文摘

有效的间充质干细胞(msc)分化为临床应用是必需的。控制MSC分化,诱导媒体包含不同类型的可溶性因子用于日期;然而,它仍然是具有挑战性的获得均匀分化人口一个适当的质量为临床应用这种方法。我们试图开发纳米纤维支架有效模拟各向异性MSC分化的细胞外基质结构,评估是否可以控制这些细胞的分化使用几何不同的支架。我们评估MSC分化在对齐和随机的纳米纤维,通过电纺的捏造。我们发现,诱导msc在脂肪细胞被抑制在随机纳米纤维明显比纳米纤维保持一致。此外,adipoinduction取向纳米纤维也被抑制在混合adipoinduction和osteoinduction介质的存在,尽管osteoinduction并不影响脚手架几何的变化。因此,我们取得了局部控制的方向分化通过改变支架的调整甚至在混合介质的存在。这些研究结果表明,精确地控制可以获得MSC分化使用支架和不同的几何形状,而非溶性因素的传统使用的媒介。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是多功能的,允许分化成各种类型的细胞,如脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞1]。这种能力将是有用的在许多临床应用,包括再生受损和受伤的组织,在整容手术2- - - - - -6]。目前,msc直接管理到组织的影响,但从msc分化细胞尚未尝试在临床应用中,由于感应的精确控制带来的困难。然而,如果这样的分化细胞可用于临床应用,时间的细胞移植到受影响的组织可以减少。到目前为止,控制MSC分化,诱导培养基,含有多种可溶性因子,已经使用,有效地诱导分化(1]。然而,获得均匀分化的细胞,适合临床应用的质量,通过使用只有可溶性因子,是极具挑战性的课题。此外,残溶性因素也构成安全问题(7]。

最近,McBeath等人报道,msc附加到宽平面分化为成骨细胞,而细胞连接着一个小面分化成脂肪细胞(8]。他们还报道,细胞形状是细胞分化的关键因素,因为细胞内张力触发gtpase表情的变化,如RhoA及其下游ρ激酶,从而导致细胞行为的变化。

这些知识也可以应用于三维(3 d) msc、文化不仅对文化发展放在一个平面上。然而,在培养皿中细胞培养显示不同形态细胞生长在一个3 d的文化。细胞在活组织包围一个细胞外基质(ECM)的纤维网络结构;这些细胞在细长的形状在一个特定的方向,按照ECM的纤维结构。为了提供一种支架材料用于3 d文化、水凝胶通常准备从合成和天然聚合物9,10]。尽管水凝胶很容易准备和处理,结构均匀,各向异性。出于这个原因,细胞不会保持延伸在水凝胶中,像在生活组织。

在这项研究中,为了解决这个问题,并控制细胞分化在3 d环境中使用生物材料,模拟生活的组织,我们试图开发有效的分化的脚手架,使用合成纳米纤维。我们准备好的纳米纤维支架具有高水平的各向异性,模仿ECM的结构和纳米级弹性纤维、胶原蛋白等,而MSC分化在这些媒体上。我们使用了一个电纺的方法来准备这些纳米纤维支架,因为这种方法允许简单的控制直径、密度、和光纤的几何结构11- - - - - -13]。我们也调查了脚手架几何形状的影响,以及纳米纤维的排列,细胞分化。我们假设细胞拉长随着纳米纤维排列接收分化信号通过细胞骨架张力高于随机纳米纤维细胞。

