文摘

整个细菌细胞特性快速细菌鉴定是至关重要的。表面增强拉曼散射(ser)被证明是强大的技术为这一目标服务。在这项研究中,整个细菌细胞的特性在microwells由胶体银纳米粒子(AgNPs)与“convective-assembly”方法的报道。为模型的适当大小microwells细菌,大肠杆菌和葡萄球菌cohnii,确定是1.2μ从电子显微镜图像。最低稀释20倍增长媒体收集的样本是必需的细菌减少细菌聚合microwells将细菌细胞。microwell构造结构测试的细菌相比ser性能和ser光谱获得的样本准备用一个简单的混合细菌和AgNPs同样的细菌。结果表明,microwell结构不仅提高光谱质量也提高ser光谱的再现性。

1。介绍

生物结构的光谱特征,如细菌和真核细胞生活作为一个整体,不仅是一个重要的概念理解的生化结构组织在自然环境还活细胞内的细胞过程。表面增强喇曼散射(ser)是一个新兴的和有前途的技术来实现这一目标和它的潜力还没有完全探索研究细菌和真核细胞整体。ser的霸权主要来自其能力提供从分子或分子结构的分子信息位于非常接近的金银纳米表面水的影响非常有限,这是一个生物结构的重要组成部分。

ser的几组探讨了效用的细菌鉴定,歧视和识别(1- - - - - -13]。一个简单的混合细菌细胞和胶体纳米颗粒提供了一种直接的方式,准备样品。然而,由于准备的非均匀特性与简单的混合样品,后天ser光谱显示变化从样本和spot-to-spot相同的样本。虽然有强有力的证据表明,细菌细胞壁上的特定位置最好强烈与AgNPs交互,由于样品制备的变化必须最小化ser光谱的正确解释。因此,一个更系统化的方法从细菌收集可判断的光谱是必要的。

有图案的表面可能会提供一个更合适的环境细菌细胞经历贵金属纳米颗粒的表面等离子体激元用于构造图案的表面。“convective-assembly”是一种技术用于控制组装纳米和微米大小的颗粒变成二维(2 d)和三维(3 d)结构。胶体粒子的自组装在薄蒸发电影是技术的基础14,15]。在装配过程中,小,纳米大小,金银纳米颗粒填充周围的空隙大,测微计大小,乳胶粒子形成胶体晶体。装配过程完成后,乳胶粒子可以从表面与有机溶剂清洗。剩下的多孔三维结构可以用作ser衬底(16]。这种技术的使用也准备从sterically保护涂料和ser silica-encapsulated纳米颗粒和黄金多孔三维结构(16- - - - - -20.]。

在这项研究中,我们准备好的microwells玻璃表面由AgNPs“convective-assembly”方法。表面结构与microwells用于ser衬底描述整个细菌细胞。ser光谱得到的细菌细胞位于AgNPs microwells和简单的混合细菌两个模型,大肠杆菌和s . cohnii比较。

2。实验

2.1。化学物质

AgNO3(99.5%)和营养肉汤买来丙烯酰胺(Seelze,德国)。柠檬酸钠(99%)从默克公司购买(达姆施塔特,德国)。乳胶微球被从英杰公司购买(尤金,或者)硫酸surfactant-free白乳胶。显微镜幻灯片从Citoglass购买(中国)。高效液相色谱级二氯甲烷稳定与乙醇从Labkim购买(土耳其伊斯坦布尔)。

2.2。制备胶体AgNPs

准备了胶体AgNPs李和Meisel报告的方法(21]。在这方面,AgNO 90毫克3在500毫升蒸馏水溶解,加热直到沸腾。然后,10毫升的1%柠檬酸钠溶液添加到这沸腾的解决方案。这个混合物是一直沸腾,直到最后的体积达到250毫升。获得的AgNP胶态悬浮体是利用紫外光谱和扫描电镜的特点。的最大吸收波长AgNP胶态悬浮体通常是在420纳米左右,平均60纳米的大小。悬挂的AgNPs估计的密度为2.0×1011粒子/毫升。

2.3。胶态悬浮体浓度

增加胶体AgNP悬浮浓度需要构建microwell结构。因此,增加100倍AgNP胶态悬浮体浓度从原来的浓度是必要的。这是通过离心法的200毫升AgNP胶态悬浮体5500 rpm为30分钟,去除上层清液只留下2毫升的集中悬挂。

