阿根廷的第一个分子描述Picocyanobacteria大海

文摘

Picocyanobacteria丰富世界各地的海洋中。特别是,有报道称聚球藻属菌株有广泛纬度的分布,从极地到热带水域。然而,它们的分子表征西南大西洋是失踪。我们分析了聚球藻属遗传多样性在阿根廷,一个行业的一个富有世界海洋的生物领域。16 s rRNA扩增子PCR扩增后获得这个地区的环境从水中提取DNA样本用于DGGE和测序。只有聚球藻属序列可以被检索。另一方面,我们孤立的两个聚球藻属来自环境的压力。我们的分析显示,我组的进化枝是普遍在北纬38°48°年代,可以在大陆架水域与进化枝四株共存。这两个共存的演化支可能与一个适应类/低温水域。我们的数据是第一个报告聚球藻属间那将是重要的贡献者在阿根廷海洋浮游植物生物量,最富有的世界海洋的生物区域之一。

1。介绍

含氧的原核迟钝(蓝藻)估计占总数的大约10%海洋picoplankton上200米(1]。菌株的聚球藻属和Prochlorococcus属海洋picophytoplankton主导世界海洋和为公司做出重大贡献₂固定和初级生产2,3]。尽管属通常在热带和温带海域可以共存,其分布模式不同空间和季节性4,5]。而Prochlorococcus在很大程度上局限于一个40°N-40°S纬度的乐队和大多在贫营养丰富的水域,聚球藻属无所不在地分布在海洋区域从极地到热带水域(6- - - - - -9]。

分子标记的使用基于PCR扩增不同的保守基因,分子探针,焦磷酸测序,茎和序列分析允许定义几个聚球藻属遗传血统使用培养和海洋环境的自然样本(7- - - - - -14]。海洋聚球藻属被分为三个主要subclusters (5.1 - 5.3)15,16]。大多数菌株属于subcluster 5.1,它包含至少10个不同的系统发育演化支据16 s rRNA序列(8]。基于其他序列提出了额外的血统,等16 s- - - - - -23 s rRNA其,N-regulatoryntcA基因和细胞色素的编码序列b6亚基的细胞色素b6f复杂(petB)[9,11,14,17,18]。

分析聚球藻属和Prochlorococcus谱系分布在当地和海洋盆地规模报告了使用数据从邮轮在太平洋,大西洋,印度洋和北极和在红海4,5,13,18- - - - - -20.]。然而,还有很多未知的海洋区域,如西南大西洋的水(21),阿根廷货架及其shelf-break构成海洋生物(最富有的地区之一22]。这是支持的全球研究使用海洋颜色卫星图像显示明亮的特性表示高叶绿素浓度(23,24]。然而,仍然没有ultraphytoplankton组件的分子鉴定报告。因此,考虑到这一海洋地区的重要性,我们开始picocyanobacteria的人口多样性的考试,初级生产力的浮游生物的至关重要的组件。

本研究的目的是为全球的原核生物地理学的知识海洋picophytoplankton组件。因此我们从阿根廷海水域picocyanobacteria特征,最富有的世界海洋的生物区域之一,仍未勘探地区。我们的数据构成的开始更全面的研究在这一地区,而且,重要的是,它是一个知识的贡献聚球藻属多样性。

2。材料和方法

2.1。样本收集、应变隔离和表征

水样收集在重复使用Niskin瓶从5米深度(我)一个永久的沿海站位于马德普拉塔(EPEA)邮轮进行月度机载RV“Canepa队长”(INIDEP)和(2)四站在阿根廷海:两个从大陆架(电台66 - 27)和两个从附近海域(海洋站62 - 20),2006年3月(RV ARA Puerto Deseado巡航GEF ii, PNUD ARG 02/018项目)(图1)。温度和盐度的水体在每个车站海鸟SBE1901 CTD(表记录1)。50毫升的样品是用甲醛固定(0.4%最终浓度)和聚碳酸酯膜过滤的0.2μ孔隙大小。聚球藻属被显微数字化特征和碳生物量计算直接从手机号使用的转换因子0.21 pg细胞⁻¹(25]。聚球藻属分离得到的连续稀释培养法使用f / 10中没有硅酸盐(26]。

