榄蠵龟海龟孵化成功的微生物丰富的微环境原位窝在Ostional沙子,哥斯达黎加

文摘

海龟孵化成功质量筑巢海滩通常低于单独筑巢海滩,可能部分是由于高微生物代谢产生的有机物的大量输入海龟蛋。因此,我们测试了假设孵化成功因地区而异的海滩与物理巢环境和微生物丰度的差异原位榄蠵龟在Ostional海龟巢穴,哥斯达黎加。我们明显自然巢在高密度、低密度和tidal-wash海滩和监控的嵌套区域离合器pO₂在潜伏期和温度。我们量化孵化成功在巢中发掘和收集的样本巢沙子。我们量化微生物(细菌和真菌)丰度定量聚合酶链反应(qPCR)分析。孵化成功是较低的低巢pO₂、高温、高有机质含量、高微生物丰度。我们的研究结果表明,巢内的低氧环境可能是由于微生物丰度高,分解率的巢沙子和这些因素,随着温度的增加离合器在高密度嵌套区域,集体负责Ostional低孵化成功。

1。介绍

榄蠵龟海龟(摘要本文报道)被世界自然保护联盟列为一个脆弱的物种。这个物种的主要威胁包括渔业捕获栖息地退化,和鸡蛋的不可持续的收获1]。这个物种的特征是一个嵌套行为多态性,与一些雌性嵌套寂寞地和其他嵌套集体。大规模的嵌套事件在Ostional,哥斯达黎加是一些世界上最大的,与(或事件arribadas)估计高达约500000筑巢的雌性2]。每年arribada丰度在Ostional表现出减少在过去的15年里,已被部分地归因于特别低孵化成功在这个海滩(8%;(2,3])。虽然巢密度可以影响孵化成功(由于发展胚胎生理需求)之间的竞争,意味着在Ostional巢密度不高足以降低孵化成功的大幅低水平观察(4,5]。

相反,一些研究表明,胚胎死亡率与产生的高微生物负载分解鸡蛋被随后的小海龟在这些高密度arribada事件(4,6,7]。例如,一项研究在一个arribada海滩上观察到更高的温度和二氧化碳的分压(pCO)₂),和更低的氧气分压(pO₂),在卵孵化原位和孵化器(8]。同样的研究也报道增加孵化成功的清洁(潮汐冲刷和渗)孵化器砂相比,天然的沙滩。因此,微生物负载和有机质大概可以负责这些差异和可能影响孵化成功。事实上,营养负荷和细菌丰度,质量筑巢海滩的沙子远高于在邻近的海滩9,10]。此外,科尼利厄斯et al。6)建议观察增加孵化巢在涨潮线下的成功可能是由于自然潮汐洗涤,可以去除微生物不能容忍盐水。另一项研究在arribada海滩发现,虽然细菌phylotype丰富性和多样性增加而增加巢密度高,中间区域的海滩,这不是真正的低区海滩,或许是由于不稳定的渗透环境引起的潮汐(11]。

细菌和真菌培养,分离出巢沙子和失败的鸡蛋以及嵌套泄殖腔流体的女性(10,12,13]。然而,海龟蛋的文献感染微生物是有争议的。微生物感染通常被认为是机会主义和有限的实验室研究没有发现显著的影响存在的细菌或真菌的人工孵化生产榄蠵龟海龟蛋(10,12,14]。最近的研究腐皮镰孢霉菌物种复杂已经确定了几个真菌病原体海龟蛋(15,16]。然而,鸡蛋感染f .以上可以无症状15这个因果关系[]和其他的研究挑战17,18]。这些研究反映的困难直接胚胎死亡率与微生物的存在,在一定程度上由于受保护物种进行研究的局限性以及失败总窝在此类研究的发生率较高14,19]。