2.4。细菌的准备样品

大肠杆菌(写明ATCC 35218)和葡萄球菌cohnii从我们的微生物样本获得收集(Yeditepe大学遗传学和生物工程系)。在使用细菌之前,他们的身份是验证了夏洛克微生物鉴定系统4.5版本(MIDI,特拉华州纽瓦克)。细菌培养24 h在营养肉汤37°C。收集到的细菌通过添加20毫升的去离子水清洗三次离心法在5000 rpm十10分钟和丢弃上层清液。对于简单的混合方法,5μ每个洗细菌L添加到100年μL AgNPs悬挂。然后,他们混合了涡和5μL的均匀混合物被发现到CaF2幻灯片。现场被允许在室温下干燥大约15分钟前分析。

2.5。制备Microwells

AgNPs和乳胶微球(1.2μ米)混合,涂在玻璃幻灯片使用“convective-assembly。“首先,玻璃幻灯片与铬酸清洗清洁表面。然后,洗幻灯片之前与去离子水冲洗和干燥涂层过程在环境温度。混合物含有银和乳胶纳米粒子是位于横截面的两个眼镜~ 23日会见一个角度和较低的载玻片固定在移动舞台上以一定的速度移动的帮助下一个控制器(π,德国)。图1显示了“convective-assembly”设置。实验装置的细节也解释了在其他地方(22]。从报道设置不同,的载玻片移动阶段移动以外的载玻片放置了一个角。的集中AgNPs和所需的大小乳胶微粒悬架可以用来构造microwells的首选大小。由于细菌的大小在这项研究中,使用1.2μm乳胶微球被用来构建microwells。AgNPs乳胶胶态悬浮体的比例是1:9在发现前最后混合横截面的两个玻璃幻灯片。阶段的速度,载玻片放置在1.0到-2.0之间μm / s。


图1
“convective-assembly”设置用于构造microwells在这项研究中。
2.6。表面的细菌样品的制备

最初的细菌计数计算稀释法和发现为1.3×107和7.4×107CFU /毫升美国cohnii和大肠杆菌,分别。从这个示例中,5μL拍摄,到100年完成μL与蒸馏水。然后,一个2μL-aliquot microwell-structured表面上被发现。这个过程生成足够的细菌microwells ser实验进行这些表面。细菌悬液的地方发现了仍在 2 。 5 ± 0 。 4 μm× 1 。 5 ± 0 。 3 μ细菌样品的m。细菌的数量在每个microwell变化取决于细菌细胞的聚集特征。自的形状美国cohnii细胞与平均直径为0.8球μ米,可以定位大约4细胞到一个1μm大小。的形状大肠杆菌细胞是棒状平均长度和直径1.8和0.9μm,分别。因此,只有一个或两个细胞可以放入一个microwell取决于细胞的方向。注意,本地化的细菌细胞microwells似乎微不足道。

2.7。拉曼仪器

所有测量进行了使用英国inVia反射拉曼光谱系统(英国Plc。,New Mills, Wotton-under-Edge Gloucestershire, UK) An 830 nm laser was used for all SERS experiments. The laser power on the sample was 3 mW with a time 10 sec exposure time. The spot size of the laser is about 1 micron when the 50x (NA = 0.75) objective is used. The wavelength of the instrument was automatically calibrated using an internal silicon wafer, and the spectrum was centered at 520 cm−1。

2.8。扫描电子显微镜

准备的描述与卡尔蔡司EVO 40模型表面进行了SEM的乐器。细菌细胞的扫描电镜图像在microwells收购在干燥环境温度。对于简单的混合实验,之后获得的图像混合胶态悬浮体和细菌细胞和干燥在环境温度扫描电子显微镜样品存根。加速电压是10 kV实验。