2。实验

2.1。制备的纳米纤维支架

聚氨酯(聚氨酯;P22SRNAT JIS 82硬度;日本聚氨酯工业,日本东京)是由甲醇提纯re-precipitation从四氢呋喃溶液(四氢呋喃;Wako纯化学工业,日本大阪),和干下减压前使用。聚氨酯四氢呋喃溶解在95%和5%N, N二甲基甲酰胺(DMF);Wako) 12.5% (w / v)。聚氨酯纳米纤维实际上电纺到玻璃盖玻片(5号;<年代vg height="11.2625" id="M1" style="vertical-align:-0.3135pt;width:137.6375px;" version="1.1" viewbox="0 0 137.6375 11.2625" width="137.6375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> 2 2 × 2 6 × 0 。 4 5 − 0 。 6 0 mm;Matsunami,日本大阪)使用一个电纺的设置(作为国内、福冈、日本)的详细计划1。电纺的单元由一个高压电源,一个旋转收集器,注射泵和23 G-needle通过一根管子连接到一个注射器。高电压,25 kV,注射器针头和地面电极之间的应用。一个旋转收集器(直径10厘米):放置水平,10厘米的针。聚氨酯溶液从注射器挤压的速度0.6毫升/小时。旋转的速度和持续时间是1500 rpm和3分钟,分别排列纳米纤维支架,和0 rpm(静态)和30年代,分别为随机的纳米纤维支架。改善纤维表面亲水性,氧等离子体处理(100 W 30年代5 Pa,室大小:φ64毫米×160毫米)进行了使用等离子体反应器(PR300;大和民族的科学,日本东京)。

2.2。扫描电子显微镜

经过纳米纤维支架是sputter-coated Pt / Pd使用离子溅射(e - 1030;日立、日本东京)。进行了扫描电镜(SEM)观察与s - 2600 hs显微镜(日立)。

2.3。测量纤维直径和取向

纤维直径和角度测量从SEM图像使用ImageJ软件(版本。1.46)。纤维取向是量化使用二阶参数<年代vg height="10.725" id="M2" style="vertical-align:-0.1254pt;width:11.375px;" version="1.1" viewbox="0 0 11.375 10.725" width="11.375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> 如下:<年代pan class="equation" id="EEq1"> 在哪里θ每个纤维和是一个角<年代vg height="17.1" id="M4" style="vertical-align:-2.67102pt;width:55.5625px;" version="1.1" viewbox="0 0 55.5625 17.1" width="55.5625" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> ⟨ c o 年代 2 ⟩ 是平均的<年代vg height="13.9375" id="M5" style="vertical-align:-0.13794pt;width:43.049999px;" version="1.1" viewbox="0 0 43.049999 13.9375" width="43.049999" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> c o 年代 2 。

2.4。细胞培养

人类从骨髓msc(豆类生物、志贺、日本)保持在杜尔贝科的修改基本介质(DMEM;表达载体、钙、美国)补充10%胎牛血清(的边后卫;擤鼻涕、法国),100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(英杰公司)在37°C下5%的股份有限公司<年代ub>2,在湿润的气氛中,亚文化<年代vg height="14.375" id="M6" style="vertical-align:-0.3135pt;width:46.612499px;" version="1.1" viewbox="0 0 46.612499 14.375" width="46.612499" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> 3 × 1 0 3 细胞每厘米<年代up>2每3 - 4天。细胞在章节2 - 7日被用于实验18]。

2.5。微分法在纳米纤维支架

一个氧plasma-treated纳米纤维支架,放置在一个35毫米φ菜是用70%乙醇洗净,两次与磷酸缓冲盐(PBS),然后与DMEM / 10%的边后卫。细胞被播种到这个支架<年代vg height="14.375" id="M7" style="vertical-align:-0.3135pt;width:46.612499px;" version="1.1" viewbox="0 0 46.612499 14.375" width="46.612499" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> 2 × 1 0 4 细胞每厘米<年代up>2和培养在37°C 6 h。然后,介质为分化交换介质。成骨分化,osteoinduction介质(OIM;DMEM补充了100 nM地塞米松(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国),50μM抗坏血酸2-phosphate和光][kouichi 10毫米β使用甘油磷酸盐的边后卫和光][kouichi和10%)。脂肪形成的差异化,adipoinduction介质(目标;DMEM包含1μM地塞米松(Sigma-Aldrich), 0.2毫米吲哚美辛和光][kouichi, 10μg / mL胰岛素(Sigma-Aldrich), 0.5毫米3-isobutyl-l-methylxanthine (Sigma-Aldrich),和10%的边后卫)使用。文化媒体改变了新鲜每2或3天15]。