虽然微生物密度较高的负面影响孵化成功Ostional一直认为,没有先前的研究直接量化微生物丰度或鸟巢的相关条件环境对自然巢孵化成功。因为海龟胚胎死亡率可能与许多因素有关,有必要评估整个筑巢环境为了充分理解之间的交互的鸡蛋和microecosystem包括海龟巢穴(13,20.]。

本研究的目的是描述自然条件的海龟筑巢环境Ostional为了确定可能不利的因素影响海龟胚胎发育。我们测试的假设中孵化成功不同的海滩与鸟巢环境和微生物丰度的差异。我们预测,提高孵化成功将发生在海滩地区暴露在潮汐洗涤和微生物丰度之间存在反比关系,孵化成功。为此,我们监控巢(即条件。,temperature, oxygen, and organic matter content) and hatching success in natural nests located in different areas of the beach and quantified the microbial abundance in nest sand.

2。方法

2.1。研究网站

Ostional国家野生动物保护区(ONWR)位于太平洋海岸的柯雅半岛在哥斯达黎加(9.996471°N, 85.697800°W)。在ONWR Nosara和Ostional海滩与可变宽度大约7公里的海滩。这项研究是由Ostional海滩在雨季(5月到11月),2012年的时候arribadas通常更加丰富。研究巢都是在同一个晚上arribada发生在2012年8月的下弦月(以下简称样本arribada)。这确保了所有巢孵化同时帮助标准化任何可能影响孵化成功的不可控制的变量,如环境温度和降雨量。

我们比较了微生物丰度与孵化成功的自然(原位)巢位于tidal-wash区域,高密度的地方筑巢arribadas倾向于集中,和一个低密度筑巢区。tidal-wash海滩区域位于25米内泻湖tidal-wash区,潮水在哪里洗沙堤和引起砂营业额。高密度嵌套区域是位于主要筑巢海滩,那里的样本arribada记录密度最高的嵌套女性。低密度嵌套区域位于样本arribada被记录的最低密度筑巢的女性。巢密度的样品arribadastrip-transect-in-time方法测定和确认样方取样时开挖(5,21]。

我们随机选择5个巢tidal-wash高潮平均线以上,high-nest-density, low-nest-density海滩上面描述的领域。鸡蛋是在产卵数来确定离合器总数。数据记录仪和氧管被放置在中心的巢室,大约50后鸡蛋了。5-sided 50×50×15厘米钢丝笼与一个木制框架放在下面的巢和完全埋砂的表面以防止捕食和开挖随后筑巢的雌性。这个笼子上面拉砂的表面在40天的孵化让幼仔出现表面通畅。巢被监控每天三次(日出,日落,和午夜)孵化的迹象,以计数和幼仔尽快发布。

2.2。巢阿宝₂

巢阿宝₂被放置空气监测石头装有60厘米的尼龙管进鸡蛋质量的中心,从内部的巢室顶部一个切断阀的砂层阻碍任何额外的气体交换(4,8,22]。pO₂鸡蛋内离合器使用流水线式氧传感器测量(S108氧分析仪,量子位系统)校准场赛季前使用氮和前每组样本使用大气。静气空间内(大约10毫升)从油管和驱逐了抽样之前,以确保巢腔内的空气样本。空气样本(大约60毫升)用密闭注射器在1 h的收集和分析。通过气泵样本慢慢注入,流量计,干燥剂列和通过O₂传感器的流量大约50毫升分钟⁻¹。空气样本分析每5天前30天的孵化和每4天潜伏期结束。气体比例被转换为使用环境气压分压。

2.3。巢温度

巢温度监控使用流浪汉吊坠温度数据记录仪(发病计算机公司)放置在每个离合器的中心和程序记录温度每隔3 h在午夜开始产卵晚通过人工孵化的出现。每天窝平均气温是用来比较巢温度在不同地区的海滩。

