半胱天冬酶3的比色检测活动和活性氧衍生品:潜在的热应力在珊瑚的早期指标

文摘

迫切需要开发和实现快速评估珊瑚健康允许有效的自适应管理沿海开发和全球变化的反应。现在有越来越多的证据表明,激活caspase-dependent细胞凋亡中发挥着关键作用在珊瑚白化和随后的死亡率。在这项研究中,一个“临床”的方法被用来评估珊瑚健康通过测量活动的半胱天冬酶3使用商业套装。这种方法最初是应用在诱导热漂白两种珊瑚,鹿角和Pocillopora damicornis。后者物种就选择接受进一步的研究结合氧化应激相关化合物的检测(过氧化氢酶活性、谷胱甘肽浓度)以及半胱天冬酶活性在压力和复苏阶段。黄藻光系统II (PSII)并行效率和细胞密度测量评估共生有机体的健康。我们的研究结果表明,珊瑚的半胱天冬酶3活动增加主机可以观察前检测到任何显著PSII的光化学效率降低藻类共生体和/或驱逐从主机。这项研究强调了潜在的宿主细胞凋亡蛋白酶3和活性氧清除活动强调个人珊瑚在殖民地的早期指标。

1。介绍

热带海洋生态系统基于scleractinian珊瑚是地球上最富有成效的和生物多样化的海洋生态系统(1]。他们的成功的核心是腰鞭毛虫的珊瑚共生藻类,Symbiodiniumsp。(也称为黄藻),住在他们的组织和为珊瑚提供所需的大部分能量(2]。珊瑚共生关系及其共生甲藻的能力在很大程度上解释了珊瑚建造珊瑚礁的框架,它作为其他数以百万计的物种的栖息地(3]。这个框架支持生物多样性,最终支撑旅游业,物质收集、和钓鱼在至少100个国家(4]。

珊瑚礁生态系统正在经历前所未有的下滑,在世界范围内,主要由沿海开发和全球变化5]。据估计,世界上27%的珊瑚礁已经失去,如果当前压力继续有增无减,近60%到2030年可能会丢失(6]。考虑到珊瑚礁生态系统服务(例如,每年38亿美元的大堡礁,(7]),珊瑚从热带海洋生态系统将会失去大量的社会和经济影响沿海人口。因此,迫切需要制定和实施快速评估珊瑚健康,以确保如果检测到压力时,可以采取措施干预一个自适应的方法。

当前珊瑚监测和评估协议通常涉及主要礁珊瑚覆盖和物种丰富度的调查揭示群落结构的变化通过生物个体的损失、人口和物种(8]。这些调查耗时,严重限制了他们无法实时珊瑚健康诊断和检测压力爆发之前,珊瑚死亡。这两个因素阻碍有效的干预和管理扭转衰退的轨迹。这种缺乏实时诊断工具很难开发活性和有效的管理政策,实践和实现策略(9]。

一个共同的世界各地的珊瑚礁退化发生通过漂白(即。,the disruption of the coral-dinoflagellate symbiosis), a process known to be primarily caused by elevated sea surface temperature. The variation in susceptibility to coral bleaching is commonly explained by the occurrence of different clades or subclades of symbioticSymbiodinium和他们不同的公差(热应力10]。然而,有越来越多的证据表明,珊瑚主机可以影响的敏感性coral-dinoflagellate组合强调通过调节一个大型阿森纳压力的蛋白质(11]。还存在家庭分裂的半胱氨酸蛋白酶在三个不同的亚科(发起者,刽子手,还存在细胞因子激活),通常存在于细胞不活跃的酶(12]。半胱天冬酶激活是触发细胞程序性死亡或凋亡在范围广泛的后生动物,人类从珊瑚(13,14),因此一个潜在的广泛指标在动物身上的压力。还存在在打还存在现有的,8、9、12和3已知关键角色在细胞死亡和凋亡过程中,被另一个裂解和激活在压力条件下(15,16]。这放大蛋白水解级联导致的最终破坏细胞的细胞死亡和细胞凋亡过程17]。这些机制,存在于所有的多细胞生物,扮演一个关键的角色在组织健康发展,增长,应对压力和病原体(18]。在珊瑚,启动细胞死亡已被证明发生在应对紫外线辐射或疾病,现在有越来越多的证据表明,激活caspase-dependent细胞凋亡中发挥着关键作用在珊瑚白化和随后的死亡率(19,20.]。