2.6。组织化学分析

矿化的存在存款后成骨分化决定了冯Kossa染色(15]。在一次简短的、文化与PBS冲洗两次,然后用10%甲醛固定30分钟,之后用蒸馏水洗3次。一毫升5% (w / v)硝酸银(Nacalai Tesque,京都,日本)被添加到每个。文化被放置在黑暗中30分钟,用水洗,然后发展为5% (w / v)碳酸钠25%甲醛为5分钟。后发展,文化是洗,5%硫代硫酸钠添加到停止发展,再用水洗,然后风干和成像。的钙沉积量是评价使用ImageJ从图像分析软件。对碱性磷酸酶活性的检测,AP-Substrate工具包III (sk - 5300,向量实验室、CA、美国)使用后,制造商的指示。检测脂肪形成的感应,细胞被固定在4%多聚甲醛和孵化Oil-Red-O和光)(kouichi污点脂质空泡(15]。

2.7。rt - pcr

分析了基因表达在msc逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)。总RNA提取msc使用高纯RNA隔离设备(罗氏诊断、东京、日本),其中包括DNase活动,根据制造商的指示。互补DNA(互补)然后从提取的总RNA合成使用Transcriptor普遍cDNA主设备(罗氏)。具体cDNA放大了PCR反应混合使用(20μL)组成的2毫米Tris-HCl (pH值8.0),10毫米氯化钾,EDTA 0.01毫米,0.1毫米德勤,1 U DNA聚合酶(TaKaRaExTaq;豆类生物),0.2毫米核苷酸混合物,0.5μM的底漆,大约100 ng的cDNA模板。每个周期94°C的温度设置为45 s变性步骤,49 - 63°C退火步骤30年代,90年代和72°C扩展的一步。所有的引物序列和PCR条件表中列出1(14- - - - - -16]。放大产品(9μL)电泳在2% SeaKem GTG琼脂糖凝胶含有0.5μg / mL溴化乙锭,100 V 30分钟,PCR产品可视化紫外线照明器。最优PCR循环条件根据可视化的亮度调整乐队。

2.8。DNA微阵列

基因表达在msc培养3天的维护中排列和随机纳米纤维支架相比,DNA微阵列。总之,总RNA提取msc如上所述量化使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技)。100 ng的互补脱氧核糖核酸生成总RNA的使用Ambion整个转录表达工具包(Ambion);这些分散,使用GeneChip end-labeled WT终端标签工具包(Affymetrix),根据制造商的指示。一个整除的标记DNA (5.5μg)是一个杂化Affymetrix GeneChip人类基因第1.0位阵列(全基因组表达谱芯片,与764885年28869个基因探针;Affymetrix) 45°C 16 h。杂交后,数组是沾流体450站和使用GCS3000扫描仪扫描(Affymetrix)。扫描玻璃纸文件处理Affymetrix表达式控制台软件获得RMA的信号。叠化大于±1.5的差异表达基因被确定与Subio平台(Subio Inc .,东京,日本)。

3所示。结果与讨论

3.1。制备的纳米纤维支架

为细胞培养被捏造的电纺纳米纤维支架从12.5% PU溶液使用一个旋转或静态集电极(计划1)。纤维的直径测量的扫描电镜图像,如数据所示1(一)和1 (b)。纳米纤维的直径没有区别收集在一个旋转或在一个静态的收集器(的意思<年代vg height="12.05" id="M8" style="vertical-align:-1.09097pt;width:65.099998px;" version="1.1" viewbox="0 0 65.099998 12.05" width="65.099998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> 1 。 0 8 ± 年代 D 0.36μm和<年代vg height="12.2375" id="M9" style="vertical-align:-1.09097pt;width:72.474998px;" version="1.1" viewbox="0 0 72.474998 12.2375" width="72.474998" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> 1 。 5 7 ± 0 。 3 6 μm,分别地。,图1 (c))。纤维的方向被计算一个二阶参数量化,<年代vg height="10.725" id="M10" style="vertical-align:-0.1254pt;width:11.375px;" version="1.1" viewbox="0 0 11.375 10.725" width="11.375" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> ,从纤维角度测量的扫描电镜图像;更高的价值(接近1)年代意味着更高的方向沿特定的方向,在一个较低的值(接近0)意味着随机取向。如图1 (d),纤维制造旋转收集器了更高的对齐(<年代vg height="12.05" id="M11" style="vertical-align:-1.09097pt;width:102.025px;" version="1.1" viewbox="0 0 102.025 12.05" width="102.025" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> = 0 。 7 4 ± 0 。 0 3 )比纤维组合在一个静态的收集器(<年代vg height="12.05" id="M12" style="vertical-align:-1.09097pt;width:102.025px;" version="1.1" viewbox="0 0 102.025 12.05" width="102.025" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> = 0 。 3 1 ± 0 。 0 4 )。因此,纤维捏造一个旋转收集器和静态收集器被指定为“一致”和“随机”纤维,分别。

