4)。类似的结果使用293或C6神经胶质瘤细胞的目标分析(数据没有显示)。

3.7。Talpha1增加9 l细胞敏感性Granzyme B-Mediated杀人

体内恶性肿瘤细胞被招募的细胞毒性T细胞和巨噬细胞炎性因子和白介素- 2等。细胞毒性T细胞杀死通过释放穿孔素,在靶细胞膜产生漏洞,和Granzyme B,导致酶的破坏和目标细胞的死亡。研究Talpha1的潜在作用增强T细胞介导杀害9 l胶质母细胞瘤细胞,我们构造了一个体外测定Talpha1——或者vehicle-treated 9 l细胞孵化Granzyme B存在与否的链球菌溶血素O (permeabilizing代理)1到3个小时。生存能力是衡量使用ATP发光分析和组内比较是确定相对与SLO + Granzyme B治疗相关死亡。研究证明细胞生存能力显著减少Talpha1-treated文化受到SLO + Granzyme B相对于Talpha1-treated文化接触SLO Granzyme B,或车辆(;图5)。此外,Granzyme B-mediated杀死大幅进步,随着时间的推移更大程度的细胞损失相比,3小时后观察到化验执行0.1 -或1小时孵化(图5)。此外,3小时后的孵化、文化对待Talpha1 + Granzyme B也降低了生存能力相对于控制,表明适度放缓(效率低)细胞进入没有SLO Granzyme B。

4所示。讨论

件非常激进的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,杀死大脑实质和大众的广泛渗透效果。尽管一些进步在理解这些肿瘤的分子遗传学和设计新颖的治疗方法,实现有效的疾病控制或治愈的主要障碍是普遍低迷宿主对肿瘤细胞的免疫反应。由于其渗透性的增长模式,它可能永远无法达到总治疗恶性胶质瘤的手术切除,因此必须利用其他方法。然而,即使应用大剂量化疗或放疗,主机响应是至关重要的清除杂物和消除小剩余的数量和新产生的肿瘤细胞。恶性胶质瘤,次优的功能效应的手臂可能占明显成功后的重复和快速复发肿瘤治疗。在这方面,最近的证据表明,免疫调制器疗法可以延长生存和促进胶质母细胞瘤杀死体内。

Talpha1(胸腺素-α1)是一种28-amino酸肽代表一种合成的循环中含有的一种天然化合物(14,15]。Talpha1刺激胸腺细胞生长和分化,2,t细胞受体- 2,干扰素-γ和干扰素-α(16- - - - - -24,26,50]。Talpha1被用于临床试验,治疗乙肝和丙肝感染(13,27- - - - - -33),头颈癌,肺癌和恶性黑色素瘤14,15,35)、巨细胞病毒感染肾移植后(36],和艾滋病[13]。这些临床调查的有前景的结果,结合t细胞反应降低到恶性胶质瘤的证据,导致目前的工作评估的潜在治疗受益Talpha1免疫疗法治疗恶性神经胶质瘤和确定Talpha1的机制发挥其抗肿瘤的效果。进一步兴趣的潜在辅助使用Talpha1治疗恶性神经胶质瘤源于它所代表的事实(1)的合成纯化版本从内部产生的化合物,因此临床毒性最小的证据可以找到人类;(2)以前独立工作证明Talpha1刺激促炎细胞因子的生产(17- - - - - -22,26,50- - - - - -55],它提供了一个治疗效益放缓实验恶性胶质肿瘤的进展。

恶性胶质瘤的体内使用一个实验模型研究表明,虽然BCNU治疗显著降低肿瘤负荷,响应与几个异构情况下表现出没有可检测效果相对于vehicle-treated控制。然而,治疗Talpha1 + BCNU提供显著的疗效都对减少意味着肿瘤负荷和治疗肿瘤在大约25%的情况下。Talpha1 + BCNU-mediated减少肿瘤负荷是增加肿瘤细胞坏死伴有lympho-mononuclear内细胞浸润和大脑中残留大量的肿瘤细胞。在没有残余肿瘤的情况下可以发现,只有gliotic疤痕或形成空洞病灶与缺乏炎症相关。胶质母细胞瘤治疗观察在大约25%的低剂量(45毫克/公斤)Talpha1 + BCNU治疗组。

有些意想不到的发现是,Talpha1-only组和大鼠接受200毫克/公斤Talpha1 + BCNU表现一样控制或者更糟。Talpha1-only治疗大鼠的大脑更经常肿胀,椎间盘髓由于炎症和水肿结合肿瘤增长质量。在这方面,值得注意的是老鼠的低浓度处理Talpha1±BCNU最好结果比处理浓度越高Talpha1±BCNU自肿瘤细胞杀死相似,但突出的水肿和更普遍和明显的收到Talpha1浓度越高。因此,Talpha1治疗恶性胶质瘤本身并未根除,高剂量测试,这被证明是有害的因为过度肿胀没有伴随化疗。进一步研究关于剂量有效性和安全性的利润率将需要翻译的这些结果人类临床设置。结果进一步表明,Talpha1很少或没有直接对恶性肿瘤细胞,细胞毒性影响和观测到的更多的肿瘤细胞杀死Talpha1 + BCNU治疗由Talpha1的间接行为。以来没有明显差异的密度lympho-mononuclear肿瘤细胞浸润,Talpha1-mediated影响不太可能是由于炎症细胞的招募。因此,我们选择不追求广泛的分析模型使用体内的炎性细胞浸润。此外,我们预期,这些数据将由不同的组织肿胀和倾斜肿瘤坏死相关的不同的治疗方法。相反,在体外实验进行了澄清的潜在机制Talpha1增强BCNU对胶质母细胞瘤细胞的细胞毒性的行动。