凋亡通路引发的原因之一是活性氧簇(ROS)的存在,作为细胞内信号转导(20.,21]。在压力条件下,ROS数量压倒抗氧化剂的能力来处理,导致氧化应激在活细胞22]。热应力破坏光系统II (PSII)共生体(23]ROS生产直接相关24- - - - - -27]。在健康的珊瑚和黄藻,ROS自然改变了抗氧化剂为更少的有毒成分(22]。

在人类医学、临床生物标志物用于诊断病人的状况和发展适当的治疗。细胞诊断是一个系统化的方法来定义根据他们的功能细胞内和细胞生物标志物确定细胞蛋白质/酶的活性变化可能反映了细胞的整体性能(28]。在这项研究中,我们开发了一个诊断珊瑚化验使用商用人类半胱天冬酶3检测设备。这个试验是用于检测细胞凋亡蛋白酶3的变化活动来衡量珊瑚主机健康在热应力两种造礁珊瑚,鹿角和Pocillopora damicornis。然后我们进行了进一步的调查Pocillopora damicornis期间,鉴于其明确的半胱天冬酶反应的初步研究中,详细检查其热应力,其次是经济复苏阶段。我们假设增加的ROS水平能被探测到的漂白前观察到基于共同认为氧化应激可以发起珊瑚白化。(27]。为了验证这一点,我们决定ROS-scavenging酶包括过氧化氢酶活性的变化(22),谷胱甘肽(27,29日),与半胱天冬酶3凋亡酶活性(19,20.],光化学效率[30.),而Symbiodinium密度(31日)(图1在热应力),实验室实验。生物标志物的筛选这个大套房的动态,本研究进一步旨在提供诊断标记珊瑚的亚致死的压力。

2。材料和方法

2.1。珊瑚收集和维护

两个珊瑚物种代表印度太平洋的珊瑚礁生态系统,鹿角和Pocillopora damicornis,收集鹭岛上礁(23°33′年代,151°54′E)在大堡礁南部,澳大利亚,2013年和2014年2月。三个健康的殖民地鹿角和三个健康的殖民地Pocillopora damicornis使用剪线钳是支离破碎的。这些珊瑚碎片立即运到水族馆设备悉尼科技大学的,他们被分成单一upward-growing分支提示(6 - 8厘米长)和挂在六周后使用传统的钓鱼线适应时期。珊瑚碎片被适应的在模拟自然环境条件(人工海水,26°C;常数和最优流条件在不同的坦克;110年μ摩尔光子米⁻²年代⁻¹光强度与12 h: 12 h:晚上周期)前4周热应力实验,以确保产生的扰动,通过实验操作的生物没有其他来源但热应力。

2.2。实验治疗

2.2.1。Thermal-Induced压力鹿角和Pocillopora damicornis

两个每个殖民地为每个分支珊瑚物种被随机放置到每个六水族馆(10升,3罐复制/温度处理与一个共同使用heater-chiller池控制,共12珊瑚树枝/水族馆)在同等条件下的适应(人工海水,26°C;110年μ摩尔光子米⁻²年代⁻¹光强度与12 h: 12 h:晚上周期,光从早上10点到晚上10点)。探索温度半胱天冬酶3活动的影响,系统接受了以下实验政权:压力(0.5°C增加每12小时)和对照组(稳定在26°C,补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/68259498天。水温每2分钟记录使用温度传感器(流浪汉U22水临时Pro v2,电脑公司,妈,美国)。珊瑚树枝收获之前宿主蛋白分析,共生体的光系统II (PSII)效率测量使用脉冲幅度调制(PAM)荧光计(如下所述)一个随机选择的子集()的治疗和控制坦克(即最后的周期。12 h的暗适应)天后,0,2,4,6,8。因为分支珊瑚通常呈现一个大空间组织色素的变化和生理条件的分支,是注意的选择珊瑚组织相似的色素沉着(例如,在相似距离分支提示)和地区的珊瑚树枝接触到类似的收获珊瑚树枝光水平。相同的珊瑚树枝然后从坦克,直接提前使用液态氮冷冻,并储存在−80°C的进一步分析半胱天冬酶3活动和共生有机体的细胞密度。

