文摘

固定化酶是一种有效的方法提高现代酶的性能及应用。有几个支持酶固定化。由于其独特的特性,比如惰性和高表面积,壳聚糖被广泛用于固定酶。固定化脲酶在壳聚糖是一种很有前途的方法来治疗血液中的尿素含量高,然而,最好的动力学和酶的固定化条件效率仍具有挑战性。在此,我们试图将脲酶固定住到nanochitosan通过交联壳聚糖(NPs),研究动力学(k_米和值)和热力学(E_一个,∆H,∆年代,∆G之前和之后)酶反应参数固定在不同的底物浓度(100,150,200,和250 mg / dl)和孵化温度(15 20 25,30岁,35岁和40°C)在选定的最佳条件下。固定化脲酶壳聚糖NPs是使用傅里叶变换红外特征在我们以前的工作(红外光谱)、原子力显微镜(AFM),通过扫描电镜的成像(SEM)。结果显示,固定的最高效率%(70.38%)是观察到750毫克/毫升壳聚糖NPs和磷酸盐缓冲pH值7在40°C。增加K_米价值的固定化酶,酶的效率明显高于自由酶, 。此外,反应的活化能固定化酶催化是低于自由酶,这表明固定化酶的活性部位几何更有利于适应所需的基质,因此更少的能量比自由酶。积极∆的反应是吸热的H。固定化脲酶酶在体外应用于肾病糖尿病患者血液样本伊拉克(n= 35)探讨影响血清尿素酶活性和尿素水平而健康的志愿者。有趣的是,血清尿素酶的活性显著增加后添加固定化酶和尿素水平显著降低( )1.5∼折叠。因此,应用固定化脲酶清除血液中的尿素从血液可以有效解毒或人工肾透析再生系统的机器。

1。介绍

金属酶(脲酶(EC 3.5.1.5)1),催化尿素水解成氨和二氧化碳(2]。去除尿素和铵离子分析中扮演着重要的角色,临床、和化学治疗与几个相关流程,如血液和尿液分析,肾功能衰竭,人工强化,以及污水处理、食品和药物分析(3]。脲酶被用于直接清除血液中的尿素解毒(4]。脲酶固定化已经完成在许多矩阵用于临床分析(5,6]。一些策略可以有效地用于固定酶(7),包括表面吸附、封装、或截留8]。然而,大多数程序固定导致减少的酶活性9,10)或改变脲酶的结构(例如,当固定发生nanoceria表面)(11]。没有单一的方法或支持,保留了酶活性是适合应用程序。这是由于不同的化学性质和酶的组成,以及不同的基板和产品的品质。固定化技术的主要优势在固定化后酶活性的稳定性和过程的可逆性,酶和支持材料可以用于多个应用程序被重用。固定化酶不仅至关重要的重用,还为他们更高效的利用。固定化酶更具有更强的活力和环境变化而自由酶溶液中(12,13]。poly-N-acetyl葡萄糖胺,壳聚糖是甲壳素的N-deacetylated导数(甲壳类动物的壳的主要成分),这是第二个最普遍的生物聚合物后纤维素(14]。壳聚糖有伯胺在c - 2氨基葡萄糖残基的位置。许多高胺的存在是一个独特的功能,为壳聚糖提供了重要的功能属性(15]。壳聚糖有许多重要的生物和化学特性由于独特的特征,如生物相容性,生物降解能力无害的产品,无毒性,生理惰性,抗菌活性,重金属离子螯合,gel-forming能力,亲水性,非凡的吸引力的蛋白质(16]。纳米颗粒(NPs)是纳米级的超细胶体10至100纳米药物载体系统,不同的功能组成的有机和/或无机骨干(17]。在过去的15年里,使用的NPs变得指数重要。这些粒子被广泛探讨由于其激动人心的独特属性可持续性等微粒相比,控制药物释放、定位目标和更高的比微粒的表面积与体积比。这些特殊属性发现广泛应用在生物医学和制药等领域生物分子检测、疫苗、组织工程、药物输送、癌症治疗和高和快速准确诊断(18]。此外,壳聚糖NPs更稳定,溶于酸性水溶液,可生物降解,毒性低,完全可以使自然的生物相容性聚合物。这些壳聚糖NPs经肝通常被认为是安全的(由美国食品和药物管理局(FDA)) (19]。NPs表面的功能化是改善和/或添加额外的属性来启用这些NPs在医疗或医药领域的适用。在这方面,不同类型的纳米材料与特征属性和特定官能团位于表面功能化过程的优先级。一些分子用于使职能化NPs表面如小蛋白质,肽片段,抗体,DNA酶,和低聚糖20.]。有趣的是,这种生物化学表面改性的NPs经常导致更少的毒性和高稳定性在生物体液(21,22]。这里,我们旨在增加脲酶被固定在壳聚糖酶的效率NPs从而使职能化酶表面并交付到site-cell目标没有退化。本研究人口的目标选择是糖尿病肾病患者诊断为高血尿素水平。固定化酶聚合物的特点是使用扫描电子显微镜(SEM),傅里叶变换红外(FTIR)和原子力显微镜(AFM)。酶的动力学和热力学行为进行调查之前和之后的固定活动。