2.4。巢发掘

一次性无菌手套都是穿了发掘和改变之前接触不同的巢穴。巢遗骨最后三天后观察人工孵化的出现量化孵化成功(23]。

2.5。砂收集和描述

砂收集的样本直接进入无菌收集管中心的巢室的开挖期间巢的潜伏期。样本放在冰后立即集合,然后冷冻(−20°C)或保存在福尔马林(甲醛2%)在6 h(之前收集和分析。有机物分析由强热失量方法,有机质含量是干燥燃烧后的质量损失。样品被转移到一个瓷容器和干燥烘箱(24小时在100°C)在燃烧之前(6 h在500°C)。在燃烧之前,样品的干砂分离的筛子(0.063,0.075,0.15,0.25,0.45,和0.85毫米)来确定颗粒的质量。平均粒径(),排序()和偏态()计算使用对数数学GRADISTAT“矩量法”(24,25]。

2.6。微生物丰度

样品保存在福尔马林被用于显微镜计数作为二次量化细菌丰度的方法。这些样品离心10分钟在16000克微型离心机之前仔细去除多余的福尔马林。沙子被稀释(大约1:2)和无菌水用在冰上20 s 30 W(声波降解器s - 250 a,布兰森)。得到的上清液是彩色大约5分钟1:10 1 x SybrGold和无菌水的稀释。显微镜计数进行在一个数字化的1000 x放大显微镜(Optiphot-2,尼康)通过计算10每张幻灯片字段。g细胞的数量⁻¹沙子然后计算基于最初的沙子的重量,体积稀释剂和上层清液,细胞的平均数量⁻¹每张幻灯片使用字段的数量在1000 x (4.79×10⁴)和校正因子的福尔马林(×1.16)。

我们使用定量实时聚合酶链反应(qPCR)分析来确定细菌的丰度基于16 s rRNA g基因副本的数量⁻¹巢沙子和丰富的真菌基于18 g s rRNA基因副本的数量⁻¹巢沙子。而从qPCR基因拷贝的结果量化分析不能直接转化为细胞的数量(鉴于拷贝数物种之间有很大的差异,这可以作为整体的一个代理大量的微生物群(26- - - - - -28]。

2.7。DNA提取

每个样本解冻和均质砂的涡流在收集1 g子样品进行DNA提取。DNA提取所有的沙子样本使用EZNA土壤DNA工具包(ωBiotek)以下修改协议增加DNA产量。样品受到振荡5分钟约2000分钟⁻¹珠搅拌器(迷你Beadbeater-8, Biospec产品)和三个冻融循环(−20°C和70°C为每30分钟)中溶解的一步。此外,在提取只有50的最后一步μ使用L(洗脱缓冲,列在第二洗脱步骤重新应用。DNA样本稀释以减少抑制和优化效率和Ct值范围内的标准曲线。

2.8。qPCR分析

使用iCycler智商绝对qPCR运行实时PCR检测系统(Bio-Rad实验室,Inc .) 96孔板。结果分析了使用iQ5软件(Bio-Rad实验室,Inc .)。普遍的细菌引物926 f (5′AAA CTC AAA KGA ATT广汽GG-3′)和1062 r (5′CTC ACR RCA CGA GCT GAC-3′)目标16 s rRNA基因使用基于de gregori et al。(以前的研究29日]。每10μL反应包含以下:5μL绝对qPCR大师混合(ABgene), 0.1μL牛血清白蛋白(10μgμl⁻¹;热科学),0.3μ每个引物(10 Lμ米、300 nM最终浓度;集成DNA技术),3.9μL H₂啊,和0.4μL模板DNA。PCR条件15分钟在95°C,紧随其后的是40 95°C的周期15秒,15秒的退火温度57°C,并为20年代72°C。

通用真菌引物FR1 (5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′)和FF390 (5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′)目标18 s rRNA基因使用基于以前的研究(26,30.]。每10μL反应包含以下:5μL绝对qPCR大师混合(ABgene), 0.1μL牛血清白蛋白(10μgμl⁻¹;热科学),0.1μ每个引物(10 Lμ米、100 nM最终浓度;集成DNA技术),4.3μL H₂啊,和0.4μL模板DNA。PCR条件15分钟在95°C,紧随其后的是40 95°C的周期15年代,30年代的退火温度50°C,并为1分钟72°C。