2.2.2。Thermal-Induced压力和恢复阶段Pocillopora damicornis

对于每个温度的治疗,36个珊瑚坑被置于一个系统由6水族馆(4升,6每槽坑)与200升过滤油底壳,用人工海水流动的连续7相同条件下的适应(补充图2)时期。实验下的16天以下治疗:(i)(稳定控制°C(平均数±标准差)对整个实验),(2)热应力(增加°C每24小时从26°C,然后留在32°C),(3)恢复(增加°C每24小时从26°C到32°C,然后减少2°C每24小时达到26°C和8天保持不变)。水温度记录每小时温度传感器(流浪汉U22水临时Pro v2,电脑公司,妈,美国)和概要文件补充图3所示。

2.3。由Water-Picking珊瑚组织分离

喷枪技术(32)是用来消除生活珊瑚组织从50毫升猎鹰的骨架包含5毫升的冷0.45管μ过滤后的海水。黄藻分离宿主组织,样本离心机两次在4525×g 8分钟4°C。包含珊瑚组织立即被整除的上层清液,用于确定半胱天冬酶3活动和总蛋白质含量。剩下的整除珊瑚组织提取在液氮快速冻结和保持在−80°C ROS-scavenging化合物的分析。珊瑚骨骼被冷冻,保存在−20°C进行进一步的总表面面积估算。黄藻丸resuspended在5毫升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10毫米三,125毫米氯化钠,0.1毫米EDTA, pH值7.4)。第一thermal-induced压力实验,小球被冷冻保存,保存在细胞密度估计而−80°C,复苏的实验中,他们被储存在4°C细胞计数在同一天。

2.4。黄藻计数和珊瑚碎片表面面积估算

黄藻被数使用血球计(Neubauer-improved细胞计数室)和复合光学显微镜,一式三份的数量为每个样本,这样至少可以计算400个细胞,和藻密度估计在10%计算错误。

表面积的主机活组织估计使用蜡重量法(33,34)考虑珊瑚石区域,用它来进一步规范化的数据。为了避免任何组织和水渣,珊瑚碎片是漂白剂10分钟,然后一夜之间干60°C。珊瑚碎片重打蜡前,后被涂上一层石蜡举行75°C,浸渍在5秒,让它在室温下5分钟。标准化,8立方金属物体的表面积(10.34 - -60.72厘米²)治疗一样珊瑚碎片产生一个标准曲线(,)。小片的表面积可以使用微分估计石蜡的重量。

2.5。黄藻光化学效率的决心

确定的光化学效率PSII黄藻,PSII的最大量子产量与PAM荧光计测量。这种非侵入性技术允许的光合参数的确定(最低级别的背影荧光)和(最大程度的排名荧光)交付给饱和脉冲的光。这些参数被用来计算和最大量子产量()的光系统II (PSII) [35,36]。而其他参数,如NPQ ETRmax,α可以被用在这项研究中,已被广泛用于以前的珊瑚研究[30.,37]。测量完成后暗适应时间,6点地点在每个珊瑚分支()来捕获向上和向下面对表面。他们是用3毫米Diving-PAM光纤使用以下设置:获得= 6,SP宽度= 0.7 s, SP强度≥3000μ摩尔光子米⁻²年代⁻¹。是小心以确保最低300的荧光。测量是在相同的时间步长对珊瑚主机测量天0,2,4,6,8。