2。实验

2.1。材料

脲酶酶与脲酶比色试验获得了工具包(人类;德国);壳聚糖NPs(> 95%程度的脱乙酰作用和粘度80地图)是来自陕西Sangherb生物科技,中国;戊二醛(25%)来自Avonchem(英国);冰乙酸和三聚磷酸钠来自阿尔法CHEMIKA(印度);钠磷酸盐缓冲剂是ChemicalPoint(德国);醋酸钠来自托马斯·贝克(印度);和氯化铵和氨来自默克,仪器:酸度计(TZ397A猎户座)分光光度计(CRCIL。荷兰飞利浦XL-30S英格兰),扫描电镜(FEG)。

2.2。方法

2.2.1。脲酶的固定化壳聚糖NPs上

制备壳聚糖NPs是根据Vaezifar[描述离子凝胶化方法23]。简单地说,750毫克的壳聚糖NPs(平均分子量和脱乙酰作用,90%)醋酸溶解在1%。三聚磷酸钠溶液(1毫克/毫升)不断添加壳聚糖NPs的解决方案和在室温下搅拌,直到壳聚糖NPs纳米粒子自发形成的。24小时后,粘性淡黄色的壳聚糖形成的解决方案。戊二醛溶液(1%)添加到粘性淡黄色的壳聚糖溶液NPs和搅拌24小时在室温下变得越来越粘稠。酶1.2 IU(0.1毫升溶液在0.1毫米磷酸盐缓冲剂,pH值7)在壳聚糖NPs固定化。之后,解决方案相结合,在室温下搅拌1小时。

2.2.2。脲酶活性(自由和固定化)

脲酶活性测定固定化前后使用分光光度法(24]。简单地说,尿素(30μl,孕育了50 mg / dL)为0.25(1.2毫升的脲酶解决方案μ免费和1.56 lμ在37°C l为固定化酶)10分钟。卷0.3毫升Berthelot试剂(5.0通用苯酚+ 25毫克的硝普酸钠磷酸盐缓冲剂的500毫升)添加和混合,然后0.15毫升Berthelot试剂B (2.5 g氢氧化钠+ 4.2毫升的次氯酸钠在500毫升的磷酸盐缓冲剂)添加;的混合是混合好,在黑暗的环境中30分钟允许尿素酶法水解成氨和水。结果氨以670海里。自由和固定化脲酶的活动被表示为μ摩尔·敏⁻¹(25]。一个单位的酶活性被定义为的酶量转换为1μ摩尔氨气在pH值产品每分钟7和37°C。

2.2.3。pH值和温度对酶活性的影响

研究了pH值对固定化脲酶活性的影响在不同的pH值从3.6到10.9,使用0.1米乙酸钠(pH值3.6 - -6.0),0.1米磷酸钠(pH值6.0 - -8.0),和0.1 M chloride-NaOH铵(pH值8.0 - -11.0)。酶的活性测定如前所述[24)显示出最高的最佳pH值的活动。

确定酶反应的最适温度,反应混合物(酶、尿素和试剂A和B)在不同温度下孵化(20°C)和最优博士酶测定的活动(如前所述)(24]。

2.2.4。壳聚糖的浓度效应NPs在酶活性

确定最佳浓度的壳聚糖NPs携带有效酶,不同重量的壳聚糖NPs(0.25, 0.5, 0.75,和1.0 gm)被用来固定酶使用固定事件的适用条件。固定化脲酶测定的活动(如前所述)(24]。

