利用药用植物合成绿色铜纳米颗粒牙鲆(牙鲆)Gmel。叶子提取物:抗菌性能

摘要

首次利用埃塞俄比亚本土药用植物研究绿色铜纳米颗粒(g-Cu NPs)中的植物成分对增强纳米颗粒抗菌性能的协同影响。我们报道了铜NPs的绿色合成牙鲆(牙鲆)Gmel。叶提取物。采用UV-visible、UV-DRS、FT-IR、XRD、SEM、EDXA、TEM、HRTEM和SAED等技术对所合成的g-Cu NPs进行了表征。最大吸光度, ，由于表面等离子体共振，g-Cu纳米粒子的波长为403 nm。能源缺口,，为2.19 eV。傅立叶红外光谱证实了黄芩叶提取物中多酚类、单宁类和苷类物质的存在Hagenia abyssinica．光谱波段在740厘米处^－1是铜与萃取物生物分子相互作用的特征。XRD分析表明，g-Cu NPs具有更强的结晶性。扫描电镜和透射电镜显示，铜颗粒为球形、六角形、三角形、圆柱形和不规则形状。通过ImageJ分析发现NPs的平均粒径为34.76 nm。EDX分析证实了g-Cu NPs中铜的存在。此外，g-Cu NPs的SAED图形呈现出铜及其氧化物的4个主要平面的同心圆图形。实验与计算 -其中一个晶面(111)的间距值分别为0.2432 nm和0.2444 nm。的 -0.2444nm和0.2040nm的间距值对应d₁₁₁铜₂o和D.₁₁₁分别为Cu晶格条纹。进行了抗菌试验大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌表现出12.7、12.7、14.7和14.2 mm的良好抑制区，证明了g-Cu NPs作为治疗被测病原菌引起的感染性疾病的潜力。

1.介绍

金属纳米颗粒在自然界中是多功能的，它们已广泛用于各种行业和药物部门，包括药物递送，癌症治疗，废水处理和DNA分析，作为抗菌剂和生物传感器以及太阳能发电和催化。已经提出了金属纳米颗粒的绿色合成作为化学和物理方法的成本效益和环保的替代品。近年来，由于其在行业和医学中的应用，铜纳米粒子（Cu NPS）引起了研究人员的许多关注。然而，其他纳米颗粒，例如铂，金，氧化铁，氧化硅和镍，并且在研究中没有显示出杀菌作用大肠杆菌［1］.

由于植物中存在大量的生物活性化合物，许多植物部分或整个植物已被用于铜NPs的绿色合成。植物提取物已被有效地应用于这一目的。Cu NPs的合成已经成功地从植物的不同部分提取，包括菲尼卡·腊饭剥 [2]，Zingiber Officinale.干细胞(3.]，柑橘Linn》。(Idilimbu)汁4]，Ziziphus Spina-Christi（L.）Willd水果(5]，芦笋adscendens Roxb。根和叶子[6]，墨旱莲prostrata叶(7]，银杏林叶(8]，Plantago asiatica叶(9]，胸腺寻常的L (10，红茶[11]，榄仁树属catappa叶(12),而Azadirachta indica叶(13］.

纳米铜抗菌效果的研究大肠杆菌和枯草芽孢杆菌揭示了与银纳米颗粒相比表现出优异的抗菌活性的事实。Cu NPS展示了良好的抗微生物影响芽孢杆菌抑菌作用显著青霉菌。微生物。Cu NPs表现出更强的抑制作用大肠杆菌相比,肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌，Propionimibacterium Acnes.,Salmonella Typhi.．铜NPs已经通过使用世界各地发现的各种植物的提取物来合成[14］.但迄今为止，还没有进行过使用埃塞俄比亚药用植物提取物来绿色合成铜NPs的研究。

因此，本文提出了利用埃塞俄比亚药用植物提取物合成绿色Cu NPs (g-Cu NPs)的研究方向。埃塞俄比亚95%以上的传统医药制剂来自植物。埃塞俄比亚的一种药用植物被鉴定为在水介质中生物合成g-Cu NPs牙鲆(牙鲆)Gmel．

牙鲆(牙鲆)Gmel的成员蔷薇科科，是一种开花植物，原产于非洲中部和东部的高海拔非洲山脉地区，从苏丹和埃塞俄比亚。它在英语中被称为非洲红木和东非红木，在阿姆哈拉语中被称为kosso。Hagenia abyscsinica是一种细长的树，可达20米高，树干短，树枝粗。根和肉一起煮，汤用来治疗一般疾病和疟疾，而干枯的雌性花序被用作驱虫药(特别是对绦虫)。树皮可以被捣碎，加入冷水和液体饮用，作为治疗腹泻和胃痛的药物。一般来说，这是一种烈性药物，不能大量服用;它有时被当作一种流产药[15］.