2.6。蛋白质含量在珊瑚组织量化

为了量化珊瑚宿主组织的蛋白质含量(需要规范化半胱天冬酶3活动),一个商业总蛋白测定工具使用(BCA蛋白质化验设备,皮尔斯™美国罗克福德)。制造商的指示后,25岁μ引入L新鲜的珊瑚组织样本的每个好Nunc MaxiSorp 96孔板(西格玛奥德里奇、澳大利亚)和左反应30分钟与200年在37°CμL (BCA试剂前阅读吸光度在560 nm FLUOstar最适条件板读者(BMG Labtech Ortenberg,德国)。对于每个板块分析,蛋白质标准曲线是另外获得使用牛血清白蛋白(BSA)的解决方案在浓度范围从0到2000μ克毫升⁻¹。每一个珊瑚样本分析一式三份。每个样本的蛋白质浓度计算使用单位的标准曲线,并表示μ克毫升⁻¹。

2.7。半胱天冬酶3活动的检测

半胱天冬酶3活动在珊瑚宿主组织样本测量使用半胱天冬酶3试验装备,比色(西格玛奥德里奇、澳大利亚)。这个分析是基于监控DEVD-p-nitroanilide乳沟的黄色的对硝基苯胺(机构)通过时间(38]。对于每个试验,除了珊瑚宿主组织样本测试,以下标准进行:(i)的空白由分析缓冲和衬底,以确认颜色并不是由于基质降解通过时间,(2)为每个示例包含一个消极的控制半胱天冬酶3抑制剂来确定信号的基线,和(3)积极控制包含商业半胱天冬酶3提供的工具,允许测试的验证效率。所有样品和标准被加载为一式四份。温度保持在37°C在化验和反应的动力学随访3 h通过测量吸光度在每分钟405海里每使用板阅读器软件,后直接添加半胱天冬酶3衬底。将底物的浓度的吸光度值退化,标准曲线的浓度相关的生产机构获得的吸光度值。试剂添加到井100年第四卷μL,补充表中所描述的。

2.8。过氧化氢酶活性检测

过氧化氢酶活性测定使用过氧化氢酶荧光检测设备(恩佐生命科学、澳大利亚)。这个实验是基于过氧化氢的测量(H₂O₂)衬底剩菜后过氧化氢酶酶通过降解时间39]。在H₂O₂和辣根过氧化物酶(合),nonfluorescent ADHP (10-acetyl-3 7-dihydroxyphenoxazine)是高度氧化荧光Resorufin,在570 nm激发后,在590海里,可以发射出荧光定量测量,然后使用商业过氧化氢酶过氧化氢酶活性相关标准工具包中提供。由于这个测试的高灵敏度和线性范围小的标准(0到1 U·毫升⁻¹)、珊瑚样品必须被稀释到250倍。分析了他们每个人一式三份。

2.9。总谷胱甘肽的检测

二硫化还原谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽(GSSG)产生的氧化谷胱甘肽过氧化物酶在宿主组织量化使用谷胱甘肽的检测工具(西格玛奥德里奇、澳大利亚)。板的读者将测量吸光度2-nitro-5-thiobenzoate (TNB)连续生产从5、5′-dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB)氧化谷胱甘肽(每100秒20分钟405海里)。GSSG也是衡量减少到谷胱甘肽,谷胱甘肽还原酶(40]。结果计算从谷胱甘肽标准曲线范围从0到50μ米,使用技术一式四份。

2.10。统计分析

19统计分析进行了使用IBM SPSS统计软件。由于收集许可证限制,在这项研究中使用的生物复制数量仅限于3。Kolmogorov-Smirnov和列文首先测试用于测试正常和方差齐性的数据,分别。当这两个条件都满足,一个方差分析(方差分析)意味着在治疗方法进行了比较。当列文的测试没有证实方差的同质性,进行了非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验和非参数Mann-Whitney测试是用来比较控制和热应力的治疗。当方差分析测试表现出显著差异,事后费舍尔至少显著差异(LSD)执行测试以确定哪些治疗是不同的。学生的以及还表现为每个采样时间允许比较获得的值为控制和热强调样本。结果被认为是重要的在5%的水平。

