文摘

黄金/壳聚糖纳米复合材料合成和评估作为光照疗法治疗代理。金纳米粒子(Au NPs)与可控光学吸收近红外(NIR)地区由氯金酸和硫代硫酸钠的反应。这些粒子应用于癌症治疗,裸露的非盟NPs被涂上一层壳聚糖(CS)、O-carboxymethyl壳聚糖(cmc),和一个混合的CS和cmc在生理条件下利用率。表面性质、光学稳定性和光热光谱分析烧蚀效率对肝癌细胞(HepG2)和人类皮肤成纤维细胞(HDF)证明这些金纳米复合材料作为治疗剂有很大的潜力在体外测试。CS-coated纳米复合材料显示,最高效率的photo-ablation HepG2细胞,CS和cmc混合涂层粒子显示最好的癌症细胞和正常细胞之间的歧视。控制近红外光谱吸收,这些纳米复合材料的生物相容性的表面允许低功耗近红外激光激活和粒子注射小剂量的癌细胞治疗。

1。介绍

使用纳米粒子在生物医学领域(NPs)是纳米生物最重要的分支之一。许多生物医学应用程序需要较低的纳米粒子毒性、生物相容性、稳定性高的优先目标组织或器官中积累(1]。聚合物基纳米复合材料可能具有的独特性质优于聚合物或纳米粒子。金属纳米粒子与聚合物涂料或分散在聚合物矩阵显示增加稳定性,改善加工性能,再循环能力,在各种溶剂的溶解度2]。

金纳米粒子(Au NPs)在免疫测定(申请吸引了巨大的关注3,4,药5)、对比度增强和热疗治疗肿瘤(6- - - - - -8),由于其纳米级大小、脱氧组件,bioconjugation性质,生物相容性,独特的光学性质。

热疗,也称为高热,有几千年的历史作为肿瘤治疗的最重要的方法之一(9]。在这个技术,温和加热生成在目标地区,导致肿瘤选择性地破坏,由于减少了耐热性比正常组织(10]。在过去的几十年,因为许多新的加热能源,如射频(11,微波12),磁场(13),和激光(9了,在这一领域取得了巨大的进步。光照疗法(PT)在热疗是一种很有前途的领域,将激光技术和photoabsorbing代理。光吸收染料、化学敏化和固体光响应性纳米材料已被应用在PT photoabsorbing代理(9]。小金属纳米粒子,它们的光学特性主要由传导电子的集体振荡。一个吸收带的结果当入射光子频率共振与导带电子的集体振荡,这被称为表面等离子体共振(SPR) [14]。非盟NPs拥有强烈增强可见光和近红外光吸收,这是几个数量级比传统的发色团更强烈。不同在于,纳米结构与近红外光谱吸收了。金团簇(15],黄金nanoshells [7),金纳米棒(16],和黄金nanocages [17)的流行的纳米结构在光照疗法由于其强烈增强吸收在可见光和近红外光谱区域因SPR效应。

在我们的工作中,非盟NPs与近红外光谱吸收是由一步反应的氯金酸和硫代硫酸钠。他们的近红外光谱吸收波长以及控制通过调整HAuCl的摩尔比率₄/ Na₂年代₂O₃(18]。这些非盟NPs被涂上一层壳聚糖(CS),涂料,用作治疗代理光热光谱分析烧蚀的癌细胞。壳聚糖是一种biobased多糖是从虾、蟹壳(19]。它是无毒,可生物降解和生物相容性,具有良好的加工性能(20.,21]。与壳聚糖相关联的成本远低于其他聚合物涂料或化合物,例如,聚乙二醇(PEG)通常用于保护和稳定纳米颗粒被许多研究人员(5]。肝细胞癌是最常见的原发性恶性肿瘤的肝。它在全世界影响大于一百万的病人。我们liver-related癌症死亡占所有癌症的4%每年约20000人死亡。两anchorage-dependent细胞系,肝癌细胞系(HepG2)和控制人类皮肤纤维母细胞的细胞系(HDF)被选为这些新颖的激光烧蚀效率估计黄金纳米复合材料。疗效的评价是生活/染色图像光照消融后死了。这些黄金纳米复合材料显示强大的激光烧蚀能力和表面涂层成分起着非常重要的作用对某些癌细胞选择性。此外,这种复合材料提供了新的癌症治疗和可取的优势。在光学可调谐的黄金纳米粒子有效光转换成热量,chitosan-based涂料为应用程序提供可调的表面电荷在各种生理环境和pH值也允许进一步的修改与目标分子或药物分子通过化学反应或静电作用。