2.9。qPCR标准

外部、固定标准是由放大和量化细菌和真菌DNA使用底漆集目标完整的16 s / 18 s rRNA序列。对细菌和真菌标准模板提取DNA是从文化的友情提供的杆菌、(w .钩,格赖斯海洋实验室,查尔斯顿学院的查尔斯顿,SC)疫霉capsici(j . Ikerd美国蔬菜实验室、美国农业部农业研究所,查尔斯顿,SC),分别。细菌通用引物8 f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 r′)和1492 (5′- - - - - -GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)使用以下PCR条件:3分钟在95°C,紧随其后的是30 95°C的周期为1分钟,1分钟的退火温度45°C, 72°C 1.5分钟,最后4分钟在72°C的伸长一步(31日,32]。为真菌通用引物NS1 (5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS8 (5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′)是用于下列PCR条件:4分钟在95°C,紧随其后的是30 95°C的周期为1分钟,2分钟的退火温度55°C, 72°C 1.5分钟,10分钟的最后一个伸长一步在72°C (33,34]。每个25μL PCR反应包含以下:5μL的缓冲区(5 x无色GoTaq福莱希缓冲区,Promega), 3μL (MgCl₂(25毫米;Promega), 0.25μL牛血清白蛋白(10μgμl⁻¹;Promega), 0.5μL核苷酸(10毫米;热科学),0.5μ每个引物(5 LμM;集成DNA技术),0.1μL的DNA聚合酶(5 Uμl⁻¹;GoTaq福莱希DNA聚合酶,Promega), 13.15μL H₂啊,2μL模板DNA。细菌和真菌PCR产品运行在0.5%琼脂糖凝胶纯化QIAquick凝胶萃取设备(试剂盒)和筛选了30μL在最后一步。标准量化利用量子位dsDNA BR检测设备(表达载体,生活技术)和一个量子位2.0荧光计(量子位系统)来确定DNA的数量在最后的样本。扩增子的长度被用来计算每个副本的数量μL,假设每个英国石油(bp)的分子量是650。标准曲线生成使用10倍稀释这些标准的8个数量级,因此标准化qPCR拷贝数的结果。

每个板包括一式三份的反应/ DNA样本和标准曲线,以及没有模板控制检查污染。融化曲线(在95°C 1分钟,1分钟55°C, 10 + 0.5°C⁻¹到95°C)使用每个qPCR运行,确保年底荧光信号产生特异性PCR产品而不是从引物二聚体或其他非特异性的产品。混合染料荧光素包含在主允许跨样本标准规范化的错误。阈值周期(Ct)是由软件自动计算基于平均背景噪音。样品还有不到一个数量级的分离(3.3 Ct值)之外没有模板控制被排除在外,因为这是目前分析的检出限(35,36]。这些样本重新分析使用相同的标准曲线,减少稀释模板,以确保准确的量化。样本低于检出限无论稀释被排除在分析之外。

2.10。统计分析

统计分析进行了使用人民币10 (SAS研究所http://www.jmp.com/)。成功孵化,温度,阿宝₂细菌和真菌丰富,有机质含量和平均粒径数据都使用方差分析分析。当常态和方差齐性的假设是不满足,非参数测试(Wilcoxon /克鲁斯卡尔-沃利斯)使用。统计上显著的结果进一步测试图基的HSD事后测试来确定海滩地区之间的显著差异。变量之间的关系(孵化成功,阿宝₂、温度、粒度、有机质含量、细菌和真菌丰度)进行评估使用斯皮尔曼等级相关系数。