本研究的目的是合成g-Cu NPs牙鲆(牙鲆)Gmel，药用植物叶提取物。这种药用植物的生物活性化合物与铜NPs的结合被认为对各种疾病都非常有益。这种绿色的合成方法是为了避免在化学合成过程中使用具有还原剂和封盖剂作用的有毒化学物质。采用UV-visible、UV-DRS、FT-IR、XRD、SEM、EDXA、TEM、HRTEM和SAED等技术对生物合成的g-Cu NPs进行了表征。g-Cu NPs对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌性能也得到了评价。本文综述了g-Cu NPs的合成及其抗菌活性，并对其在生物医学领域的应用前景进行了展望。

2.材料和方法

2．1．材料和试剂

所有化学物质(Cu(NO_3.）₂h·3₂O、乙醇、Muller琼脂溶液、二甲基亚砜DMSO)均为分析级(购自默克化学工业公司)，未经进一步纯化使用。

2.2。植物材料的收集和认证

牙鲆(牙鲆)Gmel。在进行实地调查后，收集了埃塞俄比亚南部奥罗米亚州Wondo Genet农业研究所的植物叶片。

研究中心的坐标是n7^°531.509638°E 3754.7284和N 7°535.512838°E 3759.0304 ．植物的特性牙鲆(牙鲆)Gmel。(代码EB002)由埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴大学植物标本室生物学系国家植物标本室的植物分类学家鉴定。

2.3。植物叶提取物的制备

的叶子Hagenia abyssinica用自来水反复清洗表面，然后用蒸馏水去除灰尘颗粒，然后在阴影下晾干15天，以去除叶子上的水分。干叶子先用研磨机磨碎，然后装在棕色的瓶子里。提取方法是将20 g海参叶粉末放入500 ml的锥形烧瓶中，再加入400 ml去离子水。后来在烧瓶上盖上铝箔，以防止光线的影响。然后，用机械振动筛摇动混合物90分钟，然后在磁力搅拌器上以50°C加热1小时;然后让它在一夜之后冷却到室温。将配制好的溶液用Whatman 1号滤纸过滤，得到澄清溶液。滤液保存在4℃，以备后续实验。

２.４.铜NPs的绿色合成

A 0.2 M Cu(NO_3.）₂h·3₂O溶液准备好并储存在棕色的瓶子里。将100 ml植物叶片提取物与400 ml 0.2 M Cu(NO_3.）₂h·3₂O溶液(1:4)慢慢滴，不断搅拌。

将混合物在室温下孵育24小时。定期检查颜色变化（30分钟后60分钟）。从蓝色到浅褐色的颜色变化目视显示Cu nps的形成，然后，将溶液以10000rpm离心15分钟。获得的G-Cu nps（图1)用去离子水和乙醇洗涤以去除杂质。之后，将这些NPs晾干并研磨，以便用于进一步分析。

2.5。特征技术

用岛津公司的UV-2600紫外可见分光光度计记录样品在200-800 nm范围内的紫外可见吸收光谱和反射光谱。紫外-可见光谱是通过透射光谱来测量的，而紫外- drs专门指漫反射光谱。将新制备的植物提取物溶液与Cu溶液适当稀释后混合，制备出Cu纳米颗粒溶液。仪器扫描波长在200 ~ 800 nm之间，记录吸光度谱，并收集纳米颗粒溶液对空白提取液的吸光度。使用KBr颗粒在400-4000 cm范围内记录傅立叶变换红外光谱(FT-IR) (65 FT-IR PerkinElmer)⁻¹［16］.采用x射线衍射(XRD-Shimadzu x射线衍射仪)(PXRD-7000)分析技术揭示了g-Cu NPs的结晶性质。采用能量色散x射线扫描电镜(SEM-EDX-EVO 18低真空模型和ALTO 1000低温吸附)和高分辨率透射电镜(JEOL JEM 2100 HRTEM)研究了g-Cu NPs的形态和结构特征。采用Gatan数字显微摄影软件进行评价 -格子条纹的间距值。通过使用imagej应用来计算粒度。

