siRNA脂质体诱导的姜黄素的释放

文摘

脂质体是一种潜在的小干扰RNA (siRNA)载体给药系统(DDS)。在这项研究中,我们寻找能够控制释放的分子核从某种类型的脂质体,发现姜黄素可以诱导的siRNA脂质体的释放封装siRNA在30分钟。然而,近年来姜黄素脂质体的释放核显示一个独特的剂量反应(即。钟形曲线)与最大感应在60左右μ姜黄素的g / ml。脂质体脂质成分和温度影响了效率siRNA由姜黄素的释放。大约10%的姜黄素在60μ克/毫升剂量被纳入我们的实验条件下的30分钟内脂质体。我们的研究结果表明姜黄素可能是有用的在控制像siRNA脂质体携带大分子的渗透性。

1。介绍

脂质体与脂质影响人工囊泡形成的自发通过自组织磷脂分散在水中的媒体。他们是球形颗粒直径在纳米或微米级别。脂质体模拟细胞膜的膜结构,脂质体被认为是优秀的生物相容性和生物降解性。脂质体可以保留各种物质,所以他们都被认为是一个潜在的候选人作为载体在药物输送系统(DDS)适用于体内管理(1]。事实上,含有抗癌药物脂质体已经准备解决问题在传统化疗的目的包括细胞毒性对正常细胞和困难在实现具体交付癌细胞(2,3]。

小核RNA)由21-to-23-base-pair (bp)双链RNA和功能通过削减核之间,信使RNA降解信使RNA的RNA sequence-specific方式。siRNA因此后面适用于治疗各种疾病包括癌症通过目标基因表达的抑制,所谓基因沉默(4]。然而,应用程序中的主要问题之一siRNA体内使用是其不稳定。裸核迅速退化,例如,体液中核糖核酸酶。此外,带负电荷的分布不能通过细胞膜负电荷因为静电排斥。为了克服这些问题,预计脂质体作为核的一个合适的载体。的脂质双分子层脂质体可以防止核核糖核酸酶在体内交付或其他的分解者。此外,由于脂质体通常可以被纳入由机制包括细胞内吞作用,他们被认为是合适的核航空公司(5]。

体内的脂质体后,他们被认为是主要被网状内皮系统(RES) [2]。实现一个特定的交付目标细胞体内没有捕获到RES,各种修改了脂质体。虽然命运的脂质体在成立后的细胞内吞作用并不总是澄清,目前推测途径如下:核内体合并脂质体随后溶酶体融合;脂质体是由溶酶体酶降解包括磷脂酶(6]。包含siRNA脂质体的情况下,它被认为是重要的诱发的siRNA脂质体的释放正确后,脂质体是纳入细胞。

小分子量的化合物封装在脂质体,控释已经被各种技术实现;例如,脂质膜的脂质体在gel-to-liquid晶体相变温度明显提高其渗透性,这导致脂质体的释放小分子(7- - - - - -9]。至于核,一些技术已经开发实现的释放核前的核内体脂质体被摧毁在溶酶体5,10]。我们认为重要的是要找到一个合适的分子能够控制释放siRNA脂质体。

姜黄素是一种香料姜黄的主要成分(姜黄),一个黄色的多酚。作为这种化合物具有独特的属性包括抑制NF -κB这是一个核因子在唤起免疫反应中发挥着关键作用,诱导细胞凋亡,抗氧化活动(11),各种应用程序进行了调查。然而其临床应用是有限的,因为它有低溶解度的问题,生物利用度和稳定性。为了解决这些问题,已有多种方法被尝试(12有用的姜黄素衍生物的合成),例如,能够抑制胰岛淀粉样多肽聚合(13)和创建含有姜黄素纳米粒适用于体内管理(14]。我们有报道称纳米脂质体姜黄素是有效地纳入巨噬细胞和抑制细胞因子在小鼠体内后生产管理(15]。我们的研究过程中寻找一个分子诱导siRNA脂质体,我们发现姜黄素诱导释放核有能力从某些类型的脂质体。在本文中,我们想要证明,姜黄素可以诱导核从包含siRNA脂质体以独特的方式。

