文摘
生物分子检测进行碳纳米管场效应晶体管(CNT-FETs)经常使用被动芘作为锚拴绳生物活性配体的疏水性纳米管。在本文中,我们探索的可能性,直接使用生物活性芳香族化合物CNT-FET配体。这将是一个有效的方式使职能化CNT-FETs由于许多芳香族化合物热切地绑定到纳米管,并还将确保配体结合分子将接近纳米管。使用一个模型系统组成的芘、菲、萘、或苯boronic酸固定化CNT-FET晶圆,我们表明,人类能够绑定糖化血清白蛋白(gHSA),这是糖尿病的一个重要标志。芘boronic酸证明碳纳米管结合最明显的亲和力以gHSA阻抗。有趣的是,gHSA CNT-FET信号强度,这是成正比的蛋白质绑定,为所有boronic酸测试基本上保持不变。
1。介绍
各种生物分子传感器已经发展,规避需要贴上探测器分子如二级抗体。Label-free检测技术可以大大减少临床化验的时间和成本通过消除需要标签和成像。和增加实时、定量信息对病人的生物标志物是一个高效的个性化医疗的关键一步。
Label-free检测生物分子基于电荷可以通过场效应晶体管(fet),包括碳纳米管场效应晶体管(CNT-FET)。单壁碳纳米管(SW-CNTs)制造纳米材料有巨大的生产潜力出众的电子仪器和探测器为生物医学应用(1,2]。SW-CNTs本质上是卷起的石墨薄片,留住优秀的半导体性质除了聚芳化学性质(3- - - - - -5]。共价连接的配体碳纳米管不太可能破坏其结构,但配体的浓度绑定到碳纳米管是一个关键因素,影响信号强度。吸附密度高配体可以通过分子拥挤和减少信号低配体密度降低信号通过具有约束力的减少目标(6]。将配体CNT-FETs以这样一种方式来生成一个强大的和可再生的信号捕获的蛋白质不是小事。一些因素,而不是遇到在大多数常规固相immunodetection方法,也需要被考虑。例如,一个健壮的信号强度和一致性要求接近的捕获蛋白质的碳纳米管因为电荷捕获蛋白质影响当前由碳纳米管(7]。此外,离子浓度的许多生物样品可以减少CNT-FET敏感性和限制其潜在的适用性(8,9]。
因此,理想的配体使职能化CNT-FETs会小,疏水分子直接与高亲和力结合纳米管及其目标。在这项研究中,我们评估生物活性芳香族化合物是否能满足这种双重目的。研究这种可能性,我们使用一个模型系统组成的芳香boronic酸(图1)。固定化boronic酸通常用于糖尿病研究和临床化验,因为他们结合葡萄糖修改(糖化)蛋白,升高的糖尿病。蛋白质之间糖化是一种自发的和非酶的反应主要氨基酸组和一些糖和一个复杂的级联的化学反应的第一步,最终会导致形成高度交联的和非功能性蛋白质。这些有害的修改发生在血管外的蛋白质是重要的维持血管张力会导致受损的循环,这是许多糖尿病并发症的根本原因(10]。
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早期产品的糖化过程是一个N-linked果糖胺加合物(11]。这个fructosamine-protein加合物1、2 cis-diol可以形成共价酯债券boronic酸(图2)。固定化amino-phenyl boronic酸是常用的作为糖化蛋白的亲和配体因为这stereo-specific债券形成的12]。芳香boronic酸也被开发作为荧光记者团体直接测量糖化蛋白质在患者样本13]。
糖化血红蛋白(HbA1c)是一种行之有效的测量标志的长期影响血糖升高,但是人类水平的糖化血清白蛋白(gHSA)是一个可靠的中间糖化的血糖指标,是一个更准确的指标在许多情况下包括妊娠期糖尿病患者(14,15糖尿病血液透析患者[],16,17),在感染艾滋病毒的患者进行积极的抗逆转录病毒疗法(18]。快速测试gHSA糖化的月度指标可能带来大量的医疗成本节约以及提高病人的依从性(11]。
我们发现,芳香boronic酸固定化CNT-FET晶片结合gHSA监控的阻抗的增加。明显的亲和力的碳纳米管在递增的顺序苯<萘<蒽<芘。最优涂料浓度对芘boronic酸是2毫米,其次是蒽、萘、和苯基boronic酸在14毫米,41毫米和70毫米。
纳米传感器能够监测血糖浓度已报告(19,20.),开发一个功能CNT-FET传感器,还可以测量糖化指数预示着毫米级的糖尿病监测系统的出现,可以全面的一部分传感器为个性化诊断和治疗糖尿病。
2。材料和方法
2.1。材料