3所示。结果与讨论

我们之前研究的参数影响的ser光谱细菌细菌细胞的简单混合胶体纳米颗粒时采用作为样品制备方法(11,12]。原则要求在ser的实验之一是将贵金属纳米颗粒或纳米结构与分子和分子结构密切接触。这需要是设定的拉曼信号增强的机制由于增强机制的主要贡献来自于表面等离子体激元(SPs)。因此,分子结构,如细菌细胞必须在密切接触多达贵金属纳米粒子用于贵金属胶体悬浮时ser实验。在早期的研究中,我们表明,增加了胶态悬浮体浓度四次(4 x)改善不仅再现性也ser光谱的质量由于样本AgNPs密度的增加比先前的报道(11]。图2(一个)显示了扫描电镜的图像大肠杆菌样品准备4 x胶态悬浮体和图2 (b)显示了爵士从十个不同的地点获得的光谱样本。看到,AgNPs不同类地分布在细菌细胞中,该结果与变化在光谱上的激光束移动样本。microwells预计提供一个三维(3 d)环境产生许多接触点对细菌细胞SPs的感觉,这可能提高spot-to-spot变化和获得更多可再生的ser光谱。图3显示了一个典型的microwell-constructed表面包含美国cohnii细胞。考虑的大小美国cohnii(~ 0.8μ米)从SEM图像,获得细菌细胞之间的大小关系和microwell大小(1.2μ米)相关。然而,细菌细胞的聚集趋势影响microwells细菌细胞的均匀分布,防止灌装microwells细菌细胞。因此,稀释步骤是必要的细菌细胞分发适当microwells实验部分将对此进行说明。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
扫描电镜图像的大肠杆菌样品准备好4 x 10 ser的胶状悬浮液(a)和光谱从这个示例生成的不同位置(b)。

图3
扫描电镜的图像美国cohnii在从AgNPs microwells构造。嵌入的图像显示细菌细胞的进一步说明。

图4(一)显示了SEM microwells包含的图像大肠杆菌细胞。之间的大小关系大肠杆菌和microwells也可以定义基于可能的方向大肠杆菌microwells细胞。的平均大小大肠杆菌测量细胞的扫描电镜图像(见图4 (b)),1.8×0.9μ米,长度和直径,分别。1或2在每个microwell大肠杆菌细胞可以依赖的方向大肠杆菌细胞在衬底表面。虽然不可能清晰的可视化大肠杆菌细胞在microwells SEM图像,细菌细胞在基质的存在证实了AFM在图4 (b)。此外,从表面获得ser光谱验证microwells细菌细胞的存在。可视化的困难大肠杆菌细胞在样品准备简单的混合也观察(见图2(一个))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
扫描电镜(a)和AFM (b)的形象大肠杆菌在microwells细胞。嵌入的图像显示细菌细胞的进一步说明。

重要的是要选择合适的激光波长的优质ser光谱从细菌12]。Efrima Zeiri也证明了激光波长和功率的影响在ser的细菌(23]。SP的转变激发波长较长的作为贵金属纳米粒子形成聚合物是一种众所周知的现象。因此,长波长激光激发的SPs聚合AgNPs更合适。这确实是一个激光波长为514 nm没有执行好激光波长830 nm的这项研究。此外,这个波长更适合研究生物样品由于损坏的样品近红外光谱区域是有限的。

由于值得注意的这两种方法的差异,简单的混合microwells,重要的是要理解ser频谱上的光谱特性来自每个方法。图5显示的ser光谱的比较大肠杆菌从样品准备和简单的混合4 x AgNPs microwells。


图5
ser光谱的比较大肠杆菌获得microwells和简单的混合。

光谱揭示了许多光谱差异的比较检验。然而,主要区别是观察到在该地区从500年到700厘米−1。当五个山峰在526、564、582、610和664厘米−1出现在这个地区的光谱获得从样品准备简单的混合,只有三个高峰在520年,571年,621厘米−1在microwells观察。周围的山峰500厘米−1ser的蛋白质和多肽是由s拉伸(24)和峰值约520,526厘米−1在两个光谱可以分配给s拉伸(25]。由于硫醇与AgNPs交互,半个乐队的转变可能会观察到在ser光谱上交互的组织的细菌细胞壁AgNPs当考虑自由AgNPs目前在混合细菌细胞。简单的混合光谱的峰值在564,582,610,664厘米−1和660和630厘米−1可以归因于碳水化合物(26)和首席运营官- - - - - -(27),分别。注意,我们早些时候确定光谱特征的来源来自细菌(28]。然而,如上所述,即使使用相同的激光和NPs的类型,不同的光谱特性。

