设计金纳米颗粒集合作为人类视网膜细胞表面增强拉曼散射标签

摘要

除了用于超灵敏光谱分析的表面增强拉曼散射(SERS)衬底的传统发展外，如今对所谓的SERS纳米标签的设计也越来越感兴趣，该标签将多个SERS应用集成到单个等离子体纳米颗粒中。SERS标签的制作过程复杂，是一项具有挑战性的任务。通常，SERS标签是混合纳米结构，包含一个独特的等离子体纳米物体，编码有特定的报告分子，并包裹在具有生物相容性和靶向功能的保护壳中。在这里，我们生产了有效的SERS标签，由金纳米粒子(主要是二聚体和三聚体)的小聚集物组成，从溶液中捕获，然后转移到细胞中，作为单个等离子体纳米结构。实际上，在受控条件下形成的小团聚体是通过联锁到由硫醇改性聚(乙烯)乙二醇(PEG-SH)制成的聚合物包膜中稳定在溶液中的。在我们的研究中，不需要进一步的编码操作，因为作为还原剂使用的部分抗坏血酸仍然附着在粒子间连接中，当人造标签被人类视网膜细胞内化时，提供持久和强烈的SERS信号。我们的研究显示了新型sers活性纳米颗粒作为生物医学追踪和成像的有效报告者的潜力。

1.介绍

为探测和成像探测器制备新光学标签的各种策略的发展已经取得了巨大的兴趣[<一种href="#B1">1-<一种href="#B4">4.］．在调查技术中，拉曼光谱是由于编码探针的明确标识和报告分子的大托盘的可用性而存在真实优势[<一种href="#B5">5.］．虽然拉曼光谱是可靠的，但拉曼散射效率低(截面等于10⁻³⁰ cm² molecule^-1)限制了它在生物医学领域的应用。因此，需要对编码分子的振动信号进行增强，以提高检测速度和灵敏度。在此背景下，表面增强拉曼散射(SERS)光谱被证明是振动信号放大10倍的唯一解决方案^6.甚至高达10¹⁴-10年¹⁵在某些情况下[<一种href="#B6">6.那<一种href="#B7">7.］．由于拉曼散射的增强如此之大，SERS在成像应用中的应用是荧光的一个有吸引力的替代品。与有机荧光团和量子点等荧光标签不同，sers编码探针由一层拉曼报告分子结合到金属纳米颗粒上组成，具有抗光漂白的优点。这是由于荧光激发态被金属表面猝灭和拉曼虚能态寿命短[<一种href="#B8">8.］．此外，利用SERS技术，可以选择单一光源(如对人体组织的近红外光)同时激发不同的拉曼报告器，实现定量多路检测[<一种href="#B9">9.］．这些优势赋予此类SERS在生物医学系统中的广泛适用性。

如上所述，用于设计SERS编码的纳米颗粒或SERS纳米塔的一般策略涉及一种或多个有机染料作为签名记者的附着在最有用的金属增强剂中以金或银纳米粒子的形式提供，其进一步包封用于保护聚集和生物相容性的聚合物，生物分子或玻璃壳。该文献最近具有这种编码探针，例如由Merican等人报道的聚合物稳定的金纳米粒子。[<一种href="#B10">10， Su等人所描述的蛋白包封的有机-无机复合纳米颗粒[<一种href="#B11">11[Mulvaney等人报道，二氧化硅嵌入式核心壳纳米粒子。[<一种href="#B12">12，或Küstner等所描述的硅包覆金/银纳米壳[<一种href="#B13">13］．最近，对诸如各向异性或多纤维分离纳米粒子的SERS纳米素的改善底物的实施方式更加升高，该纳米体或多纤维分离纳米颗粒靠近生物透明度的NIR窗口，特别是在其突起的高电磁场局部地展示了强的等离子体共振[<一种href="#B14">14-<一种href="#B16">16］．我们小组成功地证明了这种染料编码的多分枝花状纳米粒子作为活细胞内SERS标签的有效性[<一种href="#B17">17］．使用孔雀石绿色草酸盐和碱性葡萄醛作为拉曼活性分子设计，并用硫醇改性的聚（乙烯）二醇聚合物的聚集来设计。发现纳米塔饼被认为是高度稳定的，在633nm激光激发下的活细胞内部可检测到的SERs，并且呈现低在体外当从人视网膜的上皮细胞系列的细胞溶溶胶内测试时的毒性。