因为海龟胚胎的代谢需求很低在上半年孵化给定有限的开发、氧含量和温度的差异在蛋中离合器在这个时期可能是由于微生物活动(8,37]。意思是巢阿宝₂因此温度分析第一和第二单独孵化的一半。重复测量的温度和氧气也重复措施MANOVA分析。允许跨qPCR板样本比较,一个ANCOVA被用来确保之间没有显著差异从不同的运行标准曲线。我们也用积极的控制在每板计算变异系数(CV),以确保在所有板块之间和再现性。所有的值表示为±标准错误(SE)。百分比数据(孵化成功)和微生物丰度数据(拷贝数)反正弦和对数转换,之前分别与参数统计分析。平均粒径从φ为单位(为演示)毫米。16 s ul / 18 s副本的数量⁻¹的模板转换为16 s / 18 g s副本的数量⁻¹巢的沙子,允许跨样本进行比较。所有分析测试的统计学意义。

3所示。结果

样例arribada发生在2012年8月(估计为72152产卵的雌性)和另一个arribada(2012年9月,211954年估计为产卵的雌性)发生在巢中发掘是十月中旬。里氏7.6级地震发生在9月5日,2012年,震中位于Ostional以南大约50公里,海滩地形造成明显的结构性变化。巢密度对整个海滩在挖掘的时候鸟巢米⁻²和整体孵化成功的巢在8月主要筑巢海滩上了arribada是% (r·瓦尔韦德未公开的数据)。在挖掘的时候,巢密度high-nest-density, tidal-wash, low-nest-density地区,,鸟巢米⁻²,分别。两个巢穴被排除在分析由于不可预见的因素,可能造成改变的变量在这项研究中,我们试图控制(即。、温度和阿宝₂鸟巢)。具体来说,我们排除了一窝在高密度嵌套区域部分阴影的棕榈树,另一个在tidal-wash嵌套区域保持永久淹没附近的地震之后河口。孵化成功high-nest-density地区(0.6%)显著低于low-nest-density(68.2%)和tidal-wash(54.7%)的海滩区域(,图1)。

pO₂在鸡蛋离合器high-nest-density地区明显低于在其他领域的海滩在第一个(kPa,)和孵化下半年(kPa,;图2)。均值最小订单₂巢中high-nest-density面积为9.7±0.3 kPa,离合器展示pO₂低至8.7 kPa。巢阿宝₂海滩和孵化日之间存在着显著的差异,一个重要的这两个因素之间的相互作用发生(,;,;,、职责)。孵化成功呈正相关,阿宝₂在第一和第二一半的潜伏期(,和,,分别地。、表1)。

巢tidal-wash地区气温显著降低孵化的第一和第二部分(和,分别地。,图3)。high-nest-density海滩区域的气温最高的孵化(下半年°C)和仍高于致命的限制(35°C, (38])明显更长时间相比其他地区的海滩(d,)。巢与海滩和孵化,温度的分布存在显著差异,一个重要的这两个因素之间的相互作用发生(,;,;,、职责)。然而,孵化成功没有明显与第一或第二窝温度孵化(表的一半1)。

巢砂的有机质含量明显高于high-nest-density地区(4.0%)比low-nest-density(3.2%)和tidal-wash(3.0%)的海滩区域(和、职责)。沙子从巢low-nest-density地区明显更大的平均粒径比在high-nest-density(0.366毫米)(0.282毫米)和tidal-wash(0.283毫米)的海滩区域(对于比较)。此外,沙子从所有high-nest-density巢穴,tidal-wash, low-nest-density地区的海滩是适度排序(1.0、1.01和0.98,分别地。)和细倾斜(0.35、0.36和1.03,分别地)。

没有显著差异在化验的标准曲线的斜率为细菌(,斜率=拦截=简历= 3.41%)或真菌(%,斜率=拦截=简历= 1.68%),表明复制数据可比在化验(和、职责)。显微镜计数(范围5.72×10⁶-7.43×10⁷细胞g⁻¹巢砂)与16 s rRNA qPCR结果密切相关的基因拷贝数g⁻¹沙子的巢穴(,)。两个16和18年代复制数字一窝low-nest-density地区以及18岁拷贝数两巢tidal-wash地区低于目前的检测极限分析,因此省略。