2。实验

2.1。金纳米粒子的制备

非盟NPs是由我们之前报道的方法(18,22]。硫代硫酸钠(Na, 3毫米₂年代₂O₃h·5₂O,奥尔德里奇,99.999%)的解决方案是添加到1.71毫米氯金酸(HAuCl₄h·3₂O,阿尔法蛇丘,非盟49.68%)解决方案所需的体积比为20秒在室温和涡混合均匀。实验中使用的所有的水被净化热科学Easypure II系统,电阻率为18.2 MΩ厘米。

2.2。羧甲基化壳聚糖的制备

低分子量壳聚糖(Sigma-Aldrich 50 MW - 190 K)用于非盟NPs的表面涂层。基于这一壳聚糖,O合成了羧甲基壳聚糖(cmc)的报道方法(23,24]。短暂、15克氢氧化钠溶解在20:80去离子水和异丙醇的混合物在500毫升瓶(100毫升)。10 g壳聚糖加入烧瓶膨胀和碱化50°C 1 h。15 g一氯醋酸(ClCH₂有限公司₂H, 99%,在穿越有机物)在20毫升异丙醇溶解,添加到反应混合物在30分钟一滴一滴地,反应剧烈搅动下4 H则高达55 -°C。加入200毫升80%酒精停止反应。产品被反复过滤和冲洗80%酒精,淡化和脱水,直到清洗溶液的pH值小于8.0。最后,产品是真空干1天在40°C。

2.3。非盟NPs与壳聚糖的制备和净化涂料

储备溶液分散壳聚糖制备的壳聚糖(1 g)在0.7%醋酸溶液(100毫升)。cmc的解决方案是由直接溶解cmc在100毫升(1 g)去离子水。CS和cmc的解决方案被离心纯化的1000 rpm 10分钟,去除小数量的不溶性残差,然后是透析(光谱透析膜,MWCO 3 KDa) 2天。chitosan-coated盟NPs (Au / CS), cmc涂布盟NPs (Au / cmc)和CS和cmc混合涂布盟NPs (Au / (c + cmc))是由,分别添加CS溶液,cmc溶液,或CS和cmc混合解决方案(CS和cmc的解决方案是预拌)一滴一滴地进入as-synthesized黄金粒子悬浮液,与激烈的搅动。CS之间的比率或cmc盟NPs控制为0.2毫克CS或cmc / OD盟NP悬挂和CS和cmc掺合盟NPs(0.15毫克CS + 0.05毫克cmc) / OD盟NP悬挂光密度(OD)。那么这些样本集在摇床上躺了一天。最后金纳米复合材料悬浮液被离心浓缩和分离的解决方案在1000 g 20分钟。这个步骤将删除解决方案和额外的壳聚糖的副产品。然后离心机颗粒分散在消毒去离子水25 OD /毫升的浓度和储存在4°C的后续研究。

2.4。描述的非盟NPs

非盟的光学吸收NPs被紫外可见分光光度计测量(Cary-50Bio,瓦里安)。Zetasizer (Nano-ZS90莫尔文)被用来评估纳米颗粒悬浊液的表面电荷。一个范Tecnai + 30透射电子显微镜(TEM)在200千伏被用来确定非盟NPs的形态。几个盟NPs悬浊液,有不同的近红外光谱峰值波长精心准备了photo-induced温升测量。1毫升的非盟NP悬浮液添加到井的细胞培养板(多井,Primaria 24),与1 OD /毫升的浓度。与817 nm激光中心波长由FAT-System(相干,CA)是照在黄金悬挂。的激光点具有相同的区域,和激光的力量被固定为1 W /厘米²。红外温度计(CSmicro、Optris GmbH德国)检测非盟NP悬挂固定的温度10厘米以上的媒体。