2.2。DNA提取、PCR扩增、克隆和测序

从环境样品中提取总DNA,收集5 L的海水在表面Niskin瓶和转移200μm尼龙网一个黑色的瓶子。通过一个3样本预滤器μm图像比对膜(绘画纸国际有限公司,梅德斯通,英国)分离picoplankton随后透过Sterivex单元(美国马Milli-pore, Billerica)蠕动泵。单位被保存在液氮在船上,直到到达实验室,在继续之前储存在−80°C。单位在37°C孵化与溶菌酶(1毫克毫升30分钟⁻¹与蛋白酶K(0.5毫克),然后毫升⁻¹),其次是三个冻融循环。最后,与DNeasy植物DNA提取迷你包(试剂盒)。DNA的分离提取如前所述[27]。

16 s rRNA基因扩增DNA的隔离或从环境样本,使用底漆SYN172F和OXY1313R。这篇文章对放大所有已知的序列聚球藻属subclusters 5.1(演化支i x [8),一些subclusters 5.2菌株,没有淡水聚球藻属菌株,所有光线(LL)Prochlorococcus压力,一些高亮度(HL) HLIProchlorococcus紧张,但没有HLIIProchlorococcus压力(28])。三个环境库EPEA抽样在夏天期间被切断了PCR产品pGEM-T向量和引入大肠杆菌细胞。

氮调节基因的扩增ntcA(方法,特别针对蓝藻)是用于识别小说聚球藻属与分辨率大大高于演化支16 s rRNA序列(11,13]。这对引物1 f / 4 r (29日)是用来放大ntcA基因的分离。表S1中我们总结本研究中使用的寡核苷酸引物序列对网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/237628)。PCR克隆产品使用pGEM-T简单工具根据制造商的指示(Promega公司)。屏幕上的聚球藻属16 s rRNA和ntcA克隆,插入与限制性内切酶消化生态国际扶轮和太平洋标准时间我(Promega公司),分别。质粒DNA分离出三个代表每个限制模式,使用QIAprep旋转Miniprep工具包(试剂盒)和插入排序(Macrogen、韩国)。

2.3。变性梯度凝胶电泳(DGGE)

作为一个多样性的研究方法,分析了环境样品DGGE。放大产品的16 s rRNA基因(从隔离或环境样品从巴塔哥尼亚货架和海洋水域)被用作模板在一个嵌套PCR引物对358第五代计算机/ 907 r (30.)(表S1)。放大产品的16 s rRNA从隔离Syn-EPEA基因。1和Syn-GEF。1were used as references. The products were subjected to DGGE (2001 system, CBS Scientific Company) [30.]。6%聚丙烯酰胺凝胶与梯度DNA-denaturant代理后混合解决方案的40和80%变性剂剂(100%变性剂剂7 M尿素和去离子的甲酰胺40%)。电泳是在100 V和60°C 18 h在TAE缓冲区(40毫米Tris-HCl 20毫米醋酸钠1毫米EDTA, pH值7.4)。DGGE凝胶沾染了100人μL L⁻¹SybrGold(欧洲分子探针,莱顿、荷兰)在TAE缓冲了45分钟,冲洗用相同的缓冲了20分钟,远离紫外线透明凝胶勺的玻璃板,可视化,注册使用Photodyne系统设备(美国洛杉矶Photodyne技术)31日]。著名的DNA乐队从DGGE切除凝胶和筛选了凝胶在一夜之间由无菌水在4°C。这些筛选了产品与引物reamplified 358第五代计算机,没有GC-clamp, 907 r和PCR产物测序。

2.4。序列和系统发育分析

所有16 s rRNA和ntcA基因序列首先与公共数据库中使用基本的局部比对搜索工具爆炸网络服务(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。neighbour-joining和最大的吝啬系统发育树构建方法,和引导分析(1000)复制完成大型版本5 (32]。

