Surfactin C-15纳米肽的性质及其对人宫颈癌(HeLa)细胞的毒性作用

摘要

表面素是目前已知的最有效的生物表面活性剂之一。它是一种酸性环状非核糖体脂七肽，由枯草芽孢杆菌．在本介绍中，我们研究了Surfactin C-15的不同性质。通过扫描电子显微镜研究了具有各种离子强度的不同水性环境中的Surfactin C-15的纳米摩尔氏菌形成能力。通过FAR-UV CD光谱研究了Surfactin第二结构。其溶血活性和细胞毒性分别通过溶血和MTT测定来测量。Surfactin在蒸馏水中形成球形纳米钙以及在PBS缓冲液中的无定形纳米微粒．溶血化验结果表明HC₅₀surfactin为47μM. Surfactin C-15抑制人宫颈癌HeLa细胞株的生长，并以时间和剂量依赖性的方法使其IC₅₀16、24和48小时分别为86.9、73.1和50.2μM,分别。

1.介绍

由该属产生的表面素类脂肽芽孢杆菌是这些天然化合物中最重要的一类。具有较低的临界胶束浓度(CMC)、稳定的乳化性能和优异的起泡性[1］．表面活性剂是一种高效的生物表面活性剂枯草芽孢杆菌菌株。它是一种含有七个氨基酸的循环脂肽肽和aβ羟基脂肪酸。在水溶液中，表面素的肽环呈现“马鞍形”拓扑，这是因为它含有两个带负电荷的氨基酸残基l-Glu和l-Asp [2］．由于其两亲结构，它显示出独特的表面，界面和膜 - 活性特性[3.］．它还具有溶血、抗凝、抗菌和抗肿瘤活性[1那4.-6.cAMP磷酸二酯酶抑制[7.]和抗HIV特性[7.那8.］．这些活性与它们与酶、脂多糖等生物大分子的相互作用有关。表面活性剂的性质和生物活性在化妆品和医药领域的应用前景十分广阔。表面素是一种种类繁多的异构体，其不同之处在于其脂肪酸成分的长度和分支以及其肽环中的氨基酸替换[1］．该分子如何在各种生物事件中有效仍然很大程度上是未知的;然而，推测Surfactin的结构和亲脂性能可能影响生物膜的稳定性[9.］．随着对生物相容性纳米颗粒在医学上日益增加的应用的关注，考虑到目前活跃的研究领域也致力于研究生物表面活性剂在制药和生物医学科学中的应用，并知道表面素是最强大的生物表面活性剂之一[10.-15.]，在考察surfactin C-15的纳米粒化能力、二级结构、溶血活性等不同性质后，我们研究了其对HeLa细胞系的细胞毒作用。

2.材料和方法

2.1。材料

从Sigma获得Surfactin和3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴（MTT）。RPMI-1640，胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶-EDTA 5X购自Gibco，HeLa细胞系从伊朗牧师协会获得。

2.2。Surfactin第二结构研究

Surfactin的FAR-UV CD光谱记录在PBS（pH = 7.4）中。它由AVIV 215分光极管测量，不同浓度（20,40,60,240,500和766 μ米)25°C。波长范围在195 ~ 260 nm之间。

2．3.表面素纳米微粒的物理表征

用surfactin制备纳米胶束，将1 mg surfactin在1 mL蒸馏水(pH = 7.4)和1 mL PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH = 7.4)中，在30℃下超声15分钟。利用扫描电子显微镜(SEM, LEO1430VP)研究了纳米胶束的尺寸和形状。

2.4。红细胞制备

人红细胞(rbc)在2000 ×g离心分离。红细胞在PBS-EDTA中洗涤一次，在等渗缓冲液中洗涤三次(10 mM Tris, 150 mM NaCl，用HCl调整pH为8.5)。红细胞以5 × 10的细胞密度悬浮在缓冲液中^8. cells/mL [16.］．

2．5．溶血试验

850年μL等渗缓冲液加入到50μL的含共聚物的PBS溶液。100年μ加入红细胞悬液L，在25℃下反应30 min。然后用10000 ×g离心去除未改变的红细胞，并将上清液在540 nm处的吸光度与两个对照样品进行比较，以确定溶血率。第一组(100%)用蒸馏水完全溶血[16.]，第二个(0%)包含900个μl PBS加100 μ红细胞悬液的L。每次测试至少进行了两次。