在这篇论文中，我们扩展了我们的研究，并提出了一类新的纳米标签，它由金纳米颗粒组成(即二聚体、三聚体和球形颗粒的小聚集物)，具有作为活细胞内sers活性标签的真正潜力。这些粒子是通过一种常用的Turkevich-Frens合成的替代方法制备的，使用抗坏血酸作为金盐的还原剂[<一种href="#B18">18］．值得注意的是，这类纳米粒子不需要任何编码的补充操作，因为抗坏血酸仍然附着在纳米粒子之间，当纳米标签被细胞内化时，会产生持久而强烈的SERS信号。因此，我们期望我们的标签比具有潜在毒性和拉曼活性的有机染料的SERS标签具有更高的生物相容性。此外，我们的AuNPs组装制造策略不同于大多数报道的技术，其中涉及交联分子，如烷硫醇[<一种href="#B19">19那<一种href="#B20">20.表面活性剂[<一种href="#B21">21.，特定蛋白质[<一种href="#B22">22.]和寡核苷酸[<一种href="#B23">23.]最常稳定的物种，如盐或乙醇[<一种href="#B24">24.，这可能会进一步干扰本征粒子信号。本文中，巯基修饰聚乙二醇是一种无毒的亲水聚合物，通常用于改善粒子的稳定性、生物相容性和系统性保留[<一种href="#B25">25.]，用于多种目的：将它们之间的颗粒连接并稳定形成的纳米型。据我们所知，任何其他报告都没有表现出具有来自颗粒合成中使用的还原剂的高和可重复的内在信号的SERS-活性标签。模拟体液盐酸盐溶液中的信号再现性，以及在体外对人类视网膜细胞的测量突出了这种sers活性纳米颗粒作为生物医学成像工具的潜力。

2.实验部分

２.１.化学品和材料

四氯金酸氢(III)三水合物_4.h·3₂o）购自Sigma-Aldrich（德国）。分析级L-抗坏血酸（C_6.H_8.O._6.）从Reactivul（罗马尼亚）获得。α.- 氧气 -ω.- 分子量5kDa的MECCHAPTO聚（乙二醇）（MPEG-SH）是从鸢尾伊斯兰鸢叶鸢尾草（德国）获得的。Gibco Dulbecco的修改Eagle的媒介（DMEM）是从Invitrogen（Carlsbad，Callsbad，USA）购买的。胎儿牛血清，青霉素，链霉素，两性霉素B和3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴铵（MTT）购自Sigma（美国圣路易斯，美国）。二甲基亚甲醚，丙酮酸钠和所有其他化学物质的分析等级和默克（德国）供应。通过实验使用的其他试剂是分析等级并无需进一步纯化即可使用。蒸馏水（DDH₂O)用于所有水溶液和漂洗程序。

２.２.聚乙二醇保护金纳米颗粒的制备

合成中使用的所有玻璃器皿在新建的Aqua Regia溶液（3：1（v / v）HNO的浴中清洗_3. : HCl) and rinsed thoroughly prior to use. The colloidal gold nanoparticles were synthesized based on a method described elsewhere in detail [<一种href="#B18">18］．简单地说，单个纳米粒子是通过搅拌10ml 0.5·10的溶液产生的^-3M四氯金酸_4.）在室温下几分钟，然后加入适当的新鲜制备的抗坏血酸（7.5·10^-3米)的解决方案。在这里，三水合四氯金酸(HAuCl_4.h·3₂o）具有纳米颗粒引发剂的作用，而L-抗坏血酸用作金盐的减速器。混合两种反应溶液时，黄色浅色分散迅速变为无色，深蓝色，最后是粉红色的红色。这种颜色过渡表明AU的减少³⁺从离子到金原子，通过扩散生长形成成核的胶体纳米粒子。