2.2.5。动力学和热力学参数

动力学和热力学使用五种不同浓度的尿素测定底物(100,150,200,和250 mg / dL)在不同培养时间(10、20和30分钟)和温度(15、20、25、30、35岁,40岁和45°C)。Michalis-Menten方程(方程(1)由Lineweaver-Burk线性化方程(方程(2),用于确定动力学参数V_马克斯,K_米,V_马克斯/K_米(26]: 在哪里V°=初始速度,μg·N·g⁻¹·敏⁻¹;(年代]=尿素浓度,mM;V_马克斯=最大速度,μg·N·g⁻¹·敏⁻¹;和K_米=米氏常数,毫米。

线性化的版本(方程(3阿仑尼乌斯方程(方程(的)4))所使用的假设K≈V来确定E_一个和一个固定化脲酶的参数: 在哪里K=速度常数,分钟⁻¹;E_一个=活化能,KJ·摩尔⁻¹;一个= pre-exponential因素,μg·g⁻¹·敏⁻¹;和RK = 8.314⁻¹·摩尔⁻¹。

焓的变化之间的关系(∆H)(∆熵的变化年代),Eyring-Polanyi方程(方程(5)),是用来确定这些参数27]:

这个分数(Ln V / T)是策划与[1000 / T (k)]获得斜率(−ΔH) / R)和拦截(Ln KB / h +ΔS / R),KB =波尔兹曼常数(1.38×10⁻²³j.k.¹)。R =一般气体常数(8.314 j.k.¹摩尔¹)。H =普朗克常数(6.62×10⁻³⁴刘昌明)。

吉布斯自由关系(方程(6)被用来计算吉布斯能量的变化: 温度(T在开尔文)测量25°C。

2.2.6款。描述的自由和固定化酶

壳聚糖NPs和固定化酶使用红外光谱特征和AFM [28]。他们也在这里使用SEM表征。

2.2.7。扫描电子显微镜(SEM)

扫描电镜用于壳聚糖NPs的形态学特征和壳聚糖NPs固定化脲酶。喷涂黄金粉末用于应用涂层。创建一个稀释悬挂,样本在水用了3分钟。干燥后,一滴最初的壳聚糖NPs稀释悬挂是放在载玻片和检查。

2.3。固定化酶的临床应用

最好的利用固定化酶聚合物在体外应用于糖尿病肾病患者的血清尿素水平高了。获得的结果与从控制志愿者。酶活性和尿素水平测量之前和之后添加固定化酶。其他一些参数,比如性别、年龄、体重、身高、和空腹血糖(的边后卫)收集和比较。

2.3.1。该研究小组

这项研究包括70名志愿者在总访问巴格达Mustansiriyah大学的国家糖尿病中心。参与者被分成两组:第一组包括糖尿病肾病患者35 23岁至60岁,和第二组组成的对照组35健康参与者年龄在18岁和50年。人权研究伦理是根据标准的道德Mustansiriyah国家糖尿病中心的大学。所有的参与者被中心的专家诊断。

2.3.2。血液样本

一卷5毫升血液收集早上,室温下放置的榨出凝结了半个小时,在3000转离心10分钟,然后收集血清。血清样本存储在−4°C,直到进一步的酶分析。

2.3.3。排除标准

这项研究包括怀孕的患者免费,慢性肾脏并发症的,任何类型的肿瘤,所需的任何参与者的年龄限制(60岁),和动物。

2.3.4。统计分析

未配对的学生t以及(与韦尔奇的修正,双尾)和普通单向方差分析和Brown-Forsythe Bartlett的测试进行显示统计描述和分析和研究团体之间的显著差异< 0.05显著水平。统计分析,GraphPad棱镜9软件使用。

2.3.5。测定血清尿素浓度

采用固定化脲酶水解尿素在病人的血清和比较结果与控制在体外。固定化脲酶是孵化在磷酸缓冲50毫米(pH值7.0)37°C。反应是由增加90μ血清l。10分钟后,反应混合物;离心沉淀蛋白质被移除;和尿素估计上层清液(29日,30.]。用于已知浓度的标准曲线。尿素在血清样本估计也与测量通过自动分析器®(Genolab TEK,美国)。

2.3.6。测定血清尿素酶的活动

之前添加固定化酶、血清尿素酶活性被孵化90计算μ10 l的血清样本μl尿素在37°C(8.33更易)10分钟。反应是100年开始增加μl (Berthlos试剂(试剂)。一卷50μl Berthlos试剂B被添加到反应混合物和孵化37°C在黑暗中。在波长670纳米的光密度检测。