2.6。细胞培养

在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养人宫颈癌Hela细胞系，在潮湿的细胞培养箱中培养含有10％胎牛血清，100u / ml青霉素，100u / ml链霉素和1％谷氨酰胺，其具有5％CO的气氛₂在37°C (17.］．

2.7。MTT试验

MTT法测定细胞活力。简而言之，3 × 10^6.细胞/孔置于24孔培养板中。过夜后，用不同浓度的surfactin(0、20、40、60和80)处理细胞μm）16,24和48小时。用50个细胞治疗细胞 μL的5 mg/mL MTT和生成的福马赞晶体溶解在DMSO (500μL)。在570 nm处测量每孔的光密度(OD)。每项测试都进行了三个重复的实验。表面素和表面素纳米颗粒对细胞活力的影响被评估为细胞活力的百分比，与载体处理的对照细胞相比，后者被任意分配为100%的活力[18.那19.］．

2.8。统计分析

所有的实验都是三次重复，并将数据的平均值与独立数据进行比较T.以及。一个值<0.05为有统计学意义。

3.结果

3．1.Surfactin第二结构研究

PBS中Surfactin C-15的CD光谱以以225 nm为中心的宽负带和195 nm处的最大峰为主(图)1)．测量Surfactin第二结构百分数(表)1)．

３．２．表面素纳米微粒的物理表征

用扫描电镜研究了表面活性剂C-15的胶束化能力。结果表明，蒸馏水中的纳米胶束呈球形，尺寸约为100 ~ 200 nm(图)2(一个))，而在PBS中纳米胶束形状为无定形，尺寸为100-400 nm(图)2 (b))．

3．3．溶血试验

在不同浓度的溶血活性中测试Surfactin C-15。结果在图中展出3.．它引起浓度依赖性溶血[10.］．HC₅₀它的定义是表面素的浓度使50%的红细胞爆裂[10.)是47μM。

3．4．MTT试验

为了研究SUSFACTIN C-15的细胞毒性效果，用不同浓度的SUSFACTIN C-15处理Hela细胞系16,24和48小时，然后通过MTT测定法测定细胞活力。Surfactin C-15在剂量和时间依赖的方法中停止了HeLa细胞系生长（图4.),集成电路₅₀在86.9,73.1和50.2的16,24和48 H处 μM,分别。

4.讨论与结论

在该研究中，扫描电子显微镜确定Surfactin C-15在不同的离子水溶液中表现出不同的方式。PBS中的Surfactin NanoMicelles显示出大和无定形聚集体的存在。这是由zou等人观察到的类似结果。[20.］．蒸馏水中的纳米素是球形的，与PBA中的纳米钙相比，尺寸较小，这导致蒸馏水和PBS中的不同离子强度。研究由Li等人进行。表明，当SUSFACTIN的酰基链长度降低时，低渗条件下的溶血活性降低[10.，在这项研究中，HC₅₀surfactin C-14的300μ根据我们的研究，HC₅₀Surfactin C-15是47 μ这与Li等人的研究一致。表面素被认为是一种潜在的抗肿瘤药物。近年来研究表明，表面素对肿瘤细胞的杀伤作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡，这与其酶活性有关。此外，某些脂肽的一些生物活性也与其对酶活性的影响有关。例如，表面素对胞质磷脂酶A2的选择性抑制作用有助于其抗炎活性。另一项研究表明，表面素对碱性磷酸酶的抑制作用归因于表面素肽段中Asp和Glu残基的游离羧基螯合作用[1］．虽然获得的结果显示surfactin C-15对HeLa细胞具有剂量和时间依赖性的细胞毒作用，但其抗癌作用还需要更多的研究来证实。还需要更多的研究来确定和阐明表面素的作用机制和抗增殖作用对癌细胞系靶向递送的影响。

