蹩脚的副作用Pseudoalteromonas在鱼致病鳗弧菌:一个在体外研究

文摘

作为海洋水产养殖使用的先决条件,两个固定系统是由使用益生菌细菌PseudoalteromonasMLms_gA3 sp.压力。他们对鱼病原体的生存能力的影响鳗弧菌探讨了。益生菌作为生物膜生长在瓷砖或嵌入在藻酸盐珠被添加到无菌人工海水中含有病原体的鱼。固定在陶瓷是最近开发的协议,海藻酸介质允许微型胶囊是新开发的。反弧菌活动是获得与固定系统。的活细胞计数诉anguillarum不断减少的头两周内治疗证明固定系统的潜力提供probiotic-based抵御病原体。

1。介绍

毫不奇怪,益生菌获得越来越多的人类和动物营养重要性和福利以及水产养殖,即使对于海洋观赏鱼的目的(1]。替代抗生素,经常引起耐药表型的有害细菌,因此,政府必须在一般被认为是一个关键问题(了2])。同时,抗生素,和通常被管理只在出现明确的微生物疾病的迹象,而细菌“对抗病原体”(3发挥益生菌可以预防他们保护能力已经从长袜和随后在生命的各个阶段。有前途的先前的研究从温带地区,益生菌对不同的鱼类的保护,如大西洋鳕鱼,大西洋鲑鱼,和大比目鱼4- - - - - -9]。

迄今为止商用"益生菌"产品用于水产养殖通常是粉末或液体(如Sanolife®MIC-F (http://shrimpcare.com/newwp/inve-mic-f-probiotic访问:2016年8月12日)或DrTim游泳®Eco-Balance益生菌礁,Nano和海马水族缸(http://store.drtimsaquatics.com/Eco-Balance-Probiotic-Bacteria-for-Reef-Nano-and-Seahorse-Aquaria_p_389.html访问:2015年7月9日),职责),水溶性,,因此,立即对鱼。仍然是,然而,至少不确定益生菌浮游细菌可以抵御肠道环境,遇到低pH值以及氧的限制。同样,有一个被(完全)吸收的风险在水族馆的过滤系统。因此,由于益生菌,如Shewanella putrefaciens在海藻酸珠子,以前测试口服药在鞋底10]。此外,它是证明在体外微型胶囊保护细菌对消化酶的作用和低pH值(11]。固定一般被认为是给细胞躲避有害条件而固定细菌是在平稳增长阶段有效地产生次生代谢产物(12]。虽然这些次生代谢物是浮游细菌产生的已知,固定微生物可能是更有力的生产商(13,14]。分泌的生物活性分子的确是相当常见的细菌嵌入粒子/珠子或固定在固体表面(8,15- - - - - -18]。许多细菌固定在胞外聚合物(EPS)被分离物质的生物膜和散布到环境流体他们成为直接fish-available类似nonimmobilised(液体和粉末)配方19]。也有细菌生物活性物质在鱼缸的风险只有短期效应,水,包括其独立生存的细菌,是连续循环过滤系统,导致稀释率高。由于益生菌可能沉积在过滤系统,因此,很快成为几乎没有可用的水。

在这项研究中我们处理的微型胶囊和固定一个假定的益生菌细菌属于属Pseudoalteromonas用于海洋观赏水产养殖分析其击败鱼致病能力鳗弧菌。不同物种的Pseudoalteromonas已知产生敌对的行动在许多细菌对鱼类有害(22- - - - - -24),更具体地说,反弧菌物质被孤立Pseudoalteromonas代表(22,25]。通过应用Pseudoalteromonas文化上层清液,Vynne [26]证明了抑制诉anguillarum一种病原体,影响“各种海洋和新鲜/半咸水鱼”(27),无所不在地发生在海洋环境中。在这项研究中,我们使用一个Pseudoalteromonas应变之前确定通过琼脂扩散试验显示对敌对的属性诉anguillarum(20.]。

Pseudoalteromonassp.应变MLms_gA3固定在多孔陶瓷瓷砖(28]因为益生菌菌株的潜在的长期供应,或者嵌入在海藻酸珠子也确保口服。从以往的研究20.预计孤立Pseudoalteromonas细胞会产生负面影响诉anguillarum时,这种效果会增强固定细胞。