后添加固定化脲酶,酶的活性被孵化90计算μ与90 l的血清样本μ固定化酶和10 lμl 37°C的尿素(8.33更易)10分钟。反应是由添加增加100μl (Berthlos试剂(试剂)。一卷50μl Berthlos试剂B被添加到反应混合物和孵化37°C在黑暗中。在波长670纳米的光密度检测。

3所示。结果与讨论

3.1。动力学参数

3.1.1。壳聚糖的浓度NPs在固定的效果

以恒定的脲酶酶浓度、固定化脲酶的活性显示一个典型的饱和曲线随着壳聚糖的量的增加NPs(图1(一))。当壳聚糖NPS的浓度增加了1 g·w / w,固定化脲酶的活性逐渐增加是表示2701 U / L。这个结果表明,壳聚糖的最佳浓度NPs (750 mg·w / w)和脲酶(1.2毫克/毫升)固定化过程是有效的。脲酶对壳聚糖的装载能力NPS随数量的增加而降低壳聚糖NPS在恒定浓度的酶(图1(一))。高的壳聚糖NPs超过750毫克可能分布在壳聚糖NPs脲酶颗粒。因此,很可能750毫克w / w的壳聚糖NPs提供了一个巨大的表面积被脲酶(31日]。

3.1.2。pH值对固定化的影响过程

pH值的影响固定化脲酶酶的活性(图所示1 (b))。固定化脲酶的最佳pH值为7.0。酶的活性表现出极大地改善pH值3.6到7.0由于生产氨,它调节溶液的酸度和增强的活动(32]。图1 (b)还显示,活动下降的基本解决方案,这可能是由于质子化作用的可能分布状态的侧链氨基酸残基表面的酶。去质子化在碱性介质可以影响分子内静电相互作用,导致稀释酶的三维结构,并减少其活动(33]。

3.1.3。温度对固定化脲酶活性的影响

温度对固定化脲酶活性的影响如图1 (c)。随着温度的增加酶的活性增加到40°C由于脲酶载荷能力的大量潜在的表面结合位点,使它更容易传播在纳米颗粒表面(29日,34]。超过40°C,脲酶活性的下降是由于酶的变性。

酶的速度和动力学决定使用Michaelis-Menten如下: 在哪里K_米Michaelis-Menten常数和吗V_马克斯最大反应速率。Lineweaver-Burk情节(图2(一个))是用于获得K_米值。的K_米为自由和固定化脲酶分别为10.01和11.36毫米,分别。这个结果表明,游离脲酶酶的亲和力高的基质尿素相比,壳聚糖NPs脲酶固定化。增加K_米脲酶的固定化后酶同样报道了(29日,30.,35]。此外,V_马克斯免费和固定化脲酶对壳聚糖NPs 61.34μ摩尔·敏⁻¹和63.69μ摩尔·敏⁻¹分别(图2(一个))。

3.2。热力学参数

阿伦尼乌斯图ln之间K和1 /T是用来计算E_一个自由和固定化脲酶活性36ln(之间的关系),K/T)和1 /T被用来计算焓(∆H)和熵(∆年代)。结果在图2 (b)表明,固定化脲酶的活化能是27.295焦每摩尔,这是低于自由酶41.303焦每摩尔,这证实了之前的研究(37]。较低的E_一个固定化酶可以表明,活性部位的构象更有利于绑定的大部分(年代反应混合物中的分子,因此,更多的E−年代)复合物可能达到能量势垒(38]。

脲酶水解反应的热力学参数,焓∆H,熵∆年代∆,吉布斯自由能G计算固定化脲酶酶和脲酶与标准值相比(参见图吗3)。固定化酶显示∆的结果H= 24.96焦每摩尔,∆年代=−0.132焦每摩尔,∆G= 64.29焦每摩尔。自由酶是∆的参数H= 38.97焦每摩尔,∆年代=−0.084焦每摩尔,∆G= 64.0焦每摩尔)[39]。低焓∆H固定化酶的价值可能表明过渡态或活化络合物的效率E−年代相比),与自由酶。固定化和自由形式的∆年代熵值是负的。它的结构表明,E−年代)在过渡态比基态的命令。的∆G是最好的参数估计的可行性和程度的化学反应。结果显示低∆G值这两个酶的形式,这意味着转换的E−年代]复杂的产品更多的是自发的40]。