为设计金纳米粒子的团聚体，增加体积10^-6mPEG-SH溶液(20μ.L, 50μ.L, 100μ.l）通过滴落并静于静置几分钟，加入胶体溶液中。粒子选择胶体和聚合物溶液之间的比例和孵育时间，使得首先形成小聚集体（两到几纳米颗粒）。过量的聚合物稳定形成纳米颗粒的形成。在活细胞中孵育之前，通过以低速离心纯化的制备探针。

２.３.用于样品表征的设备

用Jasco V-670分光光度计测量了400 ~ 1000 nm的消光光谱，光谱分辨率为2 nm。使用JEOL模型JEM1010显微镜，通过透射电子显微镜(TEM)成像确定了金纳米颗粒的平均直径。利用激光二极管激光，使用便携式拉曼分光光度计(R-3000CN from Raman Systems)在1 cm范围内激发近红外(785 nm)激光线，记录了金纳米粒子和peg包封纳米系在水溶液中的SERS光谱^-1光谱分辨率和10秒的积分时间。利用He-Ne激光器的633 nm激光线记录活细胞内纳米粒子集合的SERS光谱。633 nm He-Ne激光器通过100倍物镜()的共焦拉曼显微镜α 300R。

２.４.细胞培养及MTT活性测定

人成年视网膜色素上皮细胞D407维持在Dulbecco 's modified eagle培养基中，该培养基添加10%胎牛血清、1 mM丙酮酸钠、100 U/mL青霉素、100μ.g / ml链霉素和2.5 μ.g/mL两性霉素B, 37°C, 5% CO₂， 95%的相对湿度。细胞以1 × 10的浓度接种于96孔板中^4.．当融合度达到90%时，去除培养基，将细胞与未包被纳米颗粒(GNPs)和PEG-GENs (PEG-GENs)一起孵育24小时，将胶体浓度调节在0.3 × 10之间^-11M和6 × 10^-11 M. The tetrazolium salt was used to quantify living metabolically active cells, based upon the principle that MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) is metabolized by mitochondrial dehydrogenase to form a formazan dye. Thereby the end product was measured at a wavelength of 550 nm with background wavelength at 690 nm, with a microplate plate reader HT BioTek Synergy (BioTek Instruments, USA). Briefly, the cells were washed with PBS, and 200 μ.每口井加入HBSS缓冲液中的L MTT溶液。孵育2 h后，去除MTT试剂，用200溶解福马赞颗粒μ.l DMSO。可活力被表示为主动增殖细胞的百分比，随后绘制了活力和处理浓度之间的关系，如图所示<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig6/" target="_blank">6.．采用Graph Pad Prism 5.00版本Tukey多重比较检验进行统计学分析。数据以平均值和平均值的标准误差(SEM)表示。(*重要, * *很重要.）

3.结果与讨论

３.１.金纳米粒子簇的表征及其SERS活性研究

所制备的金纳米粒子的归一化消光光谱，即金纳米粒子整体的构建块，如图所示<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig1/" target="_blank">1（光谱A）并呈现540nm的等离子体共振带。少数μ.L的mPEG-SH聚合物加入到胶体溶液中，等离子体峰红移了3 nm，这与聚合物覆盖导致纳米颗粒周围折射率的增加相一致(放大图像，图)<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig1/" target="_blank">1）.与观察到的换档一起，发生了等离子体带的轻微扩散，并且出现了次要的较小强度带，位于约800nm，表示胶体溶液中几个纳米颗粒聚集体的形成。进一步提高聚合物和胶体溶液之间的比例确定了主要（543nm）和次级（800nm）等离子体带（在图中的光谱C和D）的扩展<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig1/" target="_blank">1）.之后，观察到主要等离子体带的更红转，证明各自的聚乙二醇化纳米颗粒被聚合物完全覆盖。当将聚合物的最大浓度加入到胶体纳米颗粒中时，与纳米颗粒的集合相对应的带子仅忽略可忽略的红移，表明抑制了进一步的聚集，并且其后将形成的PEG-gens保持在该聚集状态下。对于该后来样品观察到的等离子体带的小强度下降仅是由稀释率引起的，而不是通过聚集体的沉降引起的。