2.5。光热光谱分析烧蚀研究

所有的细胞系都写明ATCC(马纳萨斯,MA)获得。人类皮肤成纤维细胞细胞系(HDF,写明ATCC: pc - 201 - 012男源)和肝细胞癌细胞系(HepG2,写明ATCC: 59194)被播种在单层融合,以便更容易染色后细胞计数(在15章节)。所有的细胞培养在37°C公司5%₂环境在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)补充4毫米谷酰胺,青霉素1%,10%胎牛血清。激光烧蚀实验之前,细胞脱离文化与胰蛋白酶(0.25%)和resuspended flash DMEM媒体和注入24-well细胞培养板(多井,Primaria),培养36-48小时达到融合。激光烧蚀进行了基于描述的方法(7]。细胞培养与1毫升DMEM媒体包含1 OD盟NPs 2 h获得非盟NPs在细胞的绑定。对于这个实验,非盟NPs和黄金/壳聚糖纳米复合材料准备与近红外光谱吸收范围的820 nm - 850 nm,接近激光源的波长。媒体被移除,细胞被冲洗0.5毫升PBS缓冲,其次是增加0.5毫升新鲜的媒体文化井。接下来,细胞暴露在817 nm近红外激光在优化条件(5 W /厘米²,2分钟)。一夜之间,孔板被孵化后光照治疗和生活/死染色(表达载体,卡尔斯巴德,CA)是执行,和荧光图像获得和分析。图片拍摄与尼康D90相机Accu-Scope 3032绿色/红色荧光显微镜,分别手动和细胞的人数统计。

3所示。结果与讨论

3.1。制备金纳米粒子与期望的近红外吸收

在我们以前的工作(18,25),开发一个方便的方法合成非盟NPs与可控的近红外光谱吸收。盟NPs的一步反应合成了氯金酸和硫代硫酸钠,没有援助的附加模板,限制试剂或种子大会。纳米粒子的合成产品由不同的形状和大小包括小球形胶体金颗粒(< 5 nm)和nonspherical黄金水晶。nonspherical黄金水晶主要是截断八面体,五角大楼,和立方八面体,以及三角形形状的板结构(18]。两个吸收峰由于表面等离子体共振是观察从这些样本。第一SPR高峰集中在530纳米左右的characteristicSPR球形胶体金颗粒,而第二SPR组件是高在近红外波段,这是归因于nonspherical盟的多极SPR乐队NPs (18,25]。由于近红外光谱吸收波长随着HAuCl摩尔比的增加而增加₄/ Na₂年代₂O₃、调整HAuCl的摩尔比率₄/ Na₂年代₂O₃在反应控制非盟NPs的吸收波长。这些产品被离心去除进一步纯化的球形胶体金颗粒,提高近红外光谱吸收。数据1(一)和1 (b)是Z-contrast茎as-synthesized盟NPs的图像和同一批次样品与离心纯化。净化产品具有近红外光谱吸收波长为820 nm。近红外光谱吸收盟NP悬挂的温度引起的近红外激光辐射是影响纳米粒子的浓度,激光功率,曝光时间,吸收波长的非盟NPs (26]。图2比较非盟NPs悬浮液的加热效应与近红外光谱峰值在820海里,880 nm、980 nm和1070 nm,分别(插入图)显示在817 nm波长激光二极管(1 W /厘米²)风险敞口。3分钟后,温度达到50.8,48.2,46.4,和41.2°C的粒子波长波长从低到高,分别。黄金样品的近红外光谱更接近峰值波长的激光源显示最佳加热效果。近红外光谱吸收的有效控制金纳米粒子的匹配的波长激光源增强了高热治疗。与此同时,近红外光谱波长被认为是最好的光源光照疗法,因为它是最小吸收水和血红蛋白的正常组织组件,可以传输深入体内。