3.3。固定化酶共聚物的表征

聚合物壳聚糖NPs加载酶是由原子力显微镜AFM在我们以前的工作特点和愤怒转移红外红外光谱。

3.3.1。扫描电子显微镜(SEM)

扫描电镜图的结果4表明,固定化酶固定化前后的形态。图4(一)表明壳聚糖NPs的形态是制服,球形,分散。脲酶酶的形态显示异构表面(图4 (b));然而,固定化酶的形态均匀表面相比,壳聚糖NPs(图4 (c))。这可能意味着与壳聚糖酶的交互NPs更为高效。因此,紧凑和球形壳聚糖NPs形式可能在脲酶酶的存在变得蓬松。

3.4。固定化酶的临床应用

脲酶的固定化在体外应用于患者血清肾病糖尿病伊拉克遭受充血调查发布的效果在血清尿素酶水平。结果与控制志愿者。血清浓度的尿素水解酶固定化脲酶与那些通过自动分析器®。表1表明,研究人口的平均年龄范围从30到40岁的患者超重(体重指数= 28.64±4.710公斤/ m²,< 29公斤/米²)与正常体重控制(24.19±2.61公斤/米²),他们患有肾病糖尿病±3.81∼6年。空腹血糖水平的边后卫都明显高于患者( ;表1;图5(一个))。肾病糖尿病患者患有高血糖可能由于小血管损伤体内由于其高水平的糖,从而减少肾小血管的能力来执行其功能在血液净化和过滤从废物,这些废物的积累引起血液中。

表2表明应用嵌入式酶显著提高患者的血清尿素酶活性∼2倍和3.5∼折叠控制( ,参见图5)。这种增强意味着成功的发布平台的脲酶(壳聚糖)血清30分钟内孵化时间。有趣的是,表2还表明,尿素水平显著升高的患者的控制(63.11±7.95 mg / dL和29.80±5.00 mg / dL)。然而,病人的尿素水平添加嵌入的酶之后减少了周围∼−1.5倍和∼−2倍的控件( ;图5 (b))。减少尿素水平解释说,脲酶水解尿素为碳酸氢的催化作用和水高度激活后添加嵌入的酶,因此降低了血清中尿素浓度(表2)。因此,应用嵌入式脲酶酶到壳聚糖显示第一次成功的加速度原始血清尿素酶的酶。从力学上看,大量的酶分子增加了可用的底物分子结合的机会,然后水解。

4所示。结论

本研究探讨了脲酶酶的固定化效率上nanochitosan粒子,提高酶在生物技术和生物医学应用程序繁华。固定化条件进行了优化。因此,在壳聚糖NPs成功固定化脲酶酶作为支架材料,证实了红外光谱的结果,AFM、SEM。动力学和热力学参数显示,尿素的亲和力,固定化酶的活性部位是低于自由酶。固定化后酶效率高于自由酶和反应是吸热的。此外,在体外应用固定化脲酶的血清肾病糖尿病患者显著提高血清尿素酶的酶活性和减少尿素级别( )1.5∼折叠。据我们所知,这是第一次显示固定化脲酶酶的影响在减少肾病糖尿病患者的血尿素水平。因此,应用固定化清除血液中的尿素从血液可以有效解毒或人工肾透析再生系统的机器。

数据可用性

所有数据都包含在了手稿。

附加分

没有动物被用于这项研究。所有人类研究程序都按照道德标准负责人体试验的委员会(机构和国家)授权的国家糖尿病治疗和研究中心。尽管这是一个在体外研究中,作者从所有参与者获得许可。

伦理批准

伦理道德委员会批准是由Mustansiriyah大学(伊拉克)。

同意

不适用。

信息披露

本研究在研究注册的年度计划Mustansiriyah大学化学系,2020年https://uomustansiriyah.edu.iq/e-newsite.php。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Zahraa Al-Garawi项目设计,分析和解释数据,写了初稿,审查和编辑最后的手稿。阿里塔哈已经收集和分析样本和数据和写的手稿。艾哈迈德N Abed导致写作、修改和编辑的手稿。努尔T帮助收集的临床资料。

确认

作者要感谢化学系迪亚拉大学宝贵的援助在红外光谱分析和巴格达大学化学系有用讨论AFM结果。

补充材料

图形抽象。(补充材料)