2。材料和方法

下面的实验步骤进行了测试假定的益生菌的拮抗效应Pseudoalteromonas系统对诉anguillarum:(1)生产海藻酸珠子和biofilm-coating瓷砖的孤立Pseudoalteromonas压力,(ii)接种该种人工海水(由莱布尼茨热带海洋生态中心ZMT,不来梅)与一个预定义的活细胞计数的诉anguillarum/Pseudoalteromonassp.应变MLms_gA3和海藻酸的插入珠子/瓷砖,分别和(iii)监测的可行性诉anguillarum和Pseudoalteromonas细胞计数的28天,天0、1、3、7、14、21、28个不同的设置(表中1)。有两个生物复制两个平行测试系列在每个设置。误差线代表算术平均值的标准偏差。

2.1。应变选择和培养

P。sp.应变MLms_gA3最初从水族馆水样分离莱布尼兹中心提供的热带海洋生态GmbH德国不莱梅(ZMT)。因此,水样本序列稀释和孵化海洋琼脂(马卡尔罗斯GmbH Co .公斤,卡尔斯鲁厄,德国)在30°C(孵化器世贸中心、粘合剂GmbH Tuttlingen,德国)。形态不同的殖民地与适当的增长率对鱼被琼脂扩散试验检测病原体与水产养殖相关(20.]。一种细菌,形成黄色的殖民地,与活动向鱼病原体被确认为测试Pseudoalteromonas通过16 s rRNA分析(20.]。Pseudoalteromonas citrea(~ 95%基因组协议)的形状为最近的邻居,但是,明显系统距离不允许集成到相同的物种。MLms_gA3总是在海洋琼脂培养30°C。应变是存储在马在21°C和接种每月新马。鳗弧菌从德国获得微生物和细胞培养的集合(莱布尼兹研究所DSMZ DSM 21597年,[29日在30°C])和常规栽培营养琼脂(卡尔罗斯GmbH Co .公斤,卡尔斯鲁厄,德国)补充3% w / v氯化钠(氯化钠)和存储在烤肉−20°C®存储低温瓶(卡尔罗斯GmbH Co .公斤,卡尔斯鲁厄,德国),分别。Precultures孵化24 h在30°C水浴瓶在150 rpm(金五环®1092,法理社会为了Labortechnik mbH, Burgwedel,德国)。

2.2。封装的Pseudoalteromonassp。应变MLms_gA3海藻酸珠子

挤压技术(30.)是用于微型胶囊MLms_gA3细胞。收获,离心收集细胞从10 mL precultures(10分钟,每分钟4500转;环球320 r,安德烈亚斯Hettich GmbH & Co .公斤,Tuttlingen,德国)和获得的细胞颗粒在2毫升r-suspended海洋解决方案含有氯化钠、Tris-HCl、蛋白胨、酵母提取物。海藻酸钠2% w / v(卡尔罗斯GmbH Co .公斤,卡尔斯鲁厄,德国)溶解在海洋~ 70°C的解决方案获得hydrocolloidal解决方案。冷却后的解决方案~ 35°C, 2毫升resuspended细胞颗粒与海藻酸钠添加到海洋的解决方案。混合添加一滴一滴地进入成熟解决方案包含1.5氯化钙(30.]利用注射器的出口直径2毫米(20毫升/鲁尔接口独奏,b·布劳恩Melsungen AG Melsungen,德国),导致海藻酸的形成珠(补充数据,图S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/3683809)。导致珠子(~ 3毫米直径)洗在使用前消毒人工海水。参考样本,“空白”的影响海藻酸珠子(没有细菌之外)的活细胞计数诉anguillarum进行了测试。