3所示。结果

3.1。的反应鹿角和Pocillopora damicornisThermal-Induced压力

3.1.1。检测细胞凋亡蛋白酶3活动珊瑚主机使用商业套装

半胱天冬酶3珊瑚宿主组织内的活动鹿角测量使用商业套装。如图2,动态响应从珊瑚样本获得类似于一个获得商业半胱天冬酶3(积极的控制)。珊瑚样品的初始吸光度值更高由于天然珊瑚组织的吸光度。测试信号共生体的潜在贡献,我们调查的存在半胱天冬酶3活动在黄藻从珊瑚中提取样本。结果表明,没有发现重大的活动在这一部分的样品(图2),确认对珊瑚主机测试的特异性。

3.1.2。检测细胞凋亡蛋白酶3和光化学效率Heat-Stressed珊瑚

半胱天冬酶活性表现出上升趋势随着时间的热处理答:millepora,但没有可变性之间复制产生了显著差异随着时间的推移,就像控制样品(图3(一个))(克鲁斯卡尔-沃利斯:)。半胱天冬酶3活动显著增加观察之间的控制和强调珊瑚6天以及:,,;平均±SD:半胱天冬酶3活动和U (nmol机构)分钟⁻¹毫克⁻¹为控制和治疗珊瑚、职责)。这增加的趋势似乎继续在8天;然而增加不显著,可能由于heat-stressed珊瑚之间的变化可能影响分析(以及:,,)。

有轻微下降最大量子产量()随着时间的推移,在强调珊瑚(平均±SD:一天0和在天(图8)3(一个))。这减少黄藻PSII效率强调珊瑚随着时间有意义(克鲁斯卡尔-沃利斯:),而一直稳定在控制治疗。当比较之间的PSII效率控制和加热治疗在每个时间点,在6天观察显著差异(以及:,,)显示减少的在激烈的珊瑚(平均±SD:控制在一天6 = 0.651;治疗一天6 = 0.576)。这种下降趋势似乎继续在8天,但差异没有统计学意义(以及:,,)。

半胱天冬酶3活动随时间趋势向上加热Pocillopora damicornis珊瑚虽然控制(图中保持不变3 (b))。当比较两种治疗方法在每个时间点,一个显著差异出现在第四天(以及在第四天:,,;以及在6天:,,)确认增加的半胱天冬酶3活动早于答:millepora(平均±SD活动:控制在一天U (nmol机构)分钟⁻¹毫克⁻¹;治疗一天U (nmol机构)分钟⁻¹毫克⁻¹;控制在一天U (nmol机构)分钟⁻¹毫克⁻¹;治疗一天U (nmol机构)分钟⁻¹毫克⁻¹)。没有观察到显著差异在8天(以及:,,)。

有轻微下降PSII的最大量子产量(在强调珊瑚(从)时间在0到天天(图8)3 (b))。方差分析显示了显著影响时间的光合效率共生体(与二因素方差分析,治疗和之间的相互作用时间:,;时间:,;治疗,第8天),一个重要的区别和天0和2 (LSD事后费雪,)。当比较PSII效率之间治疗实验的过程中,可以观察到无显著差异之间的压力和控制珊瑚(以及:05)。

3.1.3。温度应力对共生有机体的细胞密度的影响

在鹿角黄藻密度并没有改变实验过程中控制或处理标本,平均的×10⁶细胞厘米⁻²(图4(一))。然而,对比治疗显示预期更高的黄藻密度2天(Mann-Whitney测试:4天),其次是减少显示明显高于黄藻密度控制标本6天(Mann-Whitney测试:)。的黄藻密度Pocillopora damicornis保持相似的控制和治疗标本的大部分实验的平均×10⁶细胞厘米⁻²(图4 (b))。然而,8天,有更高的黄藻比强调珊瑚(Mann-Whitney密度控制测试:)。