3.2。在金纳米粒子Chitosan-Based涂料

壳聚糖是一种阳离子多糖D-glucosamine N-acetyl-D-glucosamine和已被证明是一个高度生物相容性材料和抗菌特性。改善其溶解性或实现新的功能,进行了化学修饰的壳聚糖和许多衍生品已经被合成。例如,修改可以通过羧化作用合成壳聚糖羟基或胺组的结构(20.),导致O羧甲基壳聚糖或N羧甲基壳聚糖。O羧甲基壳聚糖是通过替换的部分-哦与ch其他氨基葡萄糖单元的位置₂羧基。因此,羧基等活性配体和北半球₂组织服从化学功能。人都有国民生产总值与壳聚糖的稳定。在壳聚糖溶液中带正电的质子化了的,它可以吸附在金纳米粒子的表面,稳定和保护纳米颗粒27- - - - - -29日]。As-synthesized盟NPs呈现强烈的负表面电荷(约40−mV)允许涂在金表面正电荷壳聚糖紧密通过静电相互作用。

数据3(一个),3 (b),3 (c),3 (d)显示高分辨率透射电镜图像的非盟NPs没有涂层,Au / CS,非盟/ cmc和非盟/ (c + cmc)纳米复合材料,分别。as-synthesized光秃秃的盟NPs拥有1 - 2纳米薄层表面。非盟NPs,数据比较3 (b)- - - - - -3 (d)显示chitosan-based涂料黄金NPs均匀有效地覆盖,形成了一个2 - 5 nm厚层表面上的黄金。

表1列出了水动力直径和金纳米粒子的表面电荷与不同chitosan-based涂料在水里。chitosan-based涂层显著改变了金纳米粒子的表面性质。裸露的金纳米粒子的平均粒径是36海里;被涂上聚合物后,非盟的水动力直径/ CS,非盟/ cmc和非盟/ (c + cmc)达到290,236,和262海里。与此同时,其表面电荷变化从−43.5 + 43.8 mV,分别为+ 20.2,+ 24.3 mV。

图4显示了非盟的光学稳定NPs与不同的涂料在PBS和1 wt %氯化钠溶液。由于生理盐度是接近1%,光学性质的非盟NPs在这些解决方案模拟。光学稳定性监测光吸光度测量的非盟NPs在近红外光谱的峰值波长作为时间的函数。这些纳米颗粒在PBS和氯化钠溶液也有类似的行为。CMCS-coated粒子显示最高的稳定,没有明显减少的光学吸收3 h。CS和cmc混合涂层粒子也显示良好的稳定性,其吸光度下降不到10%。最不稳定粒子的非盟NPs。在盐水环境中其吸光度下降超过70%。非盟/ CS纳米复合材料比光粒子更稳定,但稳定低于非盟NPs与cmc组件涂层。近红外光谱吸收的减少裸露盟NPs结果从颗粒间的耦合效应30.,31日),其稳定表层干扰由于离子强度高,导致粒子聚合(不可逆转的合并)。这种行为可能会大大减少光热光谱分析烧蚀的效率。Chitosan-based涂料大大提高光学非盟NPs的稳定。Au / CS NPs主要结果的不稳定粒子的沉降引起的结块(可逆的聚结)的壳聚糖涂层。在上面的pH值6,壳聚糖的溶解性变得更糟。cmc的溶解度最好在所有pH值范围除了isoelectrical点(23]。良好的溶解性和增加链的灵活性(32cmc可以预防的耦合效应和粒子的沉降。