2.3。瓷砖上生物膜的形成

如前所述(28]多孔氧化铝制成的瓷砖(17毫米,直径5毫米,高度~ 80%开孔率、平均孔隙大小~ 5μ米)作为模型结构为细菌固定和固定细菌的过程进行按照我们既定的协议(20.]。只有MLms_gA3细胞海藻酸长达的影响可能比较珠子。分析了生物膜的形成,扫描电镜(SEM);狮子座1530型副总裁、卡尔蔡司显微镜GmbH德国耶拿)中执行合作nanoAnalytics GmbH(德国明斯特)。作为一个控制的影响“空白”陶瓷的活细胞计数诉anguillarum测试通过孵化瓷砖在MB含有1% w / v淀粉一段14 d 30°C 7 d后的更新中。

2.4。测定活细胞计数

浮游细菌(P。sp.应变MLms_gA3和诉anguillarum)和发布P。sp.应变MLms_gA3细胞从海藻酸珠子或瓷砖被确定为每毫升集落形成单位(cfu毫升⁻¹)。这种方法将使可行的细胞的数量的严重低估。这样的目的与消毒人工海水样本连续稀释96孔板(Numbrecht Sarstedt AG) & Co .,德国)和掉在海洋琼脂(MA)的情况P。sp。MLms_gA3和营养琼脂含有3% w / v氯化钠的情况诉anguillarum其次是孵化24小时在30°C。“殖民地的菌落形态:P。sp.应变MLms_gA3黄色殖民地和形式诉anguillarum形成白色菌落。两个整除的每个样本连续稀释和10μL镀相关的稀释是一式三份。蹩脚的拮抗效应和浮游细胞P。sp.应变MLms_gA3反对诉anguillarum进行了测试在体外在50毫升30毫升无菌人工海水管(Numbrecht Sarstedt AG) & Co .,德国),接种~ 10⁵cfu毫升⁻¹的诉anguillarum(根据(31日])。浮游细胞P。sp。MLms_gA3 (~ 10⁴cfu毫升⁻¹)或益生菌Pseudoalteromonas海藻酸固定系统(15珠子或一个涂布瓷砖)随后被添加。

未经处理的藻酸盐珠子和瓷砖为“空白”样本应用于消毒海水人工接种~ 10⁵cfu毫升⁻¹的诉anguillarum分别分析可能影响材料的生长或生存诉anguillarum。

的活细胞计数诉anguillarum(~ 10⁵cfu毫升⁻¹),P。sp.应变MLms_gA3 (~ 10⁴cfu毫升⁻¹在30毫升)调整消毒人工海水。光密度在585 nm (OD_585年)指的是相关的活细胞计数precultures 24 h后确定。当一个适当的OD_585年达成(~ 0.190 rel。非盟在1:10稀释MLms_gA3 ~ 0.090 rel。非盟在1:10稀释诉anguillarum;补充数据,表S1),细菌培养的cfu调整~ 10⁴cfu /毫升的情况Pseudoalteromonas应变和~ 10⁵cfu /毫升的情况诉anguillarum通过添加消毒人工海水。

细菌的生存是计算cfu毫升⁻¹。

3所示。结果

3.1。影响浮游P。sp。应变MLms_gA3诉anguillarum

前固定的生存诉anguillarum监测是可行的计数在28天有和没有的浮游Pseudoalteromonassp。MLms_gA3细胞为了检查假定的益生菌细菌的能力对其致病性counterpartin我们施加在敌对的影响在体外实验装置(图1)。

控制设置诉anguillarum,缺乏Pseudoalteromonas细胞,活细胞计数下降在监测期内的28天为2.0×10³cfu毫升⁻¹(±1.07×10³cfu毫升⁻¹),而在浮游MLms_gA3面前,致病性细菌的菌落下降到1.34×10²cfu毫升⁻¹(±1.76×10²cfu毫升⁻¹)。在敌对的效果已经明显第三天至第七天的生存诉anguillarum下降到1.26×10³cfu毫升⁻¹(±1.83×10²cfu毫升⁻¹),而控制仍然显示8.63×10的高水平³cfu毫升⁻¹(±1.08×10⁴cfu毫升⁻¹)。虽然诉anguillarum可行的数量随着时间的推移不断下降,不管的P。sp。MLms_gA3,后者的存在降低了殖民地的形成诉anguillarum进一步,更迅速。天7到21数量明显减少益生菌菌株的存在和在任何各自的阅读之间天7和21低于控制。