2.6。抗菌素评价方法

的在体外采用琼脂圆盘扩散法评价g-Cu NPs的抗菌活性[17]以对抗选定的两种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)及两种革兰氏阴性致病菌(大肠杆菌和铜绿假单胞菌）.微生物菌株从帕斯特研究所获得。抑菌活性测试前，将菌株在营养液中培养24小时，以获得被测菌的对数生长期。生长旺盛的细菌培养物 接种/扩散到Muller Hinton琼脂(MHA) [18］.提取液为1mg /ml(溶解于二甲基亚砜中)。将Whatman滤纸盘按直径6毫米打孔，浸渍溶解的提取物，然后放置在MHA表面。阳性对照为氨苄西林盘，阴性对照为DMSO。37℃孵育24小时。抑菌活性根据抑制带进行评估，测量并使用尺子以毫米为单位记录。

3.结果与讨论

３．１．g-Cu NPs的合成

以硝酸铜为前体，植物叶提取物为还原剂和封盖剂，合成了g-Cu NPs。从视觉上看，从蓝色到浅棕色的颜色变化表明铜NPs的形成。将g-Cu NPs用去离子水和乙醇洗涤，去除任何多余的颗粒。之后，g-Cu NPs被干燥并磨碎(图)1）和后来进行各种表征方法。

在植物化学筛选过程中证实了酚类化合物、单宁和不同的苷类化合物的存在牙鲆(牙鲆)Gmel。叶提取物。筛选的细节如表所示1．人们可能认为，酚类化合物等生物活性化合物作为配体与金属离子结合，使其还原并包裹形成纳米颗粒。这些配体还作为粒径控制器，如早期研究人员所报道的[19］.

的主要组件Hagenia abyssinica提取物有酚类化合物、单宁、蒽醌苷、心苷[15］.多酚类化合物的抗氧化性能主要是由于它们具有很强的螯合金属的倾向。酚类化合物含有羟基和羧基，它们非常容易与金属离子结合。溶液中的金属离子与多酚化合物相互作用，有助于Cu NPs的成核和形成[20.］.

３.２．g-Cu NPs的表征

采用UV-visible, UV-DRS, FT-IR, XRD, SEM, EDXA, TEM, HRTEM和SAED技术对g-Cu NPs进行了表征。

3.2.1之上。紫外可见光谱分析

记录了g-Cu NPs的紫外-可见吸收光谱403中所示2(一个)［21.］.

这个吸收带基本上是由于g-Cu NPs的表面等离子体共振。用该方法对合成的Cu NPs进行分析后，也得到了类似的结果最大圣秘叶提取物(22.］.表面等离子体吸收基本上取决于NPs的大小，因此，每个研究人员的报告都不一样对不同植物提取物合成的NPs的价值。同样，记录了紫外-可见漫反射光谱(图)2 (b)）.g-Cu NPs的带隙能用Tauc图计算，如图所示2 (c)利用Kubelka-Munk函数在反射光谱中获得的数据。带隙能量， ，发现G-Cu NPS是2.19eV。

3.2.2。XRD分析

g-Cu NPs的XRD衍射图如图所示2 (d)．在图样中观察到的峰在 ，44.68°和64.37°分别对应Cu NPs面心立方结构的(111)、(200)和(220)晶格面，衍射数据与ICSD号文件吻合较好。04 - 0836 (23.］.

3.2.3。FT-IR光谱分析

红外光谱显示，g-Cu NPs的峰位于3351、3284、2920、2350、1720、1625、1342、1160、1058、740和590 cm处^－1(图3.）.在这些指示峰中，在3351 cm处观察到g-Cu NPs的宽吸收峰^－1和3254厘米^－1表示存在高浓度的醇，胺有O-H伸长和N-H伸长。

强烈的峰值显示在2929.0厘米处^－1和2890.6厘米^－1对应于-CH的不对称碳氢伸缩₂和ch_3.组,分别。大气中CO的存在₂导致了一个位于波数为2350厘米处的伸缩振动⁻¹．研究还认为，海参叶提取物中存在的胺和羧酸基团是导致蛋白质与铜表面结合的原因，从而导致生物合成纳米颗粒的稳定。