3.2。的反应Pocillopora damicornisThermal-Induced压力和恢复潜力

3.2.1之上。光化学效率

光化学效率(图5),以最大量子产量(),减少通过时间(克鲁斯卡尔-沃利斯(知道):样品在控制)一天0和在16天)、压力(知道:)(一天0和6天),恢复治疗(知道:)(一天0和在第十天)。不断增加的趋势检测样品中复苏治疗后12天的实验(),虽然不显著()。压力治疗中的光化学效率明显高于控制在第二天(Mann-Whitney (M-W):)。光化学效率复苏治疗压力低于控制阶段在第四天(M-W:在复苏阶段)和高于控制在16天(M-W:)。

3.2.2。共生者密度

共生者密度(图6)控制珊瑚在第8天显著增加(M-W:)(细胞·厘米⁻²一天0和细胞·厘米⁻²在第八天细胞·厘米⁻²在16天)。没有明显的细胞密度的变化发生在恢复治疗。压力治疗没有显示显著改变共生者密度(知道:)。直到6天,没有显著区别控制和治疗(),但在第八天细胞密度的差异变得明显高于控制相比,恢复治疗(M-W:),直到实验结束,除了天12 (M-W:)。

3.2.3。半胱天冬酶3活动

控制珊瑚、半胱天冬酶3活动仍然很低,稳定实验期间没有任何显著差异(知道:)(图7)。压力治疗显示了显著增加(M-W:珊瑚)的半胱天冬酶3活动在第四天(nmol机构·敏⁻¹·毫克蛋白⁻¹和nmol机构·敏⁻¹·毫克蛋白⁻¹控制)。复苏和压力治疗显示大幅增加(但不显著,M-W:)在半胱天冬酶3活动一天6(分别地。nmol机构·敏⁻¹·毫克蛋白⁻¹和nmol机构·敏⁻¹·毫克蛋白⁻¹)。半胱天冬酶3活动复苏阶段显示了减少珊瑚当温度下降。活动水平的珊瑚在复苏阶段稳定控制活动水平在第14天(M-W:,nmol机构·敏⁻¹·毫克蛋白⁻¹的控制和nmol机构·敏⁻¹·毫克蛋白⁻¹经济复苏治疗)。

3.2.4。谷胱甘肽的量

总谷胱甘肽水平(图8)通过时间控制显著改变(知道:增加从0(天μ摩尔谷胱甘肽。μg蛋白质⁻¹6()天μ摩尔谷胱甘肽。μg蛋白质⁻¹;M-W:))。复苏治疗显示了重要(M-W:从第四天)增加谷胱甘肽的量检测(M-W:)非常相似的谷胱甘肽水平压力治疗(μ摩尔谷胱甘肽。μg蛋白质⁻¹和μ摩尔谷胱甘肽。μg蛋白质⁻¹、职责)到下一个采样点天6 (μ摩尔谷胱甘肽。μg蛋白质⁻¹的治疗和恢复μ摩尔谷胱甘肽。μg蛋白质⁻¹治疗压力)。恢复阶段显示立即减少谷胱甘肽水平的比例与温度。谷胱甘肽数量的恢复治疗在这个阶段类似于控制水平在10天(M-W:)。