随后通过TEM测量证实了粒子形态和粒子系综的形成。根据图<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig2/" target="_blank">2（a），原制胶体主要含有平均直径为50nm的个体，球形纳米颗粒。添加栓胶体的胶体也呈现二聚体，三聚体和小簇（图<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig2/" target="_blank">2（b）那<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig2/" target="_blank">2（c）,<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig2/" target="_blank">2 (d))，周围是一层约3 nm的聚乙二醇聚合物链。最多5个纳米颗粒(小于300纳米)的簇状结构适合于细胞内检测，因为它们的尺寸很小，能够穿透活细胞的膜。此外，这种纳米粒子在小聚集体中的排列导致了强电磁场(热点)，在其中捕获的拉曼活性分子的散射信号增加到10¹⁴．

(一)

(b)

（C）

（d）

制备sers活性纳米标签的一般策略是选择具有强拉曼信号的分子，并将所选分子与具有合适光学响应的贵金属纳米粒子结合[<一种href="#B26">26.］．通常，聚合物进一步参与该设计，以提高纳米颗粒稳定性和生物相容性。对于具有光滑表面的分离的固体球形AU或AG纳米粒子，据报道，SERS增强功能非常低，随着10的增强因子^3.[<一种href="#B27">27.］．因此，具有凸块和腔的纳米颗粒，如恒星，肉丸或花形，是优选的，因为纳米级凸块或内腔内部的局部近场增强提供了显着大于固体上可实现的腔球形颗粒具有光滑的表面。已经显示出几乎相邻的纳米颗粒具有纳米级间隙，用作有效且极其敏感的SERS基材[<一种href="#B28">28.那<一种href="#B29">29.］．这种纳米体的主要属性之一位于颗粒之间的电子耦合，这导致许多新的性质[<一种href="#B30">30.］．例如，这种耦合效应被广泛认为是等离子体激发产生所谓“热点”或强电磁场区域的原因，在这些区域中表面增强拉曼散射(SERS)的效率显著提高[<一种href="#B31">31.］．

为了研究PEG-GENs的SERS活性，我们用785 nm近红外激光线在水溶液中激发了PEG-GENs的纳米系综。这种激发波长叠加了PEG-GENs的特征等离子体带，并为进一步在细胞和组织等生物介质中的应用提供了最大的光穿透性[<一种href="#B32">32.］．我们还研究了在这种程度上，PEG聚合物的浓度影响了这种纳米合奏的SERS指纹，并且我们将所获得的光谱与PEG-Gens尺寸和形态相关联。

随着PEG-SH浓度的增加，形成的纳米系综的SERS光谱如图所示<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig3/" target="_blank">3.，频段分配可以在表中找到<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/tab1/" target="_blank">1．还记录了纯L-抗坏血酸（光谱A）的水溶液中纳米球（光谱B）的SERS光谱，以用于比较。PEG-gens（光谱C，D，E）的SERS光谱存在抗坏血酸分子的特征振动带。观察到来自PEG聚合物层的信号，这与文献中的其他报告一致[<一种href="#B33">33.］．在三个探针之间观察到带强度的有意义的带强度，我们与单个金纳米颗粒的聚集程度相关，因此与纳米聚糖的尺寸和形态相关联。用最高浓度的PEG制备的PEG-gens呈现最高的SERS信号。我们推测硫醇化聚合物链的一部分将它们之间的颗粒连接到胶体溶液中时，有助于形成纳米聚集体，而过量稳定的聚合物稳定为形成的纳米合奏，因此SERS信号被保守。


拉曼	s	振动作业^一种

743W	763年代	O-H脱离平面def。
798年上海	800	O-H脱离平面def。
820年代	819.	C=C str in ring
87米	883	C=C str in ring
993 w	1012.	碳氢键弯曲;地弯曲
1025米	1030.	C-O-H弯曲
1064W	1061	C-O-C str。
1128Vs.	1190	C-O-C str。
1198 w	1211.	碳碳(= O - O str)。
1225 w
1256年代		C-O-C弯曲+ TW
1295米	1270.
1319年代	1322	碳氢键弯曲
1372 w	1380.	C-O-H弯曲+ CH₂W.
1451W	1441年代	C-H弯曲+ CH₂SC.
1489W	1488M.	碳氢键弯曲
1498米	1504W	碳氢键弯曲
1656年代分裂	1584三重态	C=C str in ring

^一种参考文献(<一种href="#B34">34.-<一种href="#B36">36.］．

图3.