吸收峰在1720厘米处^－1和1625厘米^－1表示C = O和C = C弯曲模式的存在。峰值表示1350厘米^－1显示酰胺的C-N伸缩。中峰在1160厘米处^－1对应于酚类化合物的C-O伸缩。C-O-C拉伸出现在1058厘米处^－1．590处的最后一个峰对应于碳氢键的弯曲振动模式。傅立叶变换红外光谱分析结果证实了黄芩中多种植物化学成分的存在牙鲆(牙鲆)Gmel．叶提取物，如酚类物质、单宁和参与g-Cu NPs合成的蛋白质[24.］.除此之外，Cu nps的FTIR光谱显示了与宽带为中心的宽带为中心的峰值^－1这代表了一个特征峰，被认为是铜与萃取物生物分子相互作用的结果。

3.2.4。SEM-EDAX的形态学和组成分析

合成的g-Cu NPs的尺寸和形状如图所示4(一)和4 (b)［25.］.SEM图像也显示了颗粒在形状和尺寸上的不均匀性。显微照片中发现了所有可能的球形和不规则形状，如截断的六角形、圆柱形、三角形和棱柱形的不同颗粒大小的铜纳米颗粒[26.］.Cu NPs的平均晶粒尺寸在10-50 nm范围内。似乎发现，由于高的表面面积，形成中等大小的颗粒，颗粒中度聚集。用EDAX分析研究了NPs的化学组成。数字4 (c)显示了g-Cu NPs的EDAX谱。Cu、C、O元素对应的峰被清晰地识别出来，没有额外的峰出现，这说明合成的NPs纯度高，这与XRD研究一致。

也有可能认为，C和O的存在基本上来自于封接的生物活性化合物。此外，NPs表面很少的铜原子可能被氧化生成少量的CuO和Cu₂O.含有表面羟基的植物萃取物的生物分子促进了铜离子还原为Cu NPs。

3.2.5。透射电镜、HRTEM和SAED分析

为了进一步了解g-Cu NPs的形貌、尺寸和结晶性质，使用了TEM、HRTEM和SAED分析。合成的g-Cu NPs的HRTEM图像(图5)表明，合成的NPs大多为球形，但形状不同。小到10 nm的NPs证实了生物活性成分的有效作用牙鲆(牙鲆)Gmel．植物提取物，用作封盖和稳定剂。否则，NPs将会以拉长的形式聚集形成更大的NPs [5］.

此外，g-Cu NPs的大小变化可能是由于多酚化合物的存在(来自牙鲆(牙鲆)Gmel这种物质具有很强的吸引力，能将微粒聚集在一起。

TEM显微图显示了非常精细的g-Cu NPs，具有球形、圆柱形、棱柱形、六角形、三角形和接近球形的形状5(一个)- - - - - -5 (d)．

与ImageJ应用程序确定的平均粒度为34.76nm的14.4nm至43.1nm的所有这些附近的球形颗粒。如图所示，平均粒度为34.76nm。如图所示6(一)和6 (b)．

g-Cu NPs的SAED模式(图6（c）)包含六个点，每个点对应于特定的水晶面。其中一个平面用 -0.2444 nm的间距如图所示6（d）．

具有放大晶格条纹的g-Cu NPs的HRTEM形貌、IFFT图形和IFFT剖面 -指定平面的间距值(图6（d））如图所示7（a）- - - - - -7（c）,分别。通过分析得出结论 -用Gatan数字显微摄影软件进行了间隔值的计算，得到了一个较好的结果值为0.2444 nm。

的 -g-Cu NPs的SAED模式中描述的所有点的间距值(图6（c）)列于附表2．SAED图案上的每个点都对应于一组特定的晶格平面。g-Cu NPs的XRD谱如图所示2 (d)在纯Cu (ICSD号)fcc结构中，发现了3个主要峰，分别对应于(111)、(200)和(220)面。04 - 0836)。的 -从点1到点6的衍射面间距值: ， ， ， ， ，和 ，是否同意 -CuO (ICSD号。48 - 1548, tenorite-C2 / c)、铜₂“没有。05-0667, cuprite- pn - 3m)和Cu (ICSD号)。04 - 0836)的结构。在最近的研究中也报道了类似的结果[27.］.

