用朝鲜蓟废液快速合成纳米银(Cynara scolymusL.)及其细胞毒性和抗菌活性的评价

摘要

废物的回收和在有用的领域提供它们的用途每天都吸引着人们的注意。在我们的研究中，用提取物制备的部分Cynara scolymus在不适合人类食用的朝鲜蓟植物中，纳米银很容易以一种环保、不耗能的方式合成。利用紫外-可见分光光度计(UV-Vis)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、x射线衍射仪(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)和zeta电位分析数据对制备的纳米颗粒进行了表征。在这些数据中，我们确定AgNPs在458.8 nm波长处具有最大吸光度，晶体纳米尺寸为28.78 nm，外观呈球形。zeta电位为(-)16.9 mV，表明纳米银具有稳定的结构。在浓度为0.03-0.25时，颗粒对病原菌有抗菌作用μg/ml，采用最小抑菌浓度(MIC)微量稀释法测定。通过MTT法检测其对U118、CaCo-2、Skov-3肿瘤细胞株和健康HDF细胞株的细胞毒作用，并测定其对生存的抑制作用浓度。

1.介绍

金属纳米颗粒是一种应用广泛的有价值的材料。纳米粒子如银(Ag)，金(Au)，铁(Fe)和锌(Zn)是其中的一些。有不同的方法来获得它们，如热处理、光化学和化学过程[1.]虽然这些方法的应用阶段比较困难，但也带来了较高的成本。另一个缺点是在加工过程中含有有毒化学物质。与这些方法相比，用生态友好的生物方法合成金属纳米颗粒最近引起了相当大的关注[2.]．

银纳米颗粒(AgNPs)被用于许多不同的领域，如医疗[3.]，生物修复研究[4.，催化应用[5.)、食品(6.，化妆品业[7.、农业活动[8.，以及电子产品[9].藻类等生物资源[10)、细菌(11)、真菌(12和植物[13]被用于生物方法合成AgNPs。其中，与其他生物相比，利用植物源获得更多的纳米粒子，获得的粒子更稳定[14]，更简单、更经济的应用步骤[15]增加对该领域的偏好。植物的叶子[16)、水果(17),根18)、花(19]，以及植物的地上部分[20.]是用于合成AgNPs的结构。

在植物源结构中发现的生物活性成分，如醇、类黄酮、酚和萜类，通过将水结构中的Ag +离子还原为Ago形式形成AgNPs [21]．

Cynarascolymus L。（朝鲜蓟）是一种自古以来就在地中海地区种植的草本植物。如今，它在世界许多地方广泛种植。叶子含有咖啡因奎宁酸衍生物、类黄酮、内酯、鞣质和菊糖。它通过洋蓟中的多酚和类黄酮防止脂质过氧化。众所周知，这种物质fect是由强抗氧化剂如cynarin和水飞蓟素引起的[22].头部是最受欢迎的蔬菜。它被用来制作沙拉、果酱和罐头食品[23]．它产生了大量的浪费，除了消耗的部分。

本研究旨在通过经济、简单、环保的方法，利用废弃状态下的朝鲜蓟部分提取物合成和表征AgNPs，并检测其抗菌和细胞毒性活性。

2.材料和方法

２.１.植物材料

洋蓟(环孢霉)是一种多年生草本植物，开紫色的花，属于菊科菊科。洋蓟富含抗氧化剂，通常生长在地中海国家。作为研究材料，洋蓟果实中不作为食物食用的部分被用作研究材料[23]．

２.２.仪器

分别用PerkinElmer one紫外-可见分光光度计(UV-Vis.)、RadB-DMAX II计算机控制x射线衍射仪(XRD)、EVO 40 LEQ扫描电子显微镜(SEM)、Jeol Jem. 1010透射电子显微镜(TEM)、RadB-DMAX II计算机控制能量色散x射线衍射仪(EDX)、和Malvern zeta电势器件用于确定AgNPs的形成、存在、晶体结构、尺寸、形态外观和表面结构。此外，利用PerkinElmer - 1傅里叶变换红外光谱(FTIR)仪对提取物中参与还原的活性基团进行了评价。在合成结束时，使用OHAUS FC 5706型冷冻离心机(6000 rpm)将AgNPs从萃取物中分离出来。