3.2。空的影响海藻酸珠子和裸露的瓷砖

检查可能的有害或有益的影响材料本身的测试菌株,活细胞计数的诉anguillarum与“空白”监控海藻酸珠子或瓷砖。

从一个几乎相同的初始可行的细胞计数诉anguillarum在所有治疗(~ 10⁵cfu毫升⁻¹;0 d,表2),的菌落诉anguillarum不同的不同的样本期间内孵化(图2)。在第一个24小时有一个强大的数量增加诉anguillarumcfu在“空白”的存在(从海藻酸珠子cfu毫升⁻¹来cfu毫升⁻¹)设置相比陶瓷(从“空白”cfu毫升⁻¹来cfu毫升⁻¹)或只与海水(从cfu毫升⁻¹来cfu毫升⁻¹)。Cfu计数仅略有下降,直到实验结束的设置与海藻酸珠子(决赛cfu毫升⁻¹),而在其他两个设置(控制:cfu毫升⁻¹;瓷砖:cfu毫升⁻¹)一个相当类似的和更明显减少变得明显。

3.3。蹩脚的影响Pseudoalteromonas细胞

的生存诉anguillarum减少在浮游MLms_gA3细胞(图1海藻酸),与此同时,珠子以及瓷砖没有负面影响,而是增加了测试人员的生存压力(图2),以上,潜在的益生菌Pseudoalteromonas应变是封装在海藻酸(图3瓷砖(上)和固定的数字4和5),分别。随后,两个固定系统的影响的生存诉anguillarum进行了测试。为此,消毒海水接种诉anguillarum(~ 10⁵cfu毫升⁻¹;见表2海藻酸)和处理加载珠子或生物膜涂布瓷砖。

支持先前的实验的结果使用海藻酸“空白”珠子,菌落的数量在增加诉anguillarum再次控制设置(空珠子)在第一个72小时(从cfu毫升⁻¹来cfu毫升⁻¹)和缓慢下降,开始,而最近从7天(cfu毫升⁻¹),直到实验结束后28天(cfu毫升⁻¹;图3)。海藻酸与益生菌治疗加载珠子的生存诉anguillarum最初再次增加,但这种增加是有限的第一个24小时(达到的水平cfu毫升⁻¹)。这已经成为明显的3天(cfu毫升⁻¹),直到最后的记录(28天)水平cfu毫升⁻¹。显著的不同控制被认为已经7天,当生存的诉anguillarum在加载海藻酸珠子的存在降低了相当低的水平为2.28×10⁴cfu毫升⁻¹(±2.36×10⁴cfu毫升⁻¹)与cfu毫升⁻¹的控制。因此,封装Pseudoalteromonas应变明显,有效破坏鱼的生存致病性诉anguillarum。

固定MLms_gA3细胞的瓷砖进行(20.]。扫描电子显微镜(SEM图4)揭示了成功的殖民化的瓷砖,因为大量的细菌容易检测到在孵化的陶瓷在海洋Bouillon-starch MLms_gA3细胞添加固定(图4(b2))。控制样本是一个“空白”瓷砖在MB-starch同样对待,孵化,但缺乏细菌是显而易见的(数据4(a1)和4(a2))。

随后,生存诉anguillarum监测消毒海水中增加了生物膜涂布瓷砖(图5)。第一天没有强烈的差异之间的cfu生物膜涂层陶瓷(cfu毫升⁻¹)和“空白”样本(cfu毫升⁻¹)。3天到第14天的生存诉anguillarum很明显负面影响的蹩脚Pseudoalteromonas(3天:cfu毫升⁻¹;7天:cfu毫升⁻¹;14天:cfu毫升⁻¹)相比,控制(3天:cfu毫升⁻¹;7天:cfu毫升⁻¹;14天:cfu毫升⁻¹)。然而,天21至28的数量诉anguillarumcfu再次增加(21天:cfu毫升⁻¹;28天:cfu毫升⁻¹)。