3.2.5。过氧化氢酶的活动

过氧化氢酶活性(图9)控制珊瑚从0到天恒8(知道:),但显著增加(M-W:)在10天(从U·毫升⁻¹·μg蛋白质⁻¹在第八天U·毫升⁻¹·μg蛋白质⁻¹在第十天)。控制相比,无显著差异的过氧化氢酶活动观察复苏和压力治疗(M-W:)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们首先证明半胱天冬酶3活动可以监控两种珊瑚使用检测方法用于人类医学应用,如乳腺癌的诊断(41)(图3)。在这两个鹿角和Pocillopora damicornis,温度应力导致半胱天冬酶3活动的显著增加。先前的研究清楚地演示的功能激活半胱天冬酶3类动物在应对各种压力19,20.,42]。然而,这个反应的时间尺度从来没有与其他方法相比的压力检测如PAM氟量计,对共生有机体的健康一个代理。在我们最初的实验中,半胱天冬酶3活动的增加可能会发现在宿主组织经过4天的热应力(即。,从环境气温上升2°C到32°C)p . damicornis(增加39%半胱天冬酶3活动相比,控制每天4和87% 6),经过6天的热应力答:millepora(增加35%半胱天冬酶3活动相比,控制)。相比之下,PAM氟量计检测到PSII共生体的效率下降()后6天答:millepora没有明显下降p . damicornis在实验(图3)。这些结果表明,通过使用半胱天冬酶3活动分析,热应力可以检测到在共生体的任何损失或改变PSII效率,特别是在p . damicornis。此外,即使没有统计学意义,我们的数据表明,我们能够探测到的增加半胱天冬酶3活动后只有2天的热应力。

缺乏统计学意义差异的观察之间的半胱天冬酶3活动一天8治疗可能是相关的高可变性在强调样品(图3)。事实上,这种高可变性可以解释为珊瑚碎片之间的巨大差距观察组织覆盖,与一些片段显示对热应力的敏感性高于其他人(有些失去了大部分的组织碎片而仍进行漂白,显示高半胱天冬酶3活动)。根据我们的观察,这些差异与位置无关的坦克或取向珊瑚树枝。

经济复苏的实验表明,珊瑚的早期反应Pocillopora damicornis热应力可以监控使用生物标记与氧化应激反应有关。先前的研究清楚地表明谷胱甘肽的作用[27在应激反应机制允许珊瑚通过ROS清除应对压力,并与相同模式的响应(21]。然而,这些反应的时间尺度从来没有与其他方法相比的压力检测如PAM氟量计,一个代理对共生有机体的健康(43]。在我们的研究中,半胱天冬酶3活动与谷胱甘肽水平的增加可能会发现在宿主组织热应力(即4天。、温度的增加(图4°C)8)。相比之下,PAM氟量计显示共生体的光合效率大幅下降()在实验期间,发生在控制和恢复治疗(图5)。此外,共生体的损失并不诱导光化学效率的损失(反之亦然),彼此阻碍这些值的相关性(图6)。虽然这些结果表明不是最优的方式来评估珊瑚健康热应力实验的情况下,其他PAM参数如NPQ, ETR,α,和本土知识最佳评估需要考虑使用PAM氟量计。此外,通过使用谷胱甘肽定量和半胱天冬酶3活动分析,热应激反应之前可以检测到任何损失的共生体或PSII的光化学效率的变化。这个对比这两种方法在检测所需的时间压力可能反映了(我)珊瑚主机和共生有机体之间的生理差异和/或(ii)方法论的差异在测量的规模;,而细胞生物标志物检测目标的组织整个珊瑚分支(1 - 2厘米),PAM珊瑚树枝的荧光测定术只允许评估部分完整的光合组织和有一个小得多的足迹(0.5厘米直径的照明PAM纤维)。