μ. μ. μ. 固体纯L-抗坏血酸的拉曼光谱（缩小为0.25）（光谱A）。在NIR激励下记录的溶液中单个金纳米球的SERS光谱（光谱B）。PEG-Gens的SERS光谱随着量增加的增加：20 L(光谱c)， 50L(光谱d)， 100L（光谱e）MPEG-SH，在NIR激励下记录。

从一个样本到另一个样本也检测到很少的波段位置差异，主要是在较高的波数(1200-1800厘米)^-1)，这是由粒子表面不同的抗坏血酸分子取向引起的。簇几何形状的变化也导致了吸附分子在粒子之间形成的间隙中的不同排列。特定振动带(如1030厘米)强度之间的比率^-1（C-O-H弯曲）和1061厘米^-1（C-O-C str），1322厘米^-1（C-H弯曲）和1270厘米^-1，1488厘米^-1(C-H弯)和1504厘米^-1(C-H弯曲)修饰和位于1584厘米的三重带^-1出现在1656厘米处，而不是强烈的双峰^-1(C=C str in ring)在纯抗坏血酸的拉曼光谱中。一项由Edsall和Sagall报道的关于抗坏血酸及其相关化合物的拉曼光谱的早期研究将该带指定为解离解抗坏血酸的抗坏血酸阴离子[<一种href="#B34">34.］．这里，这个额外的频段为1584厘米^-1在1650厘米之后，与内酯环中的C = C str的振动带的消失在一起^-1这使得我们推断PEG-GENs的SERS光谱实际上属于抗坏血酸的双氧化、更稳定的形式，脱氢抗坏血酸。这种稳定的形式是在纳米粒子合成过程中，在金属离子的存在下，抗坏血酸被氧化降解的结果。这些分子通过聚合物的影响进一步吸附到纳米粒子表面，然后在纳米粒子之间的间隙中被捕获，在近红外激光激发下产生强烈的SERS信号。因此，我们证明，我们可以设计出peg -纳米合成物，能够在溶液中给出固有的SERS信号，而不需要添加补充的拉曼活性分子，这对生物环境有潜在的毒性。我们提到，样品纯化后，SERS信号是保守的，而在胶体悬浮液中制备的未包被纳米粒子没有获得任何信号(图中光谱b)<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig3/" target="_blank">3.）.

３．２．PEG-GENs在模拟生物流体中的化学稳定性

在生物体内使用探针的一个重要要求是，探针在盐介质中必须像在细胞介质中一样保持其特性。此外，所研究的探针必须在这些特定条件下提供有效和独特的读出(如SERS信号)。为了测试所制备合成物的化学稳定性，并评估PEG壳的保护程度，我们首先测量了PEG- gens在加入高摩尔浓度氯化钠溶液后的消光光谱，已知氯化钠溶液在未受保护的金胶体中会导致粒子聚集[<一种href="#B37">37.］．将所得结果与未包覆纳米粒子的结果进行了比较。

数字<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig4/" target="_blank">4.图中显示了未包覆的、制备好的纳米颗粒(黑色曲线)和不同数量的聚乙二醇(彩色曲线)在没有氯离子(全线)和有氯离子(虚线)的情况下获得的聚乙二醇- gens的消光光谱。在未包被纳米粒子的情况下，加入盐后等离子体共振带的出现明显改变。峰值位置向较长的波长移动了几个nm，并在900 nm左右迅速形成了一个次级带，表明在没有PEG保护的情况下，金纳米粒子迅速聚集。经过监测，这些聚集的纳米颗粒在数小时内就变成了不可逆的沉积物。

低浓度聚乙二醇聚合物制备的PEG- gens与未受保护的颗粒表现出相似的行为。由于胶体溶液中形成了更多、更大的团聚体，543 nm的主等离子体带强度与纳米团簇专用带强度之比迅速降低。PEG聚合物浓度的增加有助于形成的GENs的可见稳定性，这可以从所呈现的光谱中观察到(图中的蓝色和红色曲线)<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig4/" target="_blank">4.），即使在补充聚集剂存在下，它也保持恒定位置和带状。在消光强度观察到的小滴归因于添加盐溶液引起的样品稀释。虽然在样品保持较长时间后可能发生轻微的沉淀，但是沉积物可以通过超声处理容易地重新分离。