3.4。的发展P。sp。应变MLms_gA3活细胞计数的治疗诉anguillarum

MLms_gA3的活细胞计数,添加浮游细胞或固定在海藻酸珠子或瓷砖,也被绘制在一段时间内(图28天的存在6、浅灰色酒吧)和缺乏诉anguillarum(控制、深灰色酒吧图6)来确定的影响诉anguillarum在MLms_gA3的生存。MLms_gA3添加为浮游细胞的活细胞计数增加,略高于28天内从第14天开始控制。除了控制治疗,没有发现活细胞计数下降14天至28天(图6(一))。

正如预料的那样,当MLms_gA3海藻酸的形式添加珠子,几乎没有公布MLms_gA3细菌被发现在控制,以及设置诉anguillarum 0天(表1和图6 (b))。然而,在24小时内细菌数量增加10 ~⁵cfu毫升⁻¹在这两种治疗方法以进一步提高~ 10⁶cfu毫升⁻¹直到28天(图6 (b)、表2)。因此,MLms_gA3几乎相同的生存之间设置的第一天,28天但略减少的诉anguillarum。

虽然陶瓷与消毒海水冲洗三次,天0 ~ 10⁴cfu毫升⁻¹造成MLms_gA3细菌初发布。的cfu-numberPseudoalteromonas在治疗压力诉anguillarum增加的控制(~ 10⁶cfu毫升⁻¹,图6 (c))。事实上,它甚至更高(略)海水时接种诉anguillarum。的MLms_gA3固定在瓷砖(消毒海水孵化后28天)由SEM分析检查生物膜(图的状况7)。只有很少的细胞被认为住在陶瓷的小蛀牙。因此,最后(28天)Pseudoalteromonas生物膜没有覆盖整个tile-surface出发。

4所示。讨论

在海洋水产养殖,特别是对观赏鱼的养殖,益生菌是最常用的液体或粉末配方。据推测,这些补充剂对只有短期效应,因为他们可能会被过滤和/或扑杀浮游细菌无法存活胃肠通道。当潜在的益生菌微生物被过滤系统等有益细胞不再是直接可用,无论是父母的鱼,还是为他们的鸡蛋或孵化幼虫。因此,针对更持续供应和可用性,尤其是对基质已成熟的雌鱼,小丑鱼和鸡蛋离合器,我们开发了两个固定系统包含一个假定的益生菌Pseudoalteromonas应变之前证明显示反弧菌活动(20.]。

明显的减少诉anguillarum活细胞计数控制设置(没有任何添加P。sp。应变MLms_gA3)最终由于缺乏营养的人工海水(饥饿)。在饥饿条件下细菌能够存活在较小的单元尺寸(32),这可能是由电子显微图检查或细胞计数降低,同意的先前的研究结果诉anguillarum(33]。另一方面,MLms_gA3治疗细胞数量增加诉anguillarum。虽然细胞,至于诉anguillarum,满足饥饿条件下,活细胞计数增加,直到第14天。这些结果与观察Pseudoalteromonas细胞可以存活数年“在无菌,unsupplemented海水”(34]。细胞分裂和生长可能是支持饲养细胞溶解诉anguillarum细胞的活细胞计数MLms_gA3成为控制略高于从第14天开始。

最初的增加诉anguillarum生存在海藻酸添加“空白”珠子可能是由于海藻酸本身提供的饲养效果。细胞外的裂解酶可能产生的诉anguillarum可以降低polymannuronate polyguluronate,海藻酸盐化合物(看过的35])。结果寡糖可能诉anguillarum碳和能源(36]。这也是可想而知的诉anguillarum殖民统治的“空白”的珠子,从而获得保护(10]。

的生存诉anguillarum虽然轻微,积极影响的“空白”瓷砖,SEM-analysis(补充数据,图S2)。虽然生物膜的形成诉anguillarum没有可检测,细胞聚集形成支持的瓷砖,从而给躲避饥荒不能排除。没有参数,使用材料,海藻酸和陶瓷,都没有负面的影响诉anguillarum。