单壁碳纳米管含有约70%导电纳米管直径0.7至1.4纳米,长度20到80纳米之间从碳纳米技术公司92购买sample-well问晶片被NanoPlatform Inc .)使用标准光刻制造和发射过程。9-Phenanthrene boronic酸,naphthalene-1 boronic酸、山梨糖醇、二甲基甲酰胺,乙醇是从VWR购买的。芘boronic酸,苯boronic酸,人类糖化血清白蛋白(包含1 - 5摩尔果糖胺每摩尔白蛋白),和拖把从Sigma-Aldrich购买。所有化学品都作为收到。
2.2。测量人类糖化血清白蛋白使用碳纳米管场效应晶体管
我们开发和制造一种廉价CNT-FET wafer-based生物传感器,用它来测量血清胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)在人类Brca1-related乳腺癌的临床前小鼠模型。92电路的描述CNT-FET晶片用于这项研究及其特点以前被琼斯et al。21]。在这项研究中使用的芳香boronic酸(图1)溶解在DMF。最优涂料boronic酸的浓度测定通过执行串行稀释CNT-FET DMF和应用它们。4μL DMF混合的孵化与问电路在RT为30分钟在一个封闭的容器,防止蒸发。孵化后,晶片被暂时用乙醇清洗以去除多余的试剂,然后风干在RT为1小时之前使用。化验,获得了一个基准电路阻抗值后添加4μL 0.1拖把pH值7.5,5毫米MgCl<年代ub>2(绑定缓冲)电路大约30秒,之后4μL糖化人类血清白蛋白(gHSA)在同一个缓冲区精心混在电路和阻抗的变化测量2额外的分钟。每个gHSA测量的阻抗值归一化到相应的缓冲基线值。每个样本都使用新的测量至少一式四份为每个测量电路。源/漏偏见100 mV维护整个测量电信号和脉冲宽度是1秒。参比电极的接地(底部)一侧的晶片。设备一致性并不是优化了整个晶片,但个别电路用于检测之前仔细评估实验。所选CNT-FET电路通常在开关比五到十不等。样品绑定CNT-FET的电特性是使用电流测量的测量系统(MediSourcePlus Inc .),使电接触的源极和栅极CNT-FET。这个电路设计以前的传输特性检测前列腺特异性抗原和igf - 1的特征6,21]。简单,典型的观察电子转移的变化从20至10毫微安抗体固定在前后CNT-FET电路时<年代vg height="14.35" id="M1" style="vertical-align:-3.22281pt;width:19.4625px;" version="1.1" viewbox="0 0 19.4625 14.35" width="19.4625" xmlns="http://www.w3.org/2000/svg">
3所示。结果与讨论
共价功能化碳纳米管使用1-pyrenebutanoic酸succinimidyl酯已经成为首选的方法将生物分子抗体和寡核苷酸适配子等CNT-FETs (22 - 24)。在实践中,碳纳米管可以吸收释放过剩的疏水性芘随后删除芘和添加蛋白质与succinimidyl酯基的反应25]。使用活性芘固定生物分子在碳纳米管是一个简单和方便的过程中,他们与许多商业供应商有现成的。然而,这些活性芘化合物荧光偏振研究最初开发为标签的长寿命芘的激发态26,27]。芘丁酸succinimidyl酯有4碳间隔臂分离胺活性succinimidyl芘基酯。将荧光蛋白标签上间隔器是一个实际的问题,因为他们可以增加获得的笨重和蛋白质表面疏水性荧光组织团体同时最小化任何直接影响标签对蛋白质结构,反之亦然。使用垫片CNT-FET检测潜在的缺点,因为配体的相互作用和目标发生进一步从纳米管表面,将会减弱信号(8]。这个问题是粗鄙的高盐浓度在生物样品,因为离子屏蔽电荷效应,捕获蛋白质对问当前(德拜长度)。德拜长度定义为距离之后,手机费用,如离子,将屏幕上的电场强度。这是离子浓度的平方根成反比的介质在生理离子浓度(~ 150毫米)德拜长度将1纳米左右,这是接近4碳间隔的长度(28,29日]。在某些情况下减少盐浓度可以解决距离的问题30.,31日]。在其他情况下,这不会是一个选择,因为减少生物样品的离子强度会导致蛋白质变性和/或沉淀除细胞溶菌作用如果全血化验。因此直接使用生物活性芳香族化合物作为CNT-FET配体可以提供一个简单的解决这些问题。