有更高的细菌丰度在巢砂high-nest-density面积相比其他地区的海滩()。也有大量的真菌巢高沙high-nest-density地区的海滩上,虽然这种差异是边际()。虽然之间存在着负相关和细菌丰度巢孵化成功,成功孵化和真菌丰度之间的相关性是边际(,和,,分别地。、表1和图4)。之间存在着负相关的细菌数量和鸡蛋离合器pO₂在第一次和第二次孵化的一半(,和,、职责)以及之间的正相关细菌的数量和下半年的孵化巢温度(,、表2)。此外,有一个积极的细菌丰度和有机质含量之间的相关性在巢海滩的沙子在所有区域(,)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们检测巢条件在潜伏期和量化微生物丰富的巢砂与海龟孵化成功。我们发现微生物丰度之间的负相关关系巢沙子和孵化成功的阿宝和观察到显著低₂鸡蛋离合器位于high-nest-density地区的海滩。蛋离合器位于海滩有更高的tidal-wash区域孵化成功,阿宝₂以及低有机质含量比位于high-nest-density海滩区域。这些结果与先前的报道是一致的,海水对孵化成功(可能有积极影响39,40),可能通过减少微生物丰富,孵化温度、和/或有机质含量。我们的结果也支持我们的假设,阿宝₂与微生物丰度高巢砂负责孵化率降低观察到Ostional海滩。总的来说,这些数据表明海龟不致病的机制导致胚胎死亡率高巢环境微生物分解改变胚胎发育的最优范围之外。

因为所有巢穴在这项研究中孵化在同一时期,我们相当确信大多数因素影响胚胎发育和孵化成功合理的控制。然而,可能有因素,我们没有监控,导致在巢条件不一致,有可能影响孵化成功的在这个研究。此外,大地震震级,如一个发生在这项研究中,可以轻松造成movement-induced海龟胚胎的死亡率。然而,地震发生在25天的孵化,在关键时期(12 h 14 d)在此期间运动显著降低孵化成功(41),因此可能没有不利影响的蛋离合器在这项研究。

4.1。孵化成功

成功孵化巢位于low-nest-density地区最高。High-nest-densities曾被观察到有直接的生理效应(即。,降低阿宝₂和更高的pCO₂鸡蛋内离合器),负面影响孵化成功4]。巢密度5巢m⁻²不太可能有重大影响孵化成功(≥56%),而密度9 m巢⁻²可能显著降低成功孵化(30%4]。然而,窝在这项研究中受到相对low-nest-densities(2 - 5巢m⁻²),它可能不够高,足以导致孵化成功观察到显著下降。

4.2。巢中氧含量

阿宝₂low-nest-density和tidal-wash地区的海滩之前观察到类似于在其他研究榄蠵龟海龟(4,8]。这些研究还观察到的变化₂巢的潜伏期,阿宝₂减少在潜伏期由于胚胎呼吸。海滩上的显著的交互效应区和孵化蛋日离合器pO₂表明,阿宝₂蛋离合器内以不同的方式改变了整个地区的海滩。

另一方面,阿宝₂观察鸡蛋离合器位于high-nest-density地区在这项研究中低于先前观察到的其他研究[8,22,42]。具体地说,阿宝的下降₂我们观察到早期的潜伏期是不寻常的海龟蛋离合器由于胚胎的代谢活动通常是微不足道的(这个时候42]。离合器阿宝₂通常通过孵化上半年保持不变,然后下降,往往是与每个离合器的代谢胚胎数量负相关(8,22]。然而,这并非如此的离合器位于high-nest-density区域pO的海滩₂开始下降从一开始孵化和较低的第一和第二个一半的潜伏期相比其他地区的海滩。