3所示。结果与讨论

3.1。隔离和分子识别的两个聚球藻属菌株从沿海和货架的水域

进一步的多样性研究,我们最初孤立聚球藻属压力来自不同地区的阿根廷。在EPEA车站,最大的浮游植物生物量观察值在夏季(December-March),与聚球藻属的主要因素33]。首先,从地表水在这个车站,我们环境DNA PCR扩增技术,只有三个differentpartial获得16 s rRNA序列(EMBL加入数字HE600704、HE600705 HE600706), 98.9 - 99.7%的相同的顺序聚球藻属Almo3 sp。然后我们孤立的显微镜下应变(名为Syn-EPEA.1),其完成16 s rRNA分子特征序列放大(EMBL加入HE600707数量),和98.9%左右相同序列的属的成员聚球藻属。

另一方面,从大陆架水域相应GEF-III巡航(在一个位置相当于车站27日61°48′W 47°22′年代),我们孤立picophytoprokaryote应变(名叫Syn-GEF.1)的完成16 s rRNA序列(加入EMBL HE601900) 99.8%相同的海洋聚球藻属序列。

为了更好的区分基因型,我们放大和测序ntcA从Syn-EPEA基因片段。1和Syn-GEF。1isolates (EMBL accession numbers HE601901 and HE601902, resp.). Syn-EPEA.1 and Syn-GEF.1 sequences were about 91.6, 90.6, and 70.2% identical to partialntcA序列聚球藻属sp。8020 WH CC9311 RS9905,分别为和97.9%相同。

3.2。分子识别聚球藻属阿根廷的菌株从架子上及其附近海域

DGGE技术用于分析聚球藻属架子上的多样性及其附近海域在阿根廷巴塔哥尼亚地区的海洋。放大产品的16 s rRNA从隔离Syn-EPEA基因。1和Syn-GEF。1(used as references) and amplicons from the environmental samples corresponding to stations 66 and 27 (shelf waters) and 62 and 20 (adjacent waters) were subjected to DGGE (Table S1 and Figure1)。尽管一些乐队出现分散在凝胶梯度,明显的、有代表性的乐队(图2)可以选择DNA reamplification并进一步测序。所有的环境序列约有93 100%的相同序列的海洋聚球藻属(表2)。尽管乐队样本对应一个书架和附近海域迁移在凝胶(表相似的立场2和图2),它们的序列显示高度的身份不同的序列聚球藻属压力:27.2和62.2乐队分别为100%和99.3相同的9902 CC和CC 9311,分别。

3.3。系统发育分析

部分16 s rRNA序列与序列代表聚球藻属属于演化支我第九(8和演化支十五和十六9]。Neighbour-joining phylograms后被构造序列比对(图3)。也观察到类似的树拓扑最大的吝啬分析(没有显示)。的16 s rRNA从EPEA环境样品和两个序列聚球藻属隔离在进化枝。分析分组ntcA序列,我们也包括在内聚球藻属序列的演化支XI十四,被确定ntcA的发展史(11]。系统发育分析使用ntcA隔离的序列显示了类似的结果同16 s rRNA序列(图4),这表明一个好同余与所使用的两个遗传标记。另一方面,而大部分的16 s rRNA序列从DGGE乐队获得了重要的比对聚球藻属序列属于进化枝我,三个序列从大陆架水域(66年,27)分组与进化枝四世,另一个从站62年集群subcluster 5.3(表的序列2和图3)。

我根据我们的结果,进化枝聚球藻属似乎是最常见的集团在西南大西洋在北纬38°48°年代。第四,序列的进化枝被发现在43°47°年代在巴塔哥尼亚货架(电台66和27)但不是在海洋水域。共存的演化支我和IV已经证据确凿的在其他中滋育的温带地区(纬度高于30°N / S),和两个演化支的丰度的比率可能是不同时空上都表明演化支都是适应类/低温水域[4,5,19,34,35]。有趣的是,比较基因组研究表明,菌株的演化支缺乏监管基因是重要的磷限制条件下清除此营养时(16]。然而,有一个明显的缺乏了解的遗传和生理特性允许演化支我和IV与其他竞争聚球藻属在中滋育的地区演化支。引人注目的是,我们的数据显示一个非常高水平的生物质(287.7μg L C⁻¹27(表)站1),它可以单独归因于picocyanobacteria(席尔瓦个人沟通)。最近的一份报告,研究六个聚球藻属菌株分离沿着纬度梯度在北大西洋,揭示血统的海洋的存在聚球藻属生理专业在不同的热环境,表明温度指标在海洋的存在聚球藻属辐射(36]。此外,作者认为进化枝我和第四可能进化枝聚球藻属有一个生理优先适应寒冷的热环境。我们的结果与这些发现的水温范围以来网站之间的抽样(表10.6和14.7°C1)。

