单壁碳纳米管在水系统中识别病原体的荧光生物传感器

摘要

研究了在饮用水处理应用中使用单壁碳纳米管(SWCNTs)聚集体作为荧光传感器识别病原体的可能性。进行了批量吸附研究，吸附大浓度金黄色葡萄球菌金黄色的SH 1000和大肠杆菌单壁碳纳米管上的pKV-11。随后，通过在纳米管上涂上荧光抗体，用共聚焦显微镜检测固定化细菌。Freundlich吸附平衡常数(k)S.aureus和大肠杆菌从批量吸附研究中确定为和分别ml / g。吸附在荧光修饰的碳纳米管上的细菌细胞的可视化也清晰可见。结果表明，疏水单壁碳纳米管具有良好的细菌吸附能力和荧光检测能力。这是设计用于水系统病原体识别的荧光生物传感器的一个重要进展。

1.介绍

近年来，饮用水源受到生物威胁剂污染的潜在威胁越来越大。仅在美国，二零零三年就有超过100宗实际的、受威胁的和被破坏的阴谋，其中20宗涉及实际受生物威胁剂污染饮用水的事件[1］．不幸的是，现有的处理技术并不是用来处理和检测生物威胁污染物的，因为大多数生物威胁剂是无色、无味、无味的，并具有典型的特性，如耐氯和生物膜形成趋势[1- - - - - -3.］．这种脆弱的局势在许多国家引起了严重的安全关切，需要立即予以关注。为了克服这种情况，必须开发一种传感系统，能够以更快的速度和更高的精度同时集中和检测来自水系统的生物威胁污染物。

碳纳米管技术有潜力在水安全和防止生物威胁剂方面取得重要进展。碳纳米管对细菌的吸附能力强[4，5]，并能集中不同类型的病原体[4- - - - - -6］．纳米管具有如此高的吸附能力是由于其大的表面体积比和高的纵横比赋予材料高的抗菌特性[7，8］．碳纳米管用于水处理的另一个主要优势是，如果功能化了，碳纳米管有检测病原体的能力。表面改性有多种可能性[9- - - - - -14]，但与抗体的功能化近年来已变得非常重要。抗体不仅提供所需的生物相容性[11]，但也改变了纳米管的电学和光学性质，使其表面对周围环境敏感[11，13，14］．据我们所知，有两个研究小组利用碳纳米管使用抗原-抗体方法检测病原体[11，12］．两组都试图增强碳纳米管的亲水性，因为亲水纳米管的细菌结合能力高于疏水纳米管[11，12］．这是事实，但当需要使用碳纳米管吸附介质来同时浓缩和检测来自流动的水流中的病原体时，从实用的角度来看，最好使用疏水纳米管。

本研究旨在评估疏水碳纳米管浓缩微生物的能力，并在其包覆荧光抗体后对其进行检测。本研究选择的微生物是S.aureus和大肠杆菌．在这个报告中，我们提出了我们的批次吸附研究和共聚焦显微镜分析的结果S.aureus和大肠杆菌单壁碳纳米管聚集体的固定化。

2.材料和方法

本研究使用的是购自Carbolex公司(Lexington, KY, USA)的单壁碳纳米管样品(SWCNTs) (ap级)。这些碳纳米管的纯度为80%，平均直径为1.4纳米，长度为2-5m.细菌培养大肠杆菌pKV-11和S.aureusSH1000由Nishiguchi教授和Gustafson教授获得。大肠杆菌pKV-11具有固有的绿色荧光蛋白(GFP)，并在共聚焦显微镜下显示荧光。S.aureus菌株是一种机会致病菌，处理时要小心。