微生物丰度之间的负相关(细菌和真菌)和离合器₂在Ostional表明微生物分解负责这些订单的减少₂。特别是,我们的观察细菌丰度高,有机质在巢海滩的沙子从high-nest-density区域与低pO₂进一步支持这一假设。另外,如果这个订单减少₂导致胚胎被分解的病原体在这些巢穴,期望一个延迟时间(即。,感染)和一个氧气和温度的突然改变后胚胎死亡。此外,尽管巢密度影响巢的氧含量,最低订单₂观察high-nest-density地区(9.7 kPa)在这项研究中低于先前观察到类似的甚至更高的巢密度(约14.5 - -17.0 kPa) (4,8]。鉴于这些先前的研究在“干净”砂(大概低有机质含量)没有发现这种差异在pO₂蛋离合器在密度相似,很可能微生物分解负责观察到的差异。然而,进一步的研究,包括阿宝的控制措施₂鸡蛋以外的沙滩离合器和蛋内离合器控制密度是必要的适当测试这个假说。

因为海龟胚胎有相对较低的耐缺氧早期潜伏期(43),很可能下降₂我们观察到在high-nest-density海滩区域总窝导致失败。虽然榄蠵龟的临界氧张力海龟蛋还没有被研究过,这个值高达16.5 kPa红海龟孵化的22天(Caretta Caretta)鸡蛋,可比的大小(43]。假设的临界氧张力榄蠵龟海龟蛋和考虑到鸡蛋离合器pO相似₂跌破16.5 kPa 15天的孵化high-nest-density区域,任何鸡蛋很可能被暴露于pO位于这里₂致命的阈值以下。

4.3。巢温度

在这项研究中观察到的巢穴的温度在其他类似研究榄蠵龟海龟在这个区域(4,8,38]。一般来说,平均孵化温度高于平均关键温度为30.5°C橄榄雷德利(44,45),表明人工孵化的性别比例可以在Ostional“女性占优势的,正如前面建议(38]。先前的研究还观察到在潜伏期巢穴的温度的变化,随着温度增加后孵化与增加胚胎代谢(4,8]。巢气温相当一致的不同区域的海滩在潜伏期,除了巢位于tidal-wash区域,在巢穴的温度低可能是由于水分含量较高的沙子。潜伏期2到3天时间在这群巢和可能是由于胚胎发育慢由于巢穴的温度低46]。

虽然大多数巢内温度下降海龟发育发展广泛的宽容(25 - 35°C, (39])潜伏期,略高的温度观测high-nest-density地区的海滩在孵化可能超过这个最佳射程足够长的时间影响孵化成功。虽然场致命的限制榄蠵龟海龟在这个海滩大约是35°C,胚胎可能能够恢复从短期暴露于高温久时间是致命的38]。本研究的结果支持这一观点,因为较低的巢孵化成功(high-nest-density区)也暴露在温度高于致命更长时间的限制。从胚胎代谢释放热量的不同组合和/或微生物分解可能是负责观察在孵化温度上的差异。

4.4。巢砂的特点

沙的平均粒径、分选系数从巢穴在本研究与先前观察到各种各样的海龟筑巢海滩(47]。考虑到相对较小的范围可以在研究观察平均粒径的巢穴(0.282 - -0.366毫米),粒度测量可能并未推动孵化成功的差异跨领域的海滩。

有机质的大量沙子从这项研究相比其他海龟筑巢海滩47]并不奇怪,因为这是有可能的结果高巢破坏由于大量的嵌套女性和high-nest-density在这个海滩9,19,48]。协会高有机质含量较高的沙子从high-nest-density地区丰富的细菌在这项研究支持了假设高有机物与微生物增殖的增加相关联,在Ostional分解,也可以解释低蛋离合器pO₂相比以前的研究(7,8]。

4.5。微生物丰度

16 s细菌和真菌的数量18 s rRNA基因复制在这个研究范围从10⁵到10¹⁰g副本⁻¹海龟筑巢的沙子。一项研究发现,在一个沙滩上arribada海滩包含六个数量级更多细菌菌落g⁻¹邻近的海滩相比,虽然没有特定的丰富数据提供(10,14]。先前的研究,量化16或18 s rRNA基因副本之间类似的沉积物中发现10⁶和10⁹g副本⁻¹(26,49]。