我们进一步测试了Cl存在下SERS信号的稳定性⁻Peg-gens的离子（图<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig5/" target="_blank">5 (b)和<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig5/" target="_blank">5 (c)）.未涂布的单个gnp(图<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig5/" target="_blank">5(一个)）在类似条件下进行测试。我们发现，对于未涂覆的纳米颗粒和用低浓度的PEG制备的纳米粒子，SERs信号在加入盐后增加。我们通过缺乏足够的PEG保护的颗粒过度结实，使这一结果进行证实。虽然聚集基本上增强了SERS [<一种href="#B38">38.，从成像或传感应用的角度来看，不受控制的聚集是不可取的，因为由此产生的SERS信号是波动的。此外，大团聚体很难穿透细胞膜，阻碍了颗粒的任何用途在活的有机体内应用程序。在以较高的聚合物浓度制备的PEG-gens的情况下，在加入氯化钠后，SERS信号几乎保持稳定（图<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig5/" target="_blank">5 (d)）.小强度变化可能是由金表面上的报道分子取向的修改引起的[<一种href="#B39">39.］．在我们的设计中，通过空间稳定化将硫醇-PEG层保持吸附到纳米颗粒表面上的抗坏血酸分子。此外，结果表明，PEG不仅保护所形成的整体免受来自进一步聚集的，而且还通过抑制颗粒之间的内聚力来控制它们的聚集度。

(一)

(b)

（C）

（d）

图5.

μ. μ. μ. 金纳米球的拉曼光谱(a)和增大体积制备的PEG-GENs的SERS光谱:20L (b), 50L (c)和100在近红外激发下，在溶液中记录的mPEG-SH聚合物的L (d)。黑色光谱是在1m盐溶液存在下拍摄的，彩色光谱是加入盐前纳米探针的光谱。

3.3。纳米颗粒集合培养D407细胞的活力

使用MTT测定测试纳米标签对细胞活力的影响。将得到的结果与未涂覆的纳米颗粒和上清液溶液的结果进行比较。在附图中绘制了所选探针存在下的细胞存活<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig6/" target="_blank">6.．对于所有培养的样品，细胞的活力和增殖高度依赖于粒子浓度。当纳米颗粒浓度维持在2.4 × 10时，PEG-GEN培养的细胞存活率高达80%^-11 M, after which a steady decrease of cell viability is observed. Significant toxicity for the cells (less than 40% from the total number of cells remain viable after 24 h) appears only for the highest nanoparticle concentration (6 × 10^-11 M). At this high concentration bare GNPs gave better survival rate while supernatant was proved to be more cytotoxic than the prepared PEG GENs nano-tags. From the class of hydrophilic polymers used as stabilizing agents for various types of nanoparticles, PEG polymer was generally proved to be biologically inert [<一种href="#B40">40］．此外，聚乙二醇和聚乙二醇衍生物在很大程度上参与了解毒纳米颗粒，例如在细胞环境中使用的ctab毒性金纳米棒[<一种href="#B41">41.那<一种href="#B42">42.］．考虑到这一点，与SERS纳米标签相比，裸纳米颗粒增加的生物相容性可能会很有趣。为了解释这一点，我们推断了两种类型的纳米探针通过细胞传递的不同机制。缺乏聚乙二醇涂层保护的裸纳米粒子会在盐碱化的细胞介质中聚集，形成大团簇，无法穿透细胞膜，因此无法通过细胞传递。另一方面，peg稳定的纳米合成物将被大量输送到细胞室，造成轻微的毒性，但只有在高纳米颗粒浓度时。只含有未结合聚合物和未还原金离子的上清液的作用也支持上述假设。