Sigma-Aldrich品牌固体化合物形式% 98.8 AgNO_3.使用硝酸银。商业购买的万古霉素、粘菌素和氟康唑用作标准抗生素。

2．3.植物提取物和溶液制备

3公斤的朝鲜蓟水果的可食用部分大约是500克。其余的由于没有被消耗而处于浪费状态。在重达200克的废弃零件后，它们被切成小块，在室温条件下晾干，作为材料使用。它经历了一系列的洗涤过程，从物质残留中净化它。提取过程是在室温下使用加热的磁力搅拌器(150转/分)进行的。在提取过程中，待混合物达到沸点温度后，让其煮沸5分钟。然后，在室温下冷却，然后用Whatman no对提取物和残渣进行分离。1滤纸。所得的提取物已准备用于合成。

从AgNO中制备了浓度为20 mM(毫摩尔)的溶液_3.盐

２.４.AgNPs的合成与表征

500ml植物提取物和20mm AgNO_3.将溶液转移到2000ml玻璃烧瓶中。经过简单的混合后，它在室温条件下被留在稳定的表面上。根据时间的不同进行观察。样品根据颜色变化，波长和吸光度测量在紫外-可见分光光度计。

为了检测AgNP分析的形成和存在，使用紫外-可见分光光度计。利用FTIR分析数据对参与还原的生物活性成分的官能团进行了评估。合成后用高速离心机将AgNPs从液相中分离出来。反应完成后，将暗溶液在6000℃下离心 每分钟转数25分钟。通过添加蒸馏水重复离心过程数次。然后，将从残渣中去除的颗粒留在80°C下干燥。干燥后的粉末材料用于FTIR分析。对XRD分析结果进行检查，以确定晶体尺寸和结构。对SEM、TEM和EDX数据进行评估，以确定形态结构和元素组成含量。zeta电位分析结果在纳米粒子表面分析和确定电荷分布时进行了检查。

2.5.使用最小抑制浓度（MIC）微量稀释法测定抗菌活性

金黄色葡萄球菌(S.aureus) atcc25923，大肠杆菌(e.c oli) ATCC25922菌株,白色念珠菌(C.albicans)临床分离物来自İnönü大学医学院医院微生物实验室，以及枯草芽孢杆菌（B.subtilis）ATCC 11774和铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌)ATCC27853由Artuklu大学微生物研究实验室获得。

革兰氏阳性(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)及革兰氏阴性(铜绿假单胞菌和大肠杆菌)细菌接种在营养琼脂培养基上。白念珠菌将酵母接种在sabouraud葡萄糖琼脂培养基上，并在37°C的烘箱中过夜。第二天进行生长控制后，根据McFarland标准0.5制备微生物悬浮液[24殖民地在  单位（CFU）毫升^−1.)固体培养皿中培养的每种微生物的浓度。

Muller Hinton肉汤(用于细菌)、RPMI(罗斯威尔公园纪念研究所)肉汤(用于酵母)和AgNP溶液(浓度为20μ克/毫升^−1.加入96孔微孔板。对第一口井和其他井进行了一系列稀释。然后，将为每种微生物制备的悬浮液添加到每个稀释孔中。

为了比较AgNPs的效果，重复相同的应用步骤，对革兰氏阳性菌株使用万古霉素，对革兰氏阴性菌株使用粘菌素，最后对酵母使用氟康唑抗生素白念珠菌．微板在37°C下生长24小时。在周期结束时，确定生长开始前的井的浓度为最小抑制浓度。

2.6。AgNPs的细胞毒性效应分析

在Dicle大学科学研究中心细胞培养实验室使用从美国型培养收集(ATCC)中获得的人真皮成纤维细胞(HDF)、胶质母细胞瘤(U118)、人结直肠腺癌(CaCo-2)和卵巢肉瘤(Skov-3)细胞进行细胞毒性效应应用。

使用的3种细胞类型在Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM) 75 t瓶中培养，其中包括10%胎牛血清、100 U/ml青霉素-链霉素(Penstrep.)和2 mM l -谷氨酰胺。肉瘤(Skov-3)细胞在Roswell Park纪念研究所(RPMI)的75个t瓶中培养，其中含有%10胎牛血清和100 U/ml penstrep。