最后,一个序列属于subcluster 5.3(原进化枝中包含X [8在62年海洋站)检测。聚球藻属subcluster 5.3最近恢复(15,16),包括聚球藻属RCC307 [9],KORDI-15, KORDI-30 [17]。不太了解的生物地理学聚球藻属菌株相比subcluster 5.1 [18]。我们的结果表明,成员在海洋水域subcluster 5.3也存在。

4所示。结论

这项研究是第一个报道的分子特征聚球藻属西南大西洋,导致全球分销的知识。聚球藻属发现不仅在沿海水域,如EPEA报道,一个永久的沿海站位于马德普拉塔[37),但也在书架上和海洋水域。

而聚球藻属进化枝第四序列只能从巴塔哥尼亚检索大陆架水域(电台66 - 27),聚球藻属进化枝我似乎普遍在阿根廷,在北纬38°48°年代。此外,菌株的演化支我和IV,认为低温指标(36),可以在巴塔哥尼亚共存货架(站27)。两种群间的共存与车站27的生物量增量;然而,还需要进一步的研究来支持这种猜测。数据呈现一个起点评估的作用聚球藻属适合作为强大的监控指标,可能的气候变化的影响在南大西洋。然而,大规模和长期的努力需要理解季节性和人口动态不仅picocyanobacteria还其他ultraphytoplankton组件。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这个项目是由国家支持(项目号134),INIDEP PNUD ARG 02/018项目,所de马德普拉塔(穰644/645),和Fundacion对位Investigaciones Biologicas Aplicadas (FIBA)。