2。材料和方法

2.1。脂质体的制备

包含siRNA脂质体是准备使用小贝利和沙利文报告的修改方法16]。脂质,1,2-dioleoyl-sn-phosphatidylcholine (DOPC), 1, 2-dioleoyl-sn-phosphatidylethanolamine(涂料)和胆固醇,从NOF公司购买。21核苷酸合成RNA双工(rCUUrArCrGrCUrGrArGUrArCUUrCrGrATT)可能会干扰的表达荧光素酶(17]从Sigma-Aldrich购买,用作核。简单,上面的油脂溶解在氯仿和茄子形状的解决方案是蒸发烧瓶,形成脂质薄膜。脂质体的形成是由超声治疗后10毫米Tris-HCl缓冲区(pH值7.6)添加到脂质薄膜。封装的siRNA脂质体在执行CaCl 40%乙醇和2毫米₂。脂质体封装核悬浮在磷酸盐(PBS)没有Ca^{2 +}和毫克^{2 +}是通过透析(分子量:1000 kDa,频谱)或超滤(分子量:500 kDa,微孔)。三种类型的脂质体被用于这项研究:(1)组成的脂质体DOPC和涂料的摩尔比1:1 (DOPC /涂料脂质体),(2)这些只有DOPC (DOPC脂质体),和(3)DOPC和胆固醇的摩尔比率8:2 (DOPC /胆固醇脂质体)。脂质体的粒径和电动电势通过动态光散射和电泳光散射测量,分别与Zetasizer Nano ZSP(莫尔文)。脂质含量测定脂质体的磷脂和光和光纯化学工业)(kouichi C-Test kouichi脂质体后细胞溶解2%十二烷基硫酸钠为15分钟在90°C。脂质体的小干扰RNA被量化的内容Quant-iT™RiboGreen RNA分析工具包(表达载体)。

2.2。治疗与姜黄素脂质体

我们混在包含250 ng siRNA脂质体悬浮液,姜黄素(Sigma-Aldrich)溶解在1μ和光纯l(二甲亚砜(DMSO kouichi化工行业),和适量的蒸馏水获得总额10μl在0.5毫升塑料管(一)。作为一个积极的控制复合脂质体释放核,我们使用洗涤剂1% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich)。混合物包括脂质体和测试化合物在不同温度下使用PCR孵化热循环TP2000(豆类Bio) 30分钟。

2.3。琼脂糖凝胶电泳

小干扰rna从姜黄素脂质体的释放来估计,我们用姜黄素治疗后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳分析有用,因为我们可以确定核是否完好同时量化核。脂质体悬浮液后接受测试的化合物,我们增加了2μl加载缓冲区包含0.2%的橙色G (Nacalai Tesque)和5%甘油和光纯化学工业(kouichi)混合物。我们为琼脂糖凝胶电泳加载产生的混合物。PH值在2%琼脂糖1200(日本)在TE缓冲i-MyRun 135 V为15分钟。数控电泳系统(Cosmo生物)。

2.4。量化的siRNA脂质体释放

电泳siRNA是沾1%溴化乙锭(EtBr)解决方案,然后通过透照器检测到(3紫外线™,UVP)在302 nm波长。捕获的图像彩色凝胶通过590 DF 100/49滤波器(柯达)数码相机SH-25MR(奥林巴斯)。图像被转换为黑白图片使用查看器2软件(奥林巴斯)。分析了合成图像与Doc-It LS图像分析软件版本7.1 (UVP)。核的数量在每个样本中发现估计从数最大价值1维凝胶分析的软件,因为这个值被发现显示良好的相关性与核的数量在初步实验(数据未显示)。相对大量的核释放在每个样本计算这Triton x - 100治疗脂质体等于100%,DMSO-treated脂质体等于0%。统计分析(学生的以及与Microsoft Excel)完成。