培养瓶在37°C、5%CO浓度下培养_2.95%的空气和湿度条件。在血细胞计测量中，细胞达到约80%的汇合后，它们被悬浮在不同浓度，转移到96孔微孔板上，并进行过夜的孵育。第二天，用浓度为200的纳米颗粒处理细胞μg/ml，100 μg/ml，50 μ25克/毫升,μG /ml，孵育48小时。等待后，在板孔中加入MTT溶液，孵育3小时，然后加入DMSO，室温静置15分钟。采用Multi ScanGo, Thermo仪器测量微孔板在540 nm波长处的吸光度。

利用这些吸光度值，计算AgNPs对细胞活性的抑制百分比的浓度: [25,26]．

U为AgNPs处理过的细胞的吸光度，C为对照细胞的吸光度。

3.结果和讨论

3.1.紫外可见分光光度计数据

将植物提取物与20 mM AgNO混合1小时后，观察到颜色由黄色变为深褐色_3.解决方案[2.]．这种颜色变化是由于Ag+离子在转化为AgNPs时还原为Ago和等离子体表面发生振动(SPR)引起的[27,28]．在UV vis. device读数的样品颜色变化，最大吸光度值发现在458.8 nm波长(图1.）．是指在紫外-可见分光光度计中每两分钟采集一次的样品。

这些峰值代表在不同时间采集的样品的最大吸收。

颜色变化和最大吸收波长的结果是显示在深色液体中AgNPs的形成和存在的数据[24,29]．

在使用植物提取物进行合成研究时，最大吸光度波长结果为460 nm [30.]和453 nm [9]与活动星系核蛋白的存在有关。

３.２．红外光谱分析数据

通过观察FTIR结果来评估参与还原的官能团。频率偏移发生在3336.99-3324.35之间 厘米^-1, 1635.26 - -1635.31厘米^-1、2114.04-2121.27厘米^-1．这些频率的变化表明-OH(羟基)基团[15]、N-H胺基[31， C≡C炔基[32是参与还原反应的官能团(图2.）．

３．３．XRD分析数据

在2θXRD结果表明，银的晶体结构为立方结构，峰位为111^°, 200^°, 220^°, 311^°[33]．这些峰值的值分别为32.16、46.10、64.44和76.68(图3.）．

利用峰值，根据Debye-Scherrer方程( )[33]．

这个方程式中符号的意思是为粒径，x射线波长是恒定值(0.90)吗λ价值(1.5418) Å),β最大高度峰值(FWHM)的值，以及布拉格θ计算结果表明，它的晶体纳米尺寸为28.78 在其他研究中，使用Debye-Scherrer方程计算AgNPs的晶体纳米尺寸，35 纳米[18]和40nm [34[晶体纳米尺寸的计算。

3．4．SEM, TEM, EDX分析数据

利用SEM、TEM和EDX分析数据，确定合成后的AgNPs的形态结构和元素组成(图)4.）．确定获得的AgNPs是球形视图[34,35]．EDX数据中银的强峰表明元素组成主要是银含量和AgNPs的存在[36]．弱的C和O峰是由于提取物污染[37)(图4.）．

3．5．AgNPs的Zeta电位

在确定AgNPs表面电荷的zeta电位分析中，研究了AgNPs是带负电荷还是带正电荷。如图所示5.，测得AgNPs的zeta电位为-16.9 当AGNP带正电荷和负电荷时，它们表现出聚集和聚集的特征[26]．得到的(-)16.9 mV值表明AgNPs仅带负电荷，结构稳定。由于我们合成的银纳米颗粒来自植物，所以它自然具有负zeta电位。我们认为这是由于植物结构中的负电荷结构。只有一个负电荷表明没有聚集和聚集[38]这些负电荷可能是由提取物引起的。AgNPs的zeta电位被发现为-14 mV[25和-19 mV [26在研究中。在一项合成研究中，发现zeta电位值为+5.68 mV，有报道称AgNPs表现出聚类和聚集特征[2.]．

3.6。AgNPs的抗菌活性评价

当我们评估AgNPs的活性时，我们获得了病原体物种，我们确定了浓度为0.12和0.25μg/ml，对革兰氏阳性有效美国aure美国和枯草杆菌细菌,分别。我们确定浓度为0.07和0.13μG /ml有效铜绿假单胞菌和大肠杆菌革兰氏阴性菌中。AgNPs有效的最低浓度是0.03μg/ml。当我们比较硝酸银溶液和抗生素获得的AgNPs的效果时，我们得出结论，它们在较低浓度时对这些组是有效的(图)6.和表1.）．