细菌丰度之间的负相关关系和孵化成功,我们观察到支持的假设微生物丰度在巢砂Ostional足够高,影响胚胎发育。具体来说,我们认为这种关系背后的机制是不致病的,而是由于高微生物分解有机物改变巢环境超出了胚胎发育的最佳范围。研究地下筑巢的鸟类和爬行动物窝pO建议类似的微生物分解的影响₂和温度(50,51]。可能是微生物活动和孵化成功之间的关系是非线性的,用一个阈值超过此高微生物呼吸破坏氧气的扩散鸟巢的阻碍胚胎发育。例如,微生物数量之间的关系和孵化成功似乎在~ 1×10达到一个阈值⁹-10年¹⁰16 s / 18 s g副本⁻¹巢沙子。进一步研究跨广泛的微生物丰度需要证实微生物丰度之间的关系的本质的巢沙子和海龟孵化成功。低pO的同时发生₂,更高的温度,更高的有机物,低孵化成功high-nest-density地区的海滩是一个极端的例子在Ostional不利条件下,微生物分解。

除了对巢环境微生物丰富的间接影响,还有其他可能影响微生物的存在对海龟孵化成功,我们没有考虑,因为他们没有在本研究范围内。例如,我们没有探索物种组成和多样性也没有我们评估病原体的存在与否。潜在的致病微生物在砂Ostional不能被排除。几个种类的真菌腐皮镰孢霉菌物种复杂已确定病原体海龟蛋和已知发生在世界各地的筑巢海滩(15,16]。也有可能的影响微生物丰度和孵化成功的巢环境协同与致命的病原体的影响(15]。例如,一旦胚胎死亡的不利影响微生物对巢环境缺氧,这可能导致真菌的增殖,可以扩散到相邻的鸡蛋。进一步的研究应关注抽样巢环境(即从几个组件。,cloacal fluid, nest sand, eggshell, unhatched embryos, and live hatchlings), as well as assessing the abundance, diversity, and activity of both fungi and bacteria to provide a more complete understanding of the relationship between microbial activity and the reproductive success of sea turtles.

基于我们的比较研究,似乎潮汐洗减少有机物和微生物丰度在沙子里,从而增加孵化成功。另外,高湿度的洗砂产生的潮汐也可能防止孵化温度达到致死温度。因此,海水泛滥可能维持人口的关键在Ostional海龟。使用这些自然保护机制作为一个模型,也可能采用管理实践,促进改善胚胎生存和人工孵化的生产。例如,海水可以用来减少有机物和微生物丰富的孵化器砂或定期冲洗沙滩和海水。治疗沙子或搬迁孵化场定期的常规管理实践保护计划,以避免有机物质积累以及微生物和幼虫感染。事实上,棱皮海龟保护项目Ostional成功增加孵化成功的棱皮龟孵卵所使用的沙子在高潮线下(40]。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢g .麸皮,y Arguello-Gomez, m·戈麦斯美国斯蒂尔,所有的员工和志愿者在RNVS Ostional对他们的帮助。作者还要感谢s Berthrong a . Oporta麦卡锡和r . Leisen贡献分子和实验室分析。这种材料是基于工作由美国国家科学基金会支持下研究生研究奖学金资助。511182年。额外的资金来支持这项研究的实验室和现场研究提供的PADI基金会,国家地理年轻探险家格兰特(C220-12),物保护海龟保护法案(96200 - 0 - g037)和内部从查尔斯顿学院的资助。这项研究是查尔斯顿学院IACUC批准和许可被授予MINAET (Resolucion没有。行为-或-博士- 078)和CONAGEBio (r - 020 - 2012 - ot - CONAGEBio)的哥斯达黎加。

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