估计 -Cu NPS表面的晶格条纹的间距值为0.2444nm，与...相当fcc结构Cu的(111)面值₂O.可以得出结论，NPs表面的铜原子很少可能与空气反应形成氧化物Cu₂O和措。

３．３．抗菌活性

通过使用叶子提取物合成的G-Cu NP牙鲆(牙鲆)Gmel。对所有测试病原体均表现出广泛的抗菌活性:大肠杆菌，假单胞菌铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌抑菌带分别为12.7、12.7、14.7和14.2 mm3.）.铜纳米颗粒已证明具有良好的抗菌活性[28.］.由此可见，g-Cu NPs对革兰氏阳性菌的抑制作用强于革兰氏阴性菌，这可能与细菌细胞壁结构的差异有关。NPs的抗菌活性可归因于NPs表面存在生物活性化合物作为盖帽和稳定剂。在这方面，这项活动是明显反对的年代．金黄色葡萄球菌与标准抗生素氨苄西林相比。g-Cu NPs的最高抑制区(mm)为S.金黄色葡萄球菌抑菌率为14.7 mm，抑菌率最低(mm)铜绿假单胞菌细菌为12.7 mm。宽阔的禁忌区域(图8)的g-Cu NPs抗病原体证实了其作为治疗被测细菌病原体引起的传染病的巨大潜力。

此外，标准圆盘氨苄青霉素显示出与g-Cu NPs相当的抑制区，这是小的，这可以归因于细菌对氨苄青霉素的耐药性的发展。

使用g-Cu NPs获得的抗菌结果被发现比许多研究人员早些时候报道的工作更好(见表)4）.g-Cu NPs对细菌的最高抑制带(mm)为14.7 mm，远高于表中所述的各种植物提取物合成的Cu NPs的抑制带4．证明了最后两种植物提取物表现出较高的抑制区，其可归因于不同类型的植物植物组合物。因此，可以得出结论，Cu nps与生物活性化合物如单宁和糖苷的协同效应牙鲆(牙鲆)Gmel。叶提取物被证明对病原菌有益。

以往的研究人员已经报道了许多抗菌作用的机制;因此，g-Cu NPs对细菌的作用还有待进一步研究。假设g-Cu NPs吸附在细菌细胞壁上，并与细胞膜内的电负性元素相互作用。这导致代谢失败，从而导致细菌转录的干扰和中断，从而导致g-Cu NPs的抗菌活性。近期研究人员认为，g-Cu NPs与提取物生物活性化合物的协同作用可能对抑制致病菌的活性起着重要作用[29.］.

DNA分子的螺旋结构可能被Cu NPs的作用所破坏。此外，Cu NPs与释放的Cu金属离子相互作用时，膜上的电化学电位上升，影响了膜的完整性。

4.结论

利用药用植物成功合成了绿色铜纳米颗粒牙鲆(牙鲆)Gmel。叶提取物。在g-Cu NPs形成过程中，单宁多酚等植物成分的存在在还原和封盖剂中发挥作用。紫外-可见吸收光谱和反射光谱显示403nm和分别为2.19 eV，证实了g-Cu NPs的形成。傅里叶变换红外光谱支持盖帽剂在g-Cu NPs表面的存在。通过XRD谱和EDX谱分别确定了g-Cu NPs的结晶性质和组成。SEM和TEM为g-Cu NPs的纳米形貌提供了足够的证据，g-Cu NPs具有各种可能的形状，包括球形、三角形、六角形和圆柱形，平均粒径为34.76 nm。HRTEM和SAED图证实了Cu和表面氧化Cu的存在₂O NPs。g-Cu NPs对病原菌的广泛抑制范围证实了其作为治疗被测病原菌引起的传染病的巨大潜力。综上所述，铜NPs与药用植物生物活性化合物的协同作用已被证实对病原菌有一定的拮抗作用。

数据可用性

用于支持本研究结果的[Excel]数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

由H C Anda Murthy编写的概念和实验是设计，进行的，并进行了稿件。Mebratu Kassa和Buzuayehu Abebe采用样品的表征。Tegene Desalegn参加了编制稿件。抗微生物测定由Temesgen Assefa进行。所有作者阅读并认可的终稿。

致谢

作者感谢阿达玛科技大学为开展这项研究工作提供的资金支持和实验室设施。这项工作由研究和技术转移办公室批准的项目(ANSD/04/0453/11-2018)资助，并由埃塞俄比亚Adama科学技术大学批准。

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