一种海藻酸喂养效果也可能占的初始增加可行诉anguillarum数的设置设计陷害了Pseudoalteromonas细胞,这一发现可能是支持或促进释放低数量的益生菌在实验的开始。符合这样的假设是随后反监控弧菌效应,表现为降低后者的集落形成单位的数量逐渐减少,直到第14天,伴随着同时增加Pseudoalteromonas可行的计数。

Pseudoalteromonas citrea,共享一个约。95%相同的16 s rRNA在这项研究中使用的应变(20.),生产,而疏水抗菌化合物2-n-pentyl-4-quinolinol (PQ)。原本孤立的从海洋假单胞菌(37),PQ的确是限制的增长不仅显示金黄色葡萄球菌但也弧菌物种(38]。随着疏水性排除了其分散在水环境(14),和信息之间的直接接触是必要的发挥其抗菌作用。尽管复合属性类似于PQ有助于候选人观察拮抗作用,还有待阐明是否这里使用的应变产生这种分子。

几乎完全缺乏瓷砖上的生物膜后28天可能是由于消毒海水中的养分的供应量有限。于是,离开在连续饥饿能动的细菌细胞生物膜进一步寻求营养。这只是一个细胞的生物膜提供充分的反面合并和粘在一起39]。是预期的在活的有机体内实验中,当Pseudoalteromonas生物膜从海水不断提供营养物质(有机和无机化合物(40),以及微藻(41)一个更稳定和健壮的生物膜的形成。因此,生物膜生长在瓷砖代表一个选项与益生菌长期供应。无论将来可能增加生物膜的稳定性在活的有机体内实验,前两周内的拮抗作用的监控在体外设置应该已经足以保护小丑鱼蛋离合器,它成熟[8 - 9天内42]。此外,就可以检查适用性和水产养殖条件下生物膜对瓷砖的影响。由于细菌、固定生物膜固定相的细胞,是已知的有效生产次生代谢产物(12),后者可能放缓以及生产Pseudoalteromonas生物膜破裂,同意增加诉anguillarum21天的活细胞数。此外,溶解生物膜可以释放消化物质,如多糖、DNA和蛋白质,另外加速的增长诉anguillarum。随着Pseudoalteromonas活细胞计数保持几乎不变的整个时期,而的数量诉anguillarum增加,增长之间似乎有一种平衡Pseudoalteromonas伴随细胞死亡,必须检查,例如,DAPI-staining记录整个细胞数量。自活细胞计数Pseudoalteromonas并不适合监控生物膜固定细胞的生存、生活/死染色(43在未来的实验应该执行)。

5。结论

Pseudoalteromonassp。MLms_gA3成功地固定在海藻酸珠子和瓷砖表现出有前途的在体外反弧菌活动,从而进一步提供了依据在活的有机体内实验。两个系统可能适合改善水质的长期供应与益生菌在海洋水产养殖,受损的生存诉anguillarum比浮游Pseudoalteromonas细胞。海藻酸珠子可以而且作为食品补充剂,因为嵌入细菌从鱼胃肠道环境保护,确保其长期有益的行动。在进一步的实验中氨基酸和维生素可以测试添加剂支持鱼健康和活细胞计数的珠子能被溶解在碳酸氢钠溶液(10]。生物膜在瓷砖上有前途的工具,用于装饰水产养殖,因为他们可以直接保护鸡蛋离合器与病原微生物感染。

缩写

每股收益:	胞外聚合物的物质
菌落:	集落形成单位
d:	一天
莱布尼兹研究所DSMZ:	德国的微生物和细胞培养
马:	海洋琼脂
m:	海洋的清汤
生理盐水:	氯化钠
OD:	光密度
p . citrea:	Pseudoalteromonas citrea
P。sp.应变MLms_gA3:	Pseudoalteromonassp.应变MLms_gA3
rel。非盟:	相对任意单位
扫描电镜:	扫描电子显微镜
诉anguillarum:	鳗弧菌
ZMT:	莱布尼兹中心热带海洋生态GmbH德国不来梅。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者欣然承认金融支持德国工业研究协会联合会(如果Projekt GmbH,资金代码KF2665502MD0)。谢谢也由于NanoAnalytics GmbH(德国明斯特)与扫描电镜分析的支持。

补充材料

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