２.１.批量吸附研究

进行了摇床实验，确定了吸附平衡浓度大肠杆菌和S.aureus单壁碳纳米管上的细菌。对于本实验，新鲜培养的细菌溶液大肠杆菌和S.aureus都是从各自的库存培养中准备的。培养物在37℃胰豆汤中过夜^°C孵化器。然后取1ml等量的溶液于1.5 mL eppendorf试管中，离心2分钟。去除上清肉汤溶液，将管底部的细菌颗粒悬浮在0.85%的生理盐水中，并进行旋涡，使溶液得到均匀的悬浮。该溶液再次离心并在蒸馏水中重悬。细菌溶液现在可以进行摇床实验了。

100毫升蒸馏水和蒸压水各在四个锥形瓶(重复套)，并0.1克单壁碳纳米管添加到每个瓶。对于这种混合物，细菌溶液S.aureus添加到两个烧瓶中，然后呢大肠杆菌添加到另外两个烧瓶中。初始浓度(C₀)S.aureus是和CFU /毫升,大肠杆菌在悬浮液中发现pKV-11和分别CFU /毫升。然后将烧瓶放置在机械振动筛上，在室温下以6000转/分钟的速度进行摇动。将烧瓶中的内容物摇匀60分钟，从每个烧瓶中抽出1ml上清液并收集在eppendorf管中。

上清液用3m聚碳酸酯滤纸(Millipore, Mass, USA)。One hundred.取L的滤液，用于配制10至10的稀释剂⁻¹到10⁻⁵．然后20每次稀释取样本量L，接种于琼脂平板上。麦康基琼脂板用于大肠杆菌pKV-11细胞和甘露醇盐琼脂S.aureus细胞,分别。这两种琼脂培养基选择性地生长各自的菌落，并抑制其他细菌的生长。枚举的菌落数按下式计算:

每个不同稀释值的平均值，以获得两个样品的最终浓度。实验用四种不同的初始浓度再重复四次。用于的初始浓度大肠杆菌是，，,CFU /毫升。金黄色葡萄球菌的初始浓度是，，和7.0∗10⁸分别CFU /毫升。

2.2。共聚焦显微镜分析

2.2.1。大肠杆菌pKV-11

第一次进行摇床实验后，取1 mL均匀悬浮的溶液(非上清)于1.5 mL eppendorf桶中，静置15分钟。15分钟后，用玻璃吸管缓慢移出管中的上清液，同时不干扰管底的悬浮液。然后加入1 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液，在微离心机中纺丝30分钟。纺丝步骤之后，用0.1 M磷酸盐缓冲液洗涤5次。洗后,1L of Alexa 647 (Invitrogen, california, USA)荧光染料溶液在200L 0.1 M磷酸盐缓冲溶液并加入到纳米管-细菌混合物中。内容物冷藏1小时并取出，再用磷酸盐缓冲液洗涤以去除多余的荧光染料，然后在共聚焦显微镜下进行分析。在实际成像中，颗粒被重悬在缓冲液和10样品L在25毫米玻片上(放置盖玻片)，在Olympus Fluoview FV1000共聚焦显微镜下成像(Olympus America Inc, Pa, USA)。Alexa染料会让纳米管发出荧光，而大肠杆菌pKV-11物种已经具有固有的荧光蛋白。

2.2.2。S.aureus sh - 1000

在共聚焦显微镜下研究固定化S.aureusSH-1000对纳米管的应变，但有轻微的修饰。用玻璃吸管取出eppendorf管上清，细菌细胞固定在1%磷酸缓冲甲醛溶液中，冷藏3小时，0.1 M磷酸缓冲液洗涤5次。然后,S.aureus磷酸缓冲液(1L: 100L)加到细胞中，以使一抗与特异性抗体结合S.aureus细胞壁表面。将样品冷藏，细胞在一抗溶液中悬浮液中保存约16小时。取下样品，1L fitc山羊抗兔(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.， Pa, USA)荧光染料溶液，100L 0.1 M磷酸盐缓冲液(1L: 100L)并添加到细胞中。再次将样品冷藏，使二次染色溶液与一抗结合S.aureus细胞。最后将Cy-5二抗溶液(Invitrogen公司，美国加利福尼亚州)置于磷酸盐缓冲液中(1L: 100L)补充道。Cy-5在不同的波长区域荧光单壁碳纳米管S.aureus细胞。成像,10L样品在蔡司LSM510META显微镜下成像(Carl Zeiss Micro imaging Inc.， NY, USA)。

