肽分子连接的电荷传输现象

摘要

非弹性电子隧穿光谱(IETS)是一种有价值的原位光谱分析技术，可以直接描述分子的电子输运特性。在过去，IETS被应用于小分子。利用自组装纳米电子结，首次对磷酸化和天然形式的大型多肽蛋白肽进行了et，得到了可解释的光谱。磷酸化后，肽的I/V特性发生了10倍的重复变化。磷酸化可以作为一种位点特异性修饰来改变肽结构，从而影响肽分子连接中的电子传递。据设想，激酶和磷酸酶可能被用于创建分子电子应用的可调谐系统，如生物传感器和存储设备。

1.介绍

将生物分子整合到纳米级分子结中已成为与分子电子学相关的一个密集研究领域[1，2］．然而，通过生物分子的复杂结构来理解电子传输是困难的，有时是矛盾的[3.，4］．非弹性电子隧穿谱(IETS)是一种强大的纳米工具，用于表征隧穿电子与沿传导途径的离散分子振动之间的相互作用[5］．最近，IET已被用于鉴定掺入的分子物种[6，金属-分子界面上的化学相互作用[7]，分子的取向[8，以及隧穿电子所遵循的轨道路径[9］．蛋白质的电子传递特性已经引起人们的兴趣有一段时间了[10- - - - - -13]， IETS从未应用于表征含有大蛋白多肽的分子连接。在这里，我们研究了IETS是否适用于基于多肽的分子连接，并能检测多肽的生理相关翻译后修饰，如磷酸化。在这项研究中，我们将一种肽及其磷酸化衍生物结合在一个描述良好的分子连接结构中[7，14并利用IETS和I/V分析对其进行描述。

2.结果与讨论

从Ca^２＋钙调素(CaM)依赖的蛋白激酶II (CaM kinase II)是钙调素(Ca)的重要中介^２＋在细胞中的信号通路。Thr 286的磷酸化诱导释放来自CA的蛋白质的构象变化^２＋介导的激活(6］．利用CaM激酶II调控域的11个氨基酸序列(氨基酸281-291)作为测试肽。作为硅结构研究的基础，从CaM激酶II PDB 2bdw的晶体结构中获得了氨基酸281-291的坐标[15］．

在分离试验的螺旋部分发现了Thr 286 [15］．以Met替代Ile 281，以Glu替代Asp 285后，采用共轭梯度法对以下氨基酸序列进行能量最小化:Met- his - arg - gln -Glu- thr - val -Asp- cys - leu - lys。在最小化的结构中，Thr 286的侧链被磷酸化，并使用相同的算法进一步最小化修饰后的肽(CHARMm力场[16])。在不使用溶剂的情况下，用依赖于距离的电介质表示的隐式溶剂进行最小化。非磷酸化的测试肽是随机线圈和α螺旋二级结构元件的组合(图)1(一)）.磷酸化肽的模型(图1 (b))显示出明显的构象改变。非磷酸化肽段中Arg 283的C(b)与Thr 286的O(g)之间的原子间距离为3.310 Å，磷酸化肽段中Arg 283的C(b)与Thr 286的O(g)之间的原子间距离为5.214 Å，增加了1.904 Å。

使用自组装金属肽 - 金属结的表征试验肽[14］．肽的半胱氨酸提供硫醇部分，用于与金电极连接的键[17，18］．未磷酸化肽和磷酸化肽的分子量相差5.5%，两种肽形态的最小构象的分子体积相差在3 - 8%之间，取决于体积的计算方法。尽管构象不同，但体积和整体形状的增量变化导致电极上的填充密度非常相似。微球结的接触面积估计为60 nm²．单个CaM激酶II肽分子在电极上的“足迹”为1 - 3nm²，取决于取向，因此可以将20至60分子（非磷酸化或磷酸化）连接到60nm²表面积。

如前所述，对磁阵进行了清理[19］．用CaM激酶(MHRQETVDCLK, Anaspec, San Jose, CA)和磷酸化CaM激酶(MHRQEpTVDCLK, Anaspec, San Jose, CA)修饰阵列，在2 mL的10 μM溶液中以4^°c持续时间不少于24小时。然后将基材严格冲洗在MilliQ水中，然后干燥。使用磁性组件，在源极/漏极间隙处沉积金属间球，通过肽完成电路。可以通过金属 - 金属触点检测到不正确的坐着的组件，这很容易被排除在数据集（未示出）之外。