银离子在水结构中电离并表现出高水平的反应性。正银离子与微生物带负电荷的细胞膜相互作用，产生静电引力。在这种相互作用后，它们导致活性氧(ROS)的增加。随着ROS的增加，细胞壁结构被破坏。细胞膜和核膜功能受损并发生结构变化。对这些物种有亲和力的结构如DNA、RNA和蛋白质合成的功能被破坏。细胞死亡伴随着细胞的破坏[39–42]．

当我们对AgNPs的抗菌作用进行一些研究时，发现AgNPs是利用植物提取物获得的黄连木维拉L。它被观察到对治疗有效金黄色葡萄球菌,大肠杆菌和白念珠菌浓度为0.04,0.66和0.16的物种μg / ml,分别15]．在一项旨在获得不同尺寸的AgNPs的研究中，确定了5 nm尺寸的AgNPs是有效的枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，和大肠杆菌浓度为0.8-6μ克/毫升[43].在另一项研究中，强调AgNPs在30岁时有效 μ上的g/ml浓度P.aeruginosa[24]．

AgNPs在不同菌株中可能表现出不同的作用，在影响其活性的因素中，浓度、大小、形状、微生物壁结构、温度和pH值等特性起着决定性的作用[42,44]．

3.7。AgNPs的细胞毒性活性

我们获得的AgNPs对U118、HDF、CaCo-2和Skov-3细胞株的细胞毒活性数据如图所示7.和表2.．HDF细胞在25μg/ml。在U118和Skov-3细胞系上，在25%浓度下测定58.98%和74.55%的存活率 μ分别g / ml。浓度为25μg/ml在U118和CaCo-2细胞系中是有毒的。U118细胞系中活性百分比相对于AgNPs浓度的增加是由于癌细胞的增殖特性[45]．

AgNPs具有很强的氧化性能 + 在生物环境中，形态可诱导免疫、细胞毒性和遗传毒性反应；因此，研究其效应非常重要[46]．AgNPs停留在细胞的不同位置。这些斑点是细胞膜、细胞核和线粒体。AgNPs显示毒性作用，通过诱导细胞凋亡与ROS的增加[45,47]．

在对AgNPs细胞毒性的细胞系研究中，测定了CaCo-2细胞在3.75时的细胞毒性μ克/毫升[46]和Skov-3细胞在9.4μ克/毫升[25有毒性作用。在一项对HDF细胞系的研究中，表明浓度为100μg/ml有毒性作用[48]．

有几个参数对纳米材料的毒性有显著影响。其中一些是浓度、曝光时间、电荷、表面组成的化学成分、沉积程度、形状和大小[41]．

我们在所有这些研究和我们自己获得的AgNPs的细胞毒性浓度不同，可能是因为AgNPs的合成来源不同，大小和形态结构不同。

4.结论

洋蓟(Cynara scolymusL.)是一种除了可食用部分不能使用的植物，会产生大量的农业废弃物。我们用一种简单、经济、环保的方法合成了AgNPs，将这些垃圾转化为人类生活的有用领域。我们用UV-vis对得到的AgNPs进行了表征。,FTIR, SEM, TEM, EDX, XRD, and zeta potential analysis data. According to the results of the XRD analysis, the average nanosize was calculated to be 28.78 nm. As can be seen from the SEM images, it was determined that the silver nanoparticles were spherical, and the AgNPs averaged 10.59 in the TEM analysis. It was determined that AgNPs showed antimicrobial effects at low concentrations such as 0.03-0.25 μ克/毫升。重要的是检查和确定AgNPs作为抗癌和抗菌药物的毒性作用。检测了AgNPs对U118、HDF、CaCo-2和Skov-3细胞株的细胞毒作用。我们确定浓度为25时，对癌细胞株的抑制率约为50%μg/ml。可通过开发方法步骤来提高这些速率。它可以满足抗菌剂和抗癌剂的需求。

数据可用性

所有用于支持本研究结果的数据均包含在本文中。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者非常感谢Mardin Artuklu大学为开展这项研究提供了所有必要的研究设施。

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