图6显示了ser光谱的比较美国cohnii从样品准备的简单混合获得4 x AgNP胶态悬浮体和microwells。看到,ser光谱获得的样本准备简单的混合,并添加到microwells惊人地相似。这种相似性可以解释与细菌细胞壁结构。美国cohnii是革兰氏阳性细菌和其细胞壁生物化学相比是完全不同的革兰氏阴性细菌。厚的外墙结构是由肽聚糖结构丰富的n -乙酰D-glucoseamine(唠叨)。此外,这个强大的结构肽聚糖结构有一个更加统一的结构相比,革兰氏阴性细菌细胞壁外。相似的光谱可能指这种细菌的制服墙结构。峰值出现在ser光谱可以分配给类似债券的ser光谱振动大肠杆菌。


图6
ser光谱的比较美国cohnii获得microwells和简单的混合。

生化结构引起的山峰ser光谱的细菌还不清楚知道。有许多参数影响细菌的光谱的性质由微生物材料和技术。有几个报告样品制备的实验条件,如激光波长、纳米颗粒和基体类型处理的源微生物(ser光谱的变化12,23,28- - - - - -30.]。从这些研究中,很明显,一个定义良好的协议是可再生和可翻译的结果所必需的。

为了演示spot-to-spot再现性,一些从不同的位置获得的光谱是在相同的样本。数据7(一)和7 (b)显示的ser光谱重现性大肠杆菌和美国cohnii,分别。百分比变异系数(CV),它被定义为标准偏差(s) /的意思 ( ) × 1 0 0 ,可以用来量化细菌的ser光谱的变化得到的样本。简历使用峰高、绝对强度和峰面积可以计算在每一个频率的谱。% CV值在某一频率或从计算平均%的简历在每一个频率可以变化的量化计算。在这项研究中,我们使用了峰高,绝对强度和峰面积在737厘米左右−1表达谱的再现性% CV值。%的简历大肠杆菌microwells使用峰高,绝对强度和峰面积计算是12日,10日,分别和10。然而,%简历简单的混合方法17岁,18日和19。%的简历大肠杆菌样品准备好“convective-assembly”过程采用峰高,绝对强度和峰面积计算是9日,8,分别和8。%的简历的美国cohnii在microwells 2 1和5,分别12,11日和15个,分别为简单的混合。%的简历美国cohnii样本准备与对流装配过程使用峰高,绝对强度和峰面积计算6、6和7。当两个样品制备方法比较,ser光谱的再现性大肠杆菌是很相似的。然而,在这个方法的ser光谱重现性美国cohnii高于样本准备与对流装配方法。简单的混合,% CVs的细菌非常相似。然而,光谱的再现性美国cohnii在microwells更可再生的大肠杆菌由于大小和形状的同质性microwells细胞有关。准备井是球形的形状,大小和形状的相似美国cohnii他们很容易进入井和均匀。然而,大肠杆菌杆状,进入井是阻碍。因此,改进的重现性较低大肠杆菌。这可以很容易地从数据得出结论3和4。

(一)
(一)
(b)
(b)
图7
再现性的ser光谱大肠杆菌(一)和S.cohnii(b)。从不同的位置获得的ser光谱AgNP microwell结构。

改善microwells简历百分比高于40%大肠杆菌70%,美国cohnii相比1 x的简单混合胶体AgNP悬挂。峰高的简历的改善,区域,和绝对强度在60 - 63%范围大肠杆菌和58 - 61%美国cohnii从样品准备1 x胶态悬浮体与“convective-assembly样品准备。“这项研究的结果是我们之前的研究相比,使用“convective-assembly”[13),再现性的改善很相似。

4所示。结论

在这项研究中,效用的microwell结构由AgNPs整个细菌特性使用ser和获得细菌ser光谱的分析可能的歧视或识别。因为大多数临床上重要的细菌的大小是已知的,不同大小的ser基质可以preprepared microwells。的AgNPs形式组织聚合结构,SP激发波长更长的波长变化。因此,长波长激光是一个适当的选择质量更好的细菌ser准备的结构。细菌细胞的位置microwells显著提高ser光谱的再现性的细菌用于这项研究。因此,ser光谱可以用于快速细菌鉴定。

确认

科学技术研究委员会的支持土耳其(图)和Yeditepe大学。