3.2。纳米纤维支架上的细胞分化

检查脚手架几何MSC分化的影响,MSC被播种在对齐和随机纳米纤维支架和诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞通过使用适当的分化中包含特定的可溶性因子。减少可溶性因子的局部波动在培养基中,为了评估只支架几何形状的影响,两种类型的纳米纤维支架被放置在同一道菜每个支架和细胞培养的方式,共享同一介质。后14天osteoinduction OIM,冯Kossa染色进行评估钙的沉积。一些黑色的斑点的钙沉积观察,如图2(一),但没有显著性差异两种支架之间的钙沉积。然而,adipoinduction使用目的后,细胞随机纤维似乎不如细胞分化生长在对齐的纳米纤维,尽管被培养的可溶性脂肪形成的因素(数字相同2(一)和2(C))。

图2

的纳米纤维上培养的msc分化OIM或目的为14天。(一)相衬分化msc的图像。((a) - (c))和OIM MSC分化,由冯Kossa染色方法和((d) - (f)) MSC分化与目标,通过Oil-Red-O染色。细胞培养在平坦的菜((a)和(d)),对齐纤维((b)和(e)和随机纤维。((c)和(f)) = 500μosteoinduction m。(B)定量分析。(C) adipoinduction的定量分析。(*):<年代vg height="11.25" id="M14" style="vertical-align:-0.30096pt" version="1.1" viewbox="0 0 56.150002 11.25" width="56.150002" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> < 0 。 0 5 )。

检查msc在遗传水平上的分化,rt - pcr也执行。Osteoinduced msc培养不同类型的纳米纤维方面没有显著差异的表达成骨的标记从细胞培养在平坦的盘子,但adipoinduced msc培养各种基质表现出不同的表达水平的脂肪形成的标记(图3)。具体来说,脂联素的表达(ADIPOQ), (19,20.从脂肪组织分泌的一种激素特别是,脂蛋白脂肪酶(LPL), 1的5大组脂蛋白,21)在细胞生长抑制纳米纤维支架相比生长在平坦的菜。此外,过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARG),存储和葡萄糖代谢,调节脂肪酸(19,20.)和CCAAT / enhancer-binding蛋白α(CEBPA) transactivates催化剂的几种脂肪细胞标记,(22)更强烈地抑制在一个随机比对齐的脚手架,这与上述组织化学的结果是相一致的。

图3

基因表达的分化msc在第三天。巷1:MSC在DMEM培养;通道2 - 4:msc OIM的培养;道5 - 7:硕士培养目标。细胞在培养皿中经过(通道1、2、5),排列纳米纤维(车道3和6),随机的纳米纤维。(车道4和7)ALPL:碱性磷酸酶;RUNX2: runt-related转录因子2;SPP1:磷蛋白质分泌1(骨桥蛋白);BGLAP:骨gamma-carboxyglutamate (gla)蛋白质;COL1A1:胶原蛋白、I型、α1; COL3A1: collagen, type III, alpha 1; FABP4: fatty acid binding protein 4; PPARG: peroxisome proliferator-activated receptor gamma; CEBPA: CEBPA CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha; ADIPOQ: adiponectin, C1Q, and collagen domain containing; LPL: lipoprotein lipase; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (as standard).