3．4．PEG-GENs作为活细胞内的SERS标签

表面增强的拉曼散射是一种高度敏感的光谱技术，被施加为用于活细胞内的检测和成像应用的方便和有吸引力的替代方案[<一种href="#B43">43.］．尽管SERS提供了独特的优势，但细胞细胞质中发现的大量分子通常是对相关生物信息提取的障碍。此外，由于纳米颗粒在缓冲溶液或血清中聚集的常见趋势，可能发生信号再现性。尽管从成像和检测观点来看，如果纳米颗粒聚集在纳米颗粒聚集的情况下，可以获得大量增强，但是这种现象几乎不希望，因为不能控制聚集并且所得的SERS信号波动。同样的大骨料几乎不能进入蜂窝膜。最近，通过将有机染料包封作为金纳米颗粒和聚合物壳之间的签名报告分子和用于生物相容性和稳定化的聚合物壳来开发更敏感的纳米标签。这种有源标签能够触发细胞内的特定现象，或者可以与所需的细胞有机细胞结合[<一种href="#B44">44.那<一种href="#B45">45.］．

为了确定SERS光谱是否可以从抗坏血酸标记的标签中获取，PEG保护的GEN埋藏在细胞内，我们用颗粒孵育D407细胞24小时并记录在细胞内标记的纳米探针的SERS光谱。细胞样品的第一光学评估表明探针的血胞上质和内粒子网状分布（图<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig7/" target="_blank">7.(a))。主要的分布模式是在原子核附近，没有触发核区域的任何粒子。

图7.

载抗坏血酸编码的PEG-GENs的D407细胞的光学显微镜图像(a)。在633 nm激光线激发下记录的PEG-GENs在水溶液(光谱b in (b))和细胞内部(光谱c in (b))中的SERS光谱。频谱c上面的星号表示与细胞成分相对应的振动模式。(b)中的a谱是在没有纳米颗粒的情况下单个细胞的拉曼光谱，作为对照。

活体细胞内纳米探针的SERS检测跟随显微镜观察。在粒子所在的细胞位置获得了与溶液中raman编码粒子签名高度相似的SERS光谱，如图所示<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig7/" target="_blank">7.(b)(光谱c)。除了抗坏血酸报告分子特有的振动带，在细胞内672 cm处peg化的GENs也观察到强烈的SERS带(光谱c中以星号标记的带)^-1，848厘米^-1，在1150-1250厘米^-1指纹区域。这些条带可归因于磷脂和细胞蛋白质（C-C骨干骨骼和酰胺III /-薄片)，它们插入聚合物链并吸附到一些纳米颗粒的表面[<一种href="#B43">43.那<一种href="#B46">46.］．此外，特定波段(1004厘米)^-1苯丙氨酸：环呼吸，1320厘米^-1腺嘌呤/蛋白质：环拉伸/扭曲（CH₂，CH._3.), 1491厘米^-1蛋白质：变形（CH₂，CH._3.)叠加那些报告分子。因此，我们可以相当肯定地说，记录的光谱是结合编码抗坏血酸分子和细胞成分的响应的复合光谱。在没有纳米颗粒的情况下，细胞无法获得拉曼信号(图中光谱a)<一种href="//www.newsama.com/journals/jnt/2012/961216/fig7/" target="_blank">7.(b))。以上结果表明，我们的PEG-GENs具有来自抗坏血酸药物分子的内在信号，不需要任何辅助分子的帮助，就能在细胞内部提供可读的SERS反应，对细胞具有潜在的毒性。

4.结论

本工作提出了一类新的sers活性标签，它由聚乙二醇保护的金纳米颗粒组合(PEG-GENs)组成，编码有微量的抗坏血酸，这种抗坏血酸曾被用作纳米颗粒合成的还原剂。我们发现PEG-SH聚合物不仅能稳定溶液中的单个纳米粒子，还能以二聚体、三聚体和小团聚体的形式捕获、连锁和稳定一些纳米粒子。SERS标签的制备具有简单、单步编码的优点，利用了在纳米粒子形成过程中溶液中抗坏血酸的存在。PEG-GENs既保留了抗坏血酸的光谱特性，也保留了聚集物的光学活性，无论是在盐溶液中还是在活细胞内，都不会过多地干扰细胞功能。值得注意的是，聚合物涂层不仅提供了良好的生物相容性的生物介质，而且显示了化学可行性，以实现特定的靶向功能。