芳香的评价效用boronic酸直接CNT-FET配体,我们首先确定最优涂料boronic酸浓度。股票的解决方案的芳香boronic酸在二甲基甲酰胺(DMF)和滴定三倍在DMF的大约0.05毫米,整除的稀释后加入CNT-FET晶圆节中描述2。孵化和简短的用乙醇洗后干燥,gHSA的绑定是衡量一节中描述2。的浓度gHSA用于这项研究(5μg / mL)是等离子体的范围内gHSA normoglycemia和高血糖,大约14%和25%的总血清白蛋白(4 - 5克/升),分别为(32]。此外,改变离子强度的缓冲区用于这些研究并未显著影响CNT-FET信号在gHSA绑定芘boronic酸涂层电路,这表明gHSA在靠近问表面(数据没有显示)。
图3显示了典型的实时绑定gHSA CNT-FET晶片涂有2毫米芘boronic酸控制相比,这是裸CNT-FET gHSA补充道。高于最优涂料boronic酸的浓度导致低阻抗的gHSA,可能由于聚合化合物上的碳纳米管在乙醇洗。此外,广泛的洗涤CNT-FET晶片与乙醇喷把较小的苯和萘芳香boronic酸从晶圆(数据没有显示)。为了执行实验芳香boronic酸,洗涤步骤包括迅速沉浸晶片为95%乙醇浴和空气干燥。
图4显示滴定曲线部分代表每一个芳香boronic酸到CNT-FETs添加5紧随其后μg / mL gHSA和演示了阻抗的增加在绑定的蛋白质。阻抗的增加在绑定gHSA boronic酸涂层CNT-FET电路可能是因为电子捐赠伯胺组的相互作用的蛋白质与碳纳米管已被证明能够降低电导(例如,增加阻抗)33- - - - - -36]。表1总结了这些实验的结果对所有的芳香boronic酸和表明,观察到的最优涂料浓度是最低pyrene-1 boronic酸(2毫米),紧随其后的是14毫米9-phenanthracenyl boronic酸,41毫米为naphthalene-1 boronic boronic酸苯酸和70毫米。这些值是在良好的协议与其他观测,其中包括Yoo et al。37]表明,芳烃的保留固定单壁碳纳米管固相列,这是一个定性指标的结合亲和力是苯<萘<菲<芘。
验证试验的特异性,CNT-FETs晶片被涂上一层芘boronic酸在最优涂料浓度、不同gHSA浓度和阻抗测量。图5(一个)显示CNT-FET的反应和演示了一个concentration-dependant gHSA增加的信号。进一步验证试验的特异性是由测量gHSA绑定与芳香CNT-FETs涂布boronic酸在20毫米山梨糖醇的存在(图5 (b))。山梨糖醇是包含一个6碳多元醇独联体二醇,常用作为竞争配体洗提从boronic酸糖化蛋白质亲和列(38]。见图5 (b),包含多余的山梨糖醇的测定抑制绑定的gHSA boronic酸涂层CNT-FET晶片。
(一)
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有趣的是,几乎没有差异gHSA信号幅度,与表1显示10%和15%之间的阻抗是无论芳香boronic酸涂到CNT-FET晶片。这些结果的一个可能性是,在这项研究中使用的芳香boronic酸是平面刚性和可能的形式π- - - - - -π与胎侧问的互动提供最小曲率,因此可用的表面积最大π- - - - - -π交互。类似的观察推断出从抗癌药物阿霉素的交互着单壁球长大的不同直径的碳纳米管(39]。阿霉素,像芘boronic酸,是一种平面多环和碳纳米管疏水化合物奉行容易。然而,从问阿霉素的释放到溶液制剂与平均直径为1.3 nm的速度比与平均直径为1.9纳米碳管。这种差异被猜测是由于更有利π堆积的阿霉素大直径碳纳米管因为他们奉承侧壁上。相比之下,阿霉素保留更容易在石墨烯由于其平面结构(40]。
4所示。结论
我们认为理想CNT-FET配体检测和测量生物目标应该小,疏水。这些属性将允许高效的问涂层和保证目标是绑定在靠近问表面配体。此外,紧密绑定不需要稀释的生物样品减少离子浓度。在目前的研究中我们证明可以直接使用芳香boronic酸作为检测糖尿病CNT-FET配体标记。我们的数据表明这些化合物,芘boronic酸是优于小芳烃对保留,但所有的芳香boronic酸的性能相似的能力结合gHSA并没有不利影响缓冲浓度测定。还需要进一步的研究来评估CNT-FET晶片的性能测量糖化蛋白标记物的浓度在临床设置。
确认
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