3.3。几何控制msc分化的

探讨MSC分化是否可以由支架的几何控制,我们用OIM的混合物诱导分化和目标,可以诱导细胞向脂肪细胞和成骨细胞。与前面的实验中,我们把两种类型的支架到相同的菜,为了使细胞在支架将共享相同的媒介。由于混合介质,msc培养在平坦的菜显示分化成脂肪细胞和成骨细胞(图4)。另一方面,不同的纳米纤维支架上培养的msc分化成脂肪细胞较少但没有显示出不同的细胞分化成成骨细胞的百分比在这个脚手架相比的百分比扁盘表面的成骨细胞产生的混合介质。更特别,msc种植在随机纳米纤维显示主要osteoinduction adipoinduction明显少,尽管中还含有可溶性因子,促进adipoinduction。这表明,直接控制的承诺msc分化成特定的细胞类型已经通过支架的几何形状。

图4

分化MSC在纳米纤维混合介质为7天。(一)相衬分化MSC的图像。msc被碱性磷酸酶染色((a) - (c))和Oil-Red-O。((d) - (f))细胞培养在平坦的盘子,((a)和(d))对齐纤维,(b)和(e)和随机纤维。((c)和(f)) = 500μosteoinduction m。(B)定量分析。(C) adipoinduction的定量分析。(*):<年代vg height="11.25" id="M15" style="vertical-align:-0.30096pt" version="1.1" viewbox="0 0 56.150002 11.25" width="56.150002" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> < 0 。 0 5 ;<年代up>§:<年代vg height="11.0625" id="M16" style="vertical-align:-0.30096pt" version="1.1" viewbox="0 0 48.337502 11.0625" width="48.337502" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg"> < 0 。 1 )。

3.4。DNA微阵列分析

评价支架几何对MSC分化的影响在基因层面,我们比较基因表达在MSC,讲究的对齐和随机纳米纤维支架在维护媒介3天,使用DNA微阵列,可以评估28869个基因的表达。DNA微阵列的结果总结在图5。在这个图中,我们列出了基因的表达水平是1.5倍之间的不同的排列和随机的msc培养纳米纤维。具体来说,我们发现27个基因显示更高的表达上培养的msc对齐纤维,和20个基因显示高表达在msc培养随机纤维。

图5

DNA微阵列的结果。基因表达水平热量地图所示。上半部分列出的基因高表达在对齐MSC,在下方列出的基因高表达随机MSC。

特别是,我们发现微分表达式secretable可溶性蛋白质通过支架的几何形状。这些蛋白质之一是白介素21 (IL-21),细胞因子在扩散过程中发挥作用和自然杀伤(NK)细胞的成熟。(23]Serpin肽酶抑制剂,这有助于控制细胞的功能通过阻断肽酶的活性,(24,25]也增强细胞生长取向纳米纤维。另一方面,角质细胞生长因子蛋白,一种heparin-binding生长因子作为fgf - 7之前所知,(26)在细胞生长在随机纤维增强。据报道,这种蛋白质在分化中发挥作用的表皮干细胞/祖细胞角化细胞,以及DNA合成,细胞增殖。(27- - - - - -29日]因此,MSC分化可能会影响到这些可溶性因子之间的平衡。

我们还发现差异表达的转录因子。POU类5同源框1 b的表达,也称为Oct-3/4,这是一个关键的转录因子在维护干细胞(30.,31日),在对齐纤维增强。我们还发现一些亚科的锌指蛋白的表达改变;具体来说,乙炔的dna结合转录因子的主题特征,功能重要的监管机构的发展(32]。这些转录因子的变化可能引发细胞内级联导致分化。然而,我们没有发现任何重要的细胞骨架的变化因素,如曾被报道。

4所示。结论

在这项研究中,我们证明了msc分化是影响纳米纤维支架的几何。诱导msc分化为脂肪细胞被抑制在随机明显比纳米纤维保持一致。我们还表明,具体通过操纵控制的区别是可能的几何混合介质的存在,促进了adipoinduction和osteoinduction。尽管osteoinduction几何之间的混合媒介几乎等于不同的支架,adipoinduction显著抑制了随机的纳米纤维。我们进一步研究了这些细胞的基因表达DNA微阵列,发现几种类型的转录因子和可溶性因素受到纳米纤维支架的几何形状的影响。因此,骨髓间充质分化成特定的细胞谱系的承诺可以由支架几何控制,不仅通过使用特定的可溶性因子在中。这种方法将是有用的,因为它允许精确的MSC分化和局部控制制造材料用于组织工程。

确认

这项工作的一部分被JGC-S奖学金基金会支持,没有。2319年。这是进一步研究补助金支持活动启动,下边了,没有。23850009。作者感谢Kazuhiro刺梧桐树博士(福井大学生命科学研究实验室)进行DNA微阵列分析。