此外，还制备了Alexa 647染料标记的纯单壁碳纳米管的对照样品，并在Olympus Fluoview FV1000共聚焦显微镜下成像。

3.结果与讨论

溶液的最终细菌浓度(C_e)作为吸附平衡浓度，其最大吸附量可由下式求得。平衡点是根据别处报道的吸附动力学数据确定的[4]：在哪里问_马克斯某一吸附剂上的细菌最大吸附量是多少C_e(CFU / g),C₀为细菌在饲料溶液中的初始浓度(CFU/mL)，C_e为溶液中细菌吸附平衡浓度(CFU/mL)，V_F为进料液体积(mL)，V_年代为上清液体积(mL)，米为吸附剂质量，g。

由得到的最大吸附量(问_马克斯)及吸附平衡浓度(C_e)， Freundlich吸附模型(3.)来关联吸附平衡数据: 在哪里k(mL/g)为Freundlich吸附平衡常数，取决于进水温度和pH值n是反映吸附剂表面势能均匀性的常数。通常情况下,“k值与吸附剂对吸附质的吸附亲和力有关。一个大的k值表明吸附剂对吸附质有较高的吸附亲和力。的吸附等温线S.aureusSH1000和大肠杆菌图中绘制了单壁碳纳米管上的pKV-111．Freundlich方程常数是为S.aureusSH1000和大肠杆菌pKV-11。越高k值S.aureusSH1000比那还贵大肠杆菌pKV-11表明与S.aureus。这些细菌在单壁碳纳米管上的高Freundlich吸附平衡常数可能是由于其纤维状介孔结构为吸附提供了可接近的外表面积。此外，纳米管的高抗菌性质也有助于高吸附容量。的比例k数值可用于计算吸附选择性。有很高的选择性S.aureus和大肠杆菌在单壁碳纳米管上得到。

S.aureus是一种球型细菌，平均细胞直径小于或等于单壁碳纳米管的介孔[4］．由于这个原因，吸附亲和力S.aureus显著高于大肠杆菌．吸附动力学和平衡S.aureus和大肠杆菌在我们之前的研究中有非常详细的报道[4，其中清楚地观察到S.aureus不仅在较宽的初始浓度范围内具有较高的吸附亲和力。的吸附动力学大肠杆菌是快，但动力学S.aureus即使在高浓度下也更快[4］．从生物传感器的角度来看，这是很好的，因为生物传感器的有效设计取决于生物威胁剂的浓度速度和它们的选择性，当存在多个物种时。共聚焦图像证实了上面讨论的吸附亲和数据。

图的描述2，3.,4是在这一段中给出的。虽然出现了一些游离细胞，但细菌与SWCNTs的结合是可见的。不添加官能团以增强碳纳米管的亲水性。制备少量荧光抗体以非特异性固定在碳纳米管上。然而，在共聚焦显微镜下的检测是清晰可见的。

4.结论

结果表明，未修饰的疏水单壁碳纳米管对两者都有很高的吸附亲和力大肠杆菌和S.aureus细菌细胞。的吸附能力S.aureus显著高于大肠杆菌在单壁碳纳米管上。Freundlich吸附模型能较好地关联吸附等温线。在共聚焦图像中可以清楚地看到细菌细胞在单壁碳纳米管上的固定，这证实了批量实验中获得的吸附平衡数据。单壁碳纳米管的高吸附容量和高选择性S.aureus表明碳纳米管是一种很有前途的传感材料。

承认

这项研究部分由洛斯阿拉莫斯国家实验室(LANL)、加州大学研究指导和发展基金通过LANL- nmsu MOU基金支持。

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纳米技术杂志》

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