珊瑚对热应激严重变量。几种细胞机制导致珊瑚白化(44,45];在我们的实验中,我们可以直观地观察宿主组织分离的骨架,它仍有黄藻与之关联。考虑到半胱天冬酶3活动与压力的增加(图7),这种现象似乎源于细胞凋亡(调节细胞死亡)而不是坏死(不受控制的细胞死亡)。后一种类型的漂白珊瑚不允许适当的复苏阶段,因为息肉整合不再是礼物Symbiodinium细胞新创。这可以解释不断丧失生活的共生体宿主组织没有转身。除此之外,Symbiodinium细胞生存是高度妥协驱逐后5天(46),因此不能等待开拓殖民地的骨架新的息肉,在底物竞争与其他微藻中系统。因为失去黄藻推迟结束后热应力,密度不能用作珊瑚白化有关生物学指标。控制显示翻倍的共生有机体密度相比,已报道了Fitt et al。(2009)47]。这一增加可能是细胞分裂的结果在主机室。同时,增加了过氧化氢酶的活动发生在控制,这表明在热应力共生体的参与。主机和藻分数分离分析之前,但过氧化氢可以通过膜扩散和藻类的细胞壁22]。此外,尽管过氧化氢酶活动共生有机体海葵等Anemonia冬青主要是估算主机部分(48),这一趋势可能不是相同的珊瑚等p . damicornis。过氧化氢酶活性的控制并不一致,因为强调珊瑚通过时间变化的过氧化氢酶反应,我们不能得出结论,这个生物标志物可用于珊瑚健康监测(图9)。确定这个响应的起源,过氧化氢酶活性和过氧化氢水平共生体应该以未来的研究。

5。结论

在诊断应用程序中,PAM氟量计等无损方法非常有吸引力。然而,我们表明,探测共生体的光化学效率的变化发生变化后宿主生物标记物的浓度。显然,如果干预以防止珊瑚损失所需的管理结果,然后快速的发展尚不致命的珊瑚指标压力是必要的。我们已经表明,谷胱甘肽和半胱天冬酶3化验可以检测珊瑚健康下降之前thermal-related漂白的发病和死亡率,因此可以实现的一个早期信号压力珊瑚,补充传统的珊瑚礁监测协议。然而,珊瑚碎片之间的巨大差距观察组织覆盖,与一些片段显示比别人更高的热应力敏感性(有些失去了大部分的组织碎片而仍健康或在漂白过程中,显示出高半胱天冬酶3活动与谷胱甘肽水平),不允许我们确定亚致死的值可以用普遍的生物标志物。此外,一些挑战仍有待解决任何可能的集成之前的亚致死的珊瑚监测项目的检测工具。首先,考虑到这里描述的方法是入侵,对珊瑚群体样本集合的影响应该保持到最低限度。然后半胱天冬酶,谷胱甘肽化验需要执行新鲜生活珊瑚没有处理压力,干扰特定的热应力响应(冻结后这些蛋白质不稳定),这可能是一个问题在偏远地区。在这种情况下,后续研究增加灵敏度(从而减少所需的珊瑚组织)使用电化学传感的半胱天冬酶3活动(48]或体内近红外荧光检测细胞内的谷胱甘肽水平(49)展示伟大的承诺。还有一个需要(我)目标珊瑚个体之间的变异使用生物复制的数量增加;(2)屏幕的不同演化支的参与Symbiodinium谷胱甘肽水平和半胱天冬酶3活动;(3)提高分辨率的结果通过研究其他珊瑚物种的反应;(iv)确定触发值半胱天冬酶3活动与广泛的压力不仅(ROS)和评估他们的复苏后压力接触;和(v)验证该技术领域的研究。的确,在这个领域,温度和亮度水平不是常数,可以昼夜节律波动。此外,季节性变化可能有助于珊瑚准备夏季气温升高,光水平。

虽然这个新工具不能代替需要监控珊瑚ecosystem-scale级别的压力的影响,我们的工作提供了进一步的证据,它可以用来监控的健康个体珊瑚殖民地和帮助管理当局或珊瑚礁水族馆检测和自适应管理环境压力的影响。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢悉尼科技大学提供资金用于本研究通过职业生涯早期研究资助计划以及财政大臣Olivier Laczka博士的博士后奖学金项目授予。Sebastien Le Guillou统计以便Ros和大学学生交流项目支持的布雷斯特,法国,和佩皮尼昂大学通过Domitia、法国,分别。他们也愿意承认基督教Evenhuis科学输入,为实验室支持保罗·布鲁克斯,安东尼Larkum珊瑚标本的收集。

补充材料

引用

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