如前所述，在I/V和IETS的计算机控制下，使用参数分析仪(Agilent 4155B, Palo Alto, CA)将组件转移到低温真空探测站[19］．IET提供了一种测量金属蛋白 - 金属结的振动模式的方法[19- - - - - -22］．这些研究是在4 K用标准交流调制技术结合两个锁相放大器记录二次谐波信号然后由微分电导归一化以获得包含非磷酸化或磷酸化肽的连接的IET谱(图)2）.傅里叶变换红外光谱(FT-IR)由光谱RX I FT-IR光谱仪(Perkinelmer, Wellesley, MA)获得分辨率为4 cm的光谱^-1在室温下。从样品光谱记录和减去空气的参考光谱。将凸轮激酶II衍生的肽溶解在无水异丙醇（100μg/ mL）中。将溶液在KBR板的表面下干燥₂．

酰胺I、II和III带是肽主结构的组成部分，在et和FT-IR光谱中都存在，如et峰3所示[23］．IETS峰6包含通过FT-IR检测到的多种模式，包括酰胺a和酰胺B波段[23］．氨基酸侧链也对IET谱有贡献。

在IETS峰3中是一些氨基酸侧链的预期模式，包括Asp、Glu、Gln、Arg、Lys和His，这些氨基酸侧链的峰和肽主链的元素相互重叠。IETS峰4解释了半胱氨酸的S-H伸缩模式，它在一个不被其他基团重叠的光谱区域吸收[23］．

与缺乏突出的FT-IR峰相比，IETS S-H振动模式的显著振动强度归因于该官能团是金属(Au)电极上肽的连接点。所有注入肽内的电子必须通过电极表面的金硫键离开，这使得这个单键在et中突出。对于磷酸肽，在1039厘米处有一个峰值^-1FT-IR检测到与磷酸基内的P-OC拉伸一致[24］．在IET光谱中，与与FT-IR检测到的P-OC伸长位置相匹配的磷酸化肽相比，非磷酸化肽的峰2的频率有轻微的红移。综上所述，磷酸化和非磷酸化肽的IETS结果表明，肽的主链和侧链有助于肽中的电子隧穿。

在74个设备上获得了非磷酸化的CaM激酶ii衍生肽的I-V痕迹，在0.5 V偏差下平均产生62 nA(图)3(一个)）.在500mv处的电流值分布有一个主峰(图)3 (b)）.

提出的α螺旋输运机制包括:(1)肽螺旋偶极矩产生的静电场;（2）肽主链的螺旋轨道;(3)通过有助于螺旋结构稳定的氢键[11，13，25- - - - - -27］．通过磷酸化CaM激酶ii衍生的肽段，在大量(62)分子电子器件中可重复观察到电子传递(图)3 (c)）.0.5 V下的可重复性平均电流值为6 nA，比未磷酸化肽(62 nA)低一个数量级。

在500mv处的电流值分布有一个主峰(图)3 (d))和通过固定化磷酸化肽进行的电子传递具有很高的可重复性(图3（e））.螺旋变性已被证明在二色多肽模型中改变电子传输速率，导致电子传输的数量级差异[28］．图中显示了磷酸化和非磷酸化形式的CaM激酶ii衍生肽之间10倍的可重复的电子传递差异3（f）．由于计算出的两种形式的肽的堆积密度非常相似，因此在每个结分析的分子数量是可比较的，这种差异可能归因于肽二级结构内的构象转移。

3.结论

这项工作可以与分子电子领域的高度相关。这些数据表明蛋白质多肽的看似轻微的后翻译修饰可以对IET光谱和I / V特性揭示的电子传输性能具有深远的影响。长期来看，蛋白质电子领域可以产生新的生物医学传感器，计算装置和用于激酶靶向药物的高通量筛选工具。

致谢

作者感谢Vikas Chandhoke博士、Tom Huff先生、Ranganathan Shashidhar博士、Enrico Garaci博士、Alfonso colombati博士、Claudio Belluco博士、Barney Bishop博士、Virginia Espina女士和Victor Morozov博士的慷慨支持。这项工作在意大利/美国卫生与公众服务部合作协议框架内得到了意大利高等研究院Sanità的部分支持，乔治梅森大学和意大利公共卫生部也支持这项工作。

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