通过调整表面组件,非盟的表面电荷NPs可以修改。图5显示了非盟的电动电势NPs与不同的壳聚糖涂层pH值的函数。非盟的等电点(iep) / cmc,非盟/ (c + cmc),和非盟/ CS纳米复合材料是6.1,7.1,和7.7,分别。IEP的cmc接近值(5.5)报道了赵et al。33]。cmc礼物胺和羧酸团体在其结构。在解决方案,组织向离子状态,和首席运营官⁻分别提高了cmc的溶解度。只有在其IEP的数量等于首席运营官的⁻,导致溶解度的死亡。盟/ CS粒子显示IEP价值远高于非盟/ cmc粒子,由于CS只介绍了带正电的组。这个等电位点非盟/ (c + cmc)粒子是7.1,这些之间的非盟/ cmc和非盟/ CS。这表明表面电荷的非盟NPs壳聚糖可以通过调优的组件表面,由于cmc具有比CS带负电荷的特点。

3.3。光照的消融HepG2细胞

数据6和7的生活/死染色图片HDF HepG2细胞暴露在817海里后近红外激光在5 W /厘米²,2分钟。生活/死染色提供了一个双色荧光测定细胞生存能力基于等离子体膜透性,可靠和定量区分死细胞和生活。活细胞显示绿色和死细胞显示红色。统计细胞死亡比例的HDF细胞和HepG2细胞计数活/死染色图片如图8。

没有与非盟NPs孵化,细胞没有表现出明显的烧蚀激光辐照后5 W /厘米²2分钟,如图6 (b)和7 (b)。的非盟NPs没有显示明显的photo-destruction细胞系(数字6 (c)和7 (c)),由于颗粒间的耦合效应(31日]。非盟的相对较低的光热光谱分析烧蚀效率/ cmc NPs少可能是由于吸附在细胞膜(数字6 (e)和7 (e))。光热光谱分析烧蚀效率最高的是观察到的细胞治疗与非盟/ CS NPs。HepG2细胞几乎100%,90% HDF细胞被杀后,激光治疗(数字6 (d)和7 (d))。CS和cmc混合涂布黄金NPs现在有前途的结果:96%左右HepG2癌细胞被切除,HDF正常细胞死亡(数字不到30%6 (f)和7 (f))。光热光谱分析的非盟NPs消融的差异导致的密度非盟NPs吸附在细胞表面。带负电荷的细胞表面允许非盟/ CS NPs高度积累在细胞表面,和高密度粒子产生的热量,损害了HDF细胞HepG2细胞以及在激光辐射下。盟/ (c + cmc)粒子结合细胞表面均匀并生成合适的热量,这是高到足以杀死癌细胞但不足以损害正常细胞。这包括与激光烧蚀结果通过金奈米棒(16]。据报道,在暴露于持续的红色激光,恶性肿瘤细胞需要光照摧毁了大约一半的激光能量比非恶性的细胞(16]。

4所示。结论

黄金/壳聚糖纳米复合材料合成的光照疗法的应用。非盟NPs是由氯金酸和硫代硫酸钠的反应,他们有特定的近红外光谱吸收匹配的波长激光源。这些盟NPs被涂上一层壳聚糖或O-carboxymethyl壳聚糖以及混合。这些壳聚糖涂层保护的金纳米粒子,避免裸露盟NPs不可逆转的聚结和提高光学稳定性,使光照消融。表面电荷的非盟/壳聚糖纳米复合材料可以通过调整修改CS和cmc组件在金表面达到合适的绑定的非盟NPs在细胞表面。非盟/ CS纳米复合材料表现出高积累在细胞表面和现在的激光烧蚀效率最高。CS和cmc混合涂层允许非盟NPs统一绑定到细胞,显示出更高的癌症细胞和正常细胞之间的选择性光热光谱分析中消融。这些小说黄金/聚合物纳米复合材料有很大的潜力光照疗法,由于低剂量粒子注入,低功耗近红外激光辐射,快速消融。更广泛的临床相关性可以设想,比如乳腺癌治疗,皮肤癌症治疗,治疗食道癌,laryngocarcinoma癌症治疗。

确认

作者大大承认黛博拉西克曼博士和安德里亚Gobin帮忙实验和样品表征。研究支持由Wallance Coulter基础:职业生涯早期阶段1奖和医学院的夏季研究学者项目。