参考文献

1. Liu X. Y. Liu, S. Z. Yang, B. Z. Mu，“synthesis and characterization of C15-surfactin-O-methyl ester by a lipopeptide Production and characterization .枯草芽孢杆菌HSO121。”过程生物化学，第44卷，第5期。10, pp. 1144-1151, 2009。视图:出版商网站|谷歌学者
2. 刘杰，邹安，穆博，“表面素对PC脂质体理化性质的影响”，胶体和表面，第361卷，第2期。1-3页，90-95页，2010。视图:出版商网站|谷歌学者
3. H. Kell, J. F. Holzwarth, C. Boettcher, R. K. Heenan, and J. Vater， "脂七肽表面素与l-脂质双分子层相互作用的物理化学研究α-dimyristoyl磷脂酰胆碱”,生物物理化学，第128卷，第128号2-3，页114-124,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
4. L. Rodrigues，I. M. Banat，J.Teixeira和R. Oliveira，“生物表面活性剂：医学中的潜在应用”，“抗菌化疗杂志(第57卷)4, 2006。视图:出版商网站|谷歌学者
5. P. Singh和S. S. Cameotra，“微生物表面活性剂在生物医学科学中的潜在应用”，生物技术的趋势，卷。22，没有。3，pp。142-146,2004。视图:出版商网站|谷歌学者
6. S. S. S. Cereotra和R. S. Makkar，“最近的生物活性剂作为生物和免疫分子的应用，”微生物学的目前的意见，第7卷，第5期3，页262 - 266,2004。视图:出版商网站|谷歌学者
7. M. Bortolato, F. Besson，和B. Roux，“表面素抑制碱性磷酸酶，一种天然螯合脂肽枯草芽孢杆菌”,生物技术字母，卷。19，没有。5，pp。433-435,1997。视图:出版商网站|谷歌学者
8. R. Maget-Dana和M. Ptak，“表面素与膜模型的相互作用”，生物物理期刊，卷。68，不。5，PP。1937-1943,1995。视图:谷歌学者
9. S. Y. Kim, J. Y. Kim, S. H. Kim et al.，“Surfactin来自枯草芽孢杆菌通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期和抑制存活信号，显示抗增殖作用。”2月的信，第581卷，第581期5，页865-871,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
10. “纳米粒子和纳米管的生物相容性和毒性，”李新宇，王磊，范勇，冯庆峰，崔飞，“纳米粒子和纳米管的生物相容性和毒性，”纳米材料杂志， 2012年第5期，文章编号548389,19页，2012。视图:出版商网站|谷歌学者
11. J. D. Desai和I. M. Banat，“表面活性剂的微生物生产及其商业潜力”，微生物学和分子生物学评论，第61卷，第47-64页，1997。视图:谷歌学者
12. 李晓霞，冯庆，崔飞，“磷酸钙显微结构对骨相关细胞的影响”，中华骨科学杂志，生物材料，第29卷，第2期23, pp. 3306-3316, 2008。视图:出版商网站|谷歌学者
13. Li X.， Liu H.， Niu X. et al.，“利用碳纳米管诱导人脂肪来源间充质干细胞体外成骨分化和体内异位骨形成”，生物材料33，页4818-4827,2012。视图:谷歌学者
14. S. K. Smart, A. I. Cassady, G. Q. Lu, D. J. Martin，“碳纳米管的生物相容性”，碳，第44卷，第5期。6，PP。1034-1047，2006。视图:出版商网站|谷歌学者
15. H. Abbasi, K. a. Noghabi, M. M. Hamedi et al.，“水介质中铜绿假单胞菌MA01分泌的单鼠李糖脂的物理化学特征。一项实验和分子动力学研究，”胶体和表面， vol. 101, pp. 256-265, 2013。视图:谷歌学者
16. S. Dufour, M. Deleu, K. Nott, B. Wathelet, P. Thonart，和M. Paquot，“新的线性表面素类似物的溶血活性与其物理化学性质的关系”，生物化学与生物物理学，卷。1726年，没有。1，pp。87-95,2005。视图:出版商网站|谷歌学者
17. Cao X.， A. H. Wang, R. Z. Jiao等，“Surfactin通过细胞周期因子调节诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和G2/M阻滞”，细胞生物化学和生物物理学，第55卷，第55期3，第163-171页，2009。视图:出版商网站|谷歌学者
18. C. D. Helganson和C. L. Miller，基本细胞培养方案，第290卷，人类出版社，2003年。
19. A.道尔和J. B.格里菲斯，细胞和组织培养。生物技术的实验室程序， John Wiley & Sons, 1998。
20. A. Zou，J. Liu，V.M. Garamus，Y.杨，R.Willumit，B.μs，“天然脂肽的胶束化活性[glui，Asp5] Serfactin-C15在水溶液中，”物理化学学报B，第114卷，第2期。8, pp. 2712-2718, 2010。视图:出版商网站|谷歌学者

版权

版权所有©2012 Zahra Nozhat等人。这是分布下的开放式访问文章创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。