2.5。量化的姜黄素脂质体吸收

确定姜黄素吸收的数量DOPC /涂料脂质体,我们混在脂质体悬浮液(47个毫克/毫升的脂质)小干扰rna (250 ng),含有姜黄素(60μg / ml),适量的蒸馏水含有10% DMSO达到总量的15μl在0.5毫升塑料管。我们孵化的混合物在室温下30分钟,然后由一个微型离心机离心管在13000 rpm (Himac CT 13 r;日立)20分钟在4°C沉淀脂质体。访问非特异性结合的姜黄素管,我们准备了混合物没有在管作为空白脂质体,然后把管以同样的方式如上所述。离心后,合成上层清液管的很仔细,然后沉淀溶解在15μl (DMSO溶液,分别。姜黄素在DMSO溶液的量是由检测姜黄素的荧光。首先,我们获得了校准曲线通过测量荧光从5μl液滴的姜黄素在DMSO溶液溶解在适当的浓度,分别。姜黄素的荧光是决定以类似方式中描述的“siRNA脂质体释放量化”通过使用透照器和软件。我们确定姜黄素的浓度在每一个测试样本(5μl)基于校准曲线。姜黄素脂质体吸收的数量是按照以下计算公式:计算中的姜黄素脂质体的管−在空白管。试验是在重复做。

3所示。结果与讨论

在这项研究中,我们研究姜黄素是否能控制释放siRNA脂质体。因为据报道,姜黄素影响细胞膜并造成其结构(18),我们认为姜黄素能够诱导siRNA脂质体的释放。检验这一假设,我们准备包含siRNA脂质体并确定姜黄素的影响在siRNA脂质体的释放。为了确定姜黄素的影响,我们采用DOPC /涂料,DOPC,和DOPC /胆固醇脂质体,因为DOPC /涂料脂质体已经研究的很透彻形成小单膜囊泡能够携带分布(16]。代表这些脂质体的属性数据如表所示1。

它也被报道,脂质膜组成的不饱和脂质不饱和脂质组成的那样严格的(19]。DOPC /涂料脂质体因此将一个简单的模型来检查核的控制释放。检测siRNA脂质体释放,我们用琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,因为释放核的快速检测和发布完整无缺的siRNA也容易可确定的分析方法。琼脂糖凝胶电泳的代表性结果治疗后DOPC /涂料与姜黄素脂质体是图所示1。与控制DOPC /涂料相比,脂质体(DMSO-treated巷2:未经处理的,车道3:10%),明显释放核中检测出那些对待姜黄素在更高浓度超过40μ6到10 g / ml(车道)在室温下30分钟。重复实验的结果如图所示2。姜黄素的剂量反应曲线显示一个独特的钟形图案。大量释放的siRNA脂质体从姜黄素的浓度检测30μ克/毫升。根据姜黄素浓度和释放逐渐增加达到最大水平在50到60μ克/毫升。剂量超过70μg / ml似乎减少核的释放。

我们随后分析了温度和姜黄素浓度的影响在小干扰rna从DOPC /涂料的释放,DOPC,分别和DOPC /胆固醇脂质体。如图3DOPC /涂料脂质体,姜黄素的影响在16到250毫克/毫升的范围释放核之间没有明显不同室温和37°C。然而,相比之下,在50和60°C条件下,释放核增强在125年和250年μg / ml姜黄素的浓度。此外,我们研究了姜黄素对脂质体的影响与DOPC DOPC /胆固醇脂质成分。虽然适当的剂量姜黄素有效提升siRNA DOPC /涂料脂质体的释放即使在室温下,姜黄素没有明显诱导两DOPC siRNA脂质体的释放和DOPC /胆固醇脂质体在16到250的范围μ克/毫升在同等条件下(图4)。然而,姜黄素诱导从DOPC siRNA脂质体的释放和DOPC /胆固醇脂质体在剂量范围从63到250μg / ml 60°C。这些结果表明,姜黄素的能力唤起释放核取决于温度和脂质体的脂质成分。姜黄素的缺乏,高热治疗50或60°C完全没有显示明显的影响释放siRNA DOPC或DOPC /胆固醇脂质体用于这项研究。据报道,热处理gel-to-liquid晶体相变温度的脂质可以促进小分子从脂质体的释放7- - - - - -9]。然而,DOPC的相变温度大约是−19°C (9]。使用的温度热处理远远高于DOPC /脂质体的相变温度。我们的结果表明,本研究中使用的脂质体对热处理非常稳定。