体外研究表明,Talpha1没有显著的直接细胞毒性影响胶质母细胞瘤细胞,与体内的发现一致。类似的结果对其他细胞类型包括SH-Sy5y神经母细胞瘤细胞,293肾细胞,C6神经胶质瘤细胞,postmitotic皮质神经元。然而,有效地减少肿瘤体积,通过机制与BCNU管理不涉及炎症或损伤细胞运动性、侵袭性增加。因此,我们假设作为辅助剂,Talpha1可以帮助调节肿瘤细胞杀死通过增强proapoptosis或氧化应激通路的激活。扩展这些调查,我们评估是否Talpha1不利影响细胞的功能和可能呈现细胞有害的药物包括氧化剂更加敏感。这样做是通过检查proapoptosis和prosurvival基因的表达水平,以及增长和看家基因。这些研究表明,Talpha1治疗只要24小时导致显著增加proapoptosis基因9 l胶质母细胞瘤细胞的水平。相似的结果与C6神经胶质瘤细胞;而在SH-Sy5y神经母细胞瘤和293年肾细胞,Talpha1治疗抑制prosurvival机制而非刺激proapoptosis基因。在总认为这些发现,尽管Talpha1没有直接细胞毒性影响,它可能使肿瘤细胞更敏感的细胞毒性药物通过增加proapoptosis基因的表达或减少生存基因的表达。 To test this hypothesis, we determined if Talpha1-treated cells were more sensitive to oxidative stress or BCNU-mediated killing. The studies showed that after 24 hours of Talpha1 treatment, sublethal concentrations of H₂O₂分别或BCNU 25%或40%的9 l细胞死亡。因此,至少有一些Talpha1由其行为的影响对肿瘤细胞而非免疫调制和招聘/激活T细胞,NK细胞和巨噬细胞。尽管这些影响的机制尚不清楚,这些发现在之前的报告显示,Talpha1可以对多发地细胞的生物学功能有直接影响(25,56- - - - - -59),包括抑制肿瘤神经和神经胶质细胞增殖24,25),增强proapoptosis行动的化合物如视黄酸(56),促进细胞色素C的转换一种抗氧化剂,氧化剂的分子(57]。后者可能代表的机制Talpha1增加了proapoptosis 9 l胶质母细胞瘤细胞的基因表达。

immune-modulating Talpha1的性质和相关分子已经确立。其主要作用是增加促炎细胞因子的生产和淋巴细胞增殖。激活T淋巴细胞杀死靶细胞通过激活perforin-granzyme FasL-FasR交互和系统。增加FasL的发现和FasR Talpha1-treated 9 l胶质母细胞瘤细胞的表达表明,激活T细胞能有效地杀死这些靶细胞虽然FasL / FasR交互。利用一种新的体外试验采用SLO (permeabilizing代理)和重组Granzyme B而不是激活T细胞,我们证明了Talpha1-treated 9 l胶质母细胞瘤细胞迅速被接触SLO和Granzyme B,这些发现表明,Talpha1可能有效地促进胶质母细胞瘤细胞的免疫介导的杀戮在几个方面:(1)增加基底proapoptosis基因表达水平呈现更敏感的细胞氧化应激和细胞毒性/化疗药物;(2)增加FasR水平可能与FasL激活T细胞、NK细胞,导致细胞凋亡增加;(3)加强perforin-granzyme-mediated杀死目标肿瘤细胞。此外,结果强烈表明Talpha1恶性胶质瘤治疗结合BCNU使用时是有效的,但不是作为一个独立的代理。结果提供实质性证据,Talpha1独自管理可能是有害的由于增加以最小的根除肿瘤细胞肿胀和炎症。因此,最适合Talpha1治疗恶性胶质瘤的作用是作为辅助剂促进宿主的免疫反应和消除残余肿瘤细胞生存常规化疗。

总之,所述工作表明Talpha1展品antiglioblastoma效果介导通过几个渠道包括:(1)调制proapoptosis /生存基因导致增加肿瘤细胞对氧化应激或细胞毒性化疗药物的敏感性;(2)促进FasR-FasL-mediated免疫细胞杀死瀑布;(3)增加靶细胞敏感性perforin-granzyme-mediated免疫细胞死亡。Talpha1的发现治疗效果对其antiglioblastoma属性依赖BCNU伴随管理强调Talpha1将最适合作为佐剂免疫调制而不是一个确切的抗肿瘤药。也可能,当结合其他化疗化合物,Talpha1可能有类似的积极作用在帮助减少肿瘤负荷,进展和复发明显比目前更大的利率观察与常规化疗。

确认

这项工作是由图NIH的P20RR15578, ca - 35711, AA02666, aa - 02169 aa - 11431和AA12908来自美国国立卫生研究院,NIEHS的培训津贴。a . Sungarian是范思哲的接受者外科研究员奖。

引用

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