据说涂料增加渗透率和fusogenicity DOPC影响,而胆固醇减少这些属性(20.]。姜黄素的siRNA-releasing能力(即。,DOPC /涂料> DOPC > DOPC/Cholesterol) seems to be well consistent with these reported changes in permeability and fusogenicity [20.),这表明姜黄素促进脂质体的变化和由此产生的变化导致核的释放。我们估计,大约10%的姜黄素脂质体(47个毫克/毫升)吸收姜黄素治疗的60岁μ在室温下g / ml为30分钟。巴里等人提出了脂质体脂质膜之间的交互模型和姜黄素(18]。根据他们的模型,姜黄素诱导障碍脂质体脂双分子层。在这个模型中一个有趣的方面是,姜黄素失调的脂质双分子层在低浓度(0.25 - -0.5 mol %在脂质)比在较高的浓度(≥1 mol %)。姜黄素和脂质体交互模型可以解释我们的结果,剂量反应释放的siRNA姜黄素诱导的钟形曲线。然而,姜黄素脂质体在60岁时吸收μg / ml估计在我们的实验条件是大约3 mol %在脂质。虽然吸收了姜黄素的量大约是10倍高于诱导高障碍由巴里et al .,我们认为这是由于不同的实验条件:在模型中由巴里et al .,姜黄素已经纳入脂质膜脂质体形成之前,同时,在我们的实验中,姜黄素添加到包含siRNA脂质体。我们推测,在我们的实验条件下,大数量的姜黄素被要求实现提出的类似的脂质双分子层之间的交互和姜黄素巴里et al .,尽管我们不排除这种可能性,在我们的实验中不同的机制从巴里的模型可能工作到诱导siRNA DOPC /涂料的姜黄素的释放,未来的研究仍有待澄清。Bicelles最近作为一个优秀的膜模型系统来分析脂质双分子层之间的相互作用和分子集成到膜,所以这个系统将有助于澄清curcumin-induced siRNA释放从脂质体的好机制21]。

4所示。结论

姜黄素是一种安全的食品原料广泛应用于漫长的人类历史。姜黄素具有独特的分子性质,它一直在寻找感兴趣的各种应用程序。在这项研究中,我们分析了姜黄素对脂质体的影响函数和表明,姜黄素具有诱导能力的释放siRNA脂质体将siRNA封装。我们相信这是第一次报告的影响研究姜黄素脂质体的释放内容。姜黄素的影响取决于至少脂质体的脂质成分,温度,和姜黄素浓度。尤其是姜黄素dose-dependency siRNA发布显示一个独特的钟形图案。我们的研究结果表明,姜黄素有助于调节脂质体释放高分子量分子的渗透性。

缩写

DDS:	药物输送系统
英国石油公司:	碱基对
核:	小干扰RNA
RES:	网状内皮系统
DOPC:	1,2-Dioleoyl-sn-phosphatidylcholine
涂料:	1,2-Dioleoyl-sn-phosphatidylethanolamine
PBS:	磷酸盐
DOPC /涂料脂质体:	DOPC组成的脂质体和涂料的摩尔比1:1
DOPC脂质体:	只有DOPC组成的脂质体
DOPC /胆固醇脂质体:	DOPC和胆固醇组成的脂质体的摩尔比率8:2
EtBr:	溴化乙锭。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持jsp KAKENHI批准号25242045。作者感谢肯特先生Hatashita校对的手稿。

引用

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