补充材料

引用

1. p . Flombaum j·l·盖乐葛斯r·a·戈迪略et al .,“现在和未来全球分布的海洋蓝藻Prochlorococcus和聚球藻属”,美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷110,不。24日,第9829 - 9824页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j·b·沃特伯里,s w·沃森,f·w·瓦卢瓦王朝,和d·g·弗兰克斯,“生物和生态特征的海洋单细胞蓝藻聚球藻属”,加拿大渔业和水产科学通报》卷,214年,第120 - 71页,1986年。视图:谷歌学术搜索
3. f . Partensky j . Blanchot和d . Vaulot微分分布与生态Prochlorococus和聚球藻属在海洋水域:审查。”公报de l 'Institut Oceanographique,19卷,第475 - 457页,1999年。视图:谷歌学术搜索
4. k . Zwirglmaier l . Jardillier m·奥斯托夫斯基et al .,“全球phylogeography海洋聚球藻属和Prochlorococcus揭示了一个不同的分区血统在海洋生物群落中,“环境微生物学,10卷,不。1,第161 - 147页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. 诉Tai和b . Palenik时态的变化聚球藻属演化支在太平洋海岸监测网站。”ISME日报,3卷,不。8,903 - 915年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. f . Partensky w·r·赫斯,d . Vaulot。”Prochlorococcus全球海洋光合原核生物的意义。”微生物学和分子生物学的评论,卷63,不。1,第127 - 106页,1999。视图:谷歌学术搜索
7. g . Rocap d l . Distel j·b·沃特伯里和s . w . Chisholm”解决Prochlorococcus和聚球藻属通过使用16间s-23s核糖体DNA内部转录间隔区序列,”应用与环境微生物学,卷68,不。3、1180 - 1191年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. n . j .富勒d·玛丽·f . Partensky d . Vaulot a . f . Post和d·j·斯坎兰”Clade-specific 16 s核糖体DNA寡核苷酸的优势一个海洋聚球藻属进化枝中分层水列在红海,”应用与环境微生物学,卷69,不。5,2430 - 2443年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. n . a . Ahlgren和g . Rocap”文化隔离和文化无关克隆库揭示新的海洋聚球藻属独特的光和N生态型生理的。”应用与环境微生物学,卷72,不。11日,第7204 - 7193页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. g·托莱多,b . Palenik。”聚球藻属多样性在加利福尼亚海流所看到的RNA聚合酶(rpoC1)分离株的基因序列,应用与环境微生物学,卷63,不。11日,第4303 - 4298页,1997年。视图:谷歌学术搜索
11. s . Penno d Lindell, a . f .帖子,“聚球藻属和多样性Prochlorococcus人口N-regulatory DNA序列的基因决定的ntcA”,环境微生物学,8卷,不。7,1200 - 1211年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. r·w·Paerl r·a·福斯特b·d·詹金斯j·p·蒙托亚和j·p·泽尔,奔迈公司”系统发育多样性蓝藻narB基因从各种海洋栖息地。”环境微生物学,10卷,不。12日,第3387 - 3377页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. a . f . Post、美国Penno k . Zandbank a . Paytan s·m·休斯和d·m·韦尔奇”长期的季节动态聚球藻属人口结构在亚喀巴湾,红海北部。”微生物学前沿,2卷,第131条,第131条文章ID, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. s . Mazard m·奥斯托夫斯基f . Partensky d·j·斯坎兰,“多位点序列分析,分类分辨率和生物地理学的海洋聚球藻属”,环境微生物学,14卷,不。2、372 - 386年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. 杜福瑞斯a . m .奥斯托夫斯基d·j·斯坎兰et al .,“解开基因组马赛克是一种无处不在的海洋蓝,”基因组生物学,9卷,不。5篇文章R90 2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. d·j·斯坎兰·m·奥斯托夫斯基s Mazard et al .,“海洋picocyanobacteria生态基因组学”微生物学和分子生物学的评论,卷73,不。2、249 - 299年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. d·h·崔和j . h .能剧”的系统发育多样性聚球藻属菌株分离出东海,东海,“《微生物生态学,卷69,不。3、439 - 448年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 黄,s . w .威廉·h·r·哈维·k·泰勒,n .焦和f·陈”,小说的血统Prochlorococcus和聚球藻属在全球海洋。”ISME日报》第六卷,没有。2、285 - 297年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. k . Zwirglmaier j·l·海伍德k .张伯伦e . m . s .伍德沃德m . v .祖布科夫和d·j·斯坎兰,“在大西洋盆地规模分布picocyanobacterial血统的模式,”环境微生物学,9卷,不。5,1278 - 1290年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 米罗斯拉维奇p, e·克莱因j·m·迪亚兹et al .,“海洋生物多样性在南美洲的大西洋和太平洋海岸:知识和差距,“《公共科学图书馆•综合》》第六卷,没有。1,文章ID e14631, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. e . t . Buitenhuis w·k·w·李·d·Vaulot et al .,“Picophytoplankton生物量分布在全球海洋,”地球系统科学数据5卷,第242 - 221页,2012年。视图:谷歌学术搜索
22. 诉a·鲁茨诉Segura ai Dogliotti, d . a . Gagliardini a·a·比安奇和c f . Balestrini”在阿根廷海洋初级生产弹簧估计领域和卫星模型,”浮游生物研究期刊》的研究,32卷,不。2、181 - 195年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. 美国罗梅罗,a . r . Piola m .限制,和c·a·加西亚eira”并且从巴塔哥尼亚基于SeaWiFS数据变化,“地球物理研究杂志》上的C:海洋,卷111,不。5,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 马查多,m·巴雷罗,d . Calliari”变化的并且在西南大西洋从卫星图片:季节性周期和ENSO影响,”大陆架的研究,53卷,不。1,第109 - 102页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. 公元前亭”,估计使用显微镜细胞浓度和自养浮游生物的生物量,”手册水生微生物生态学的方法p·f·坎普,b·f·谢尔·e·b·谢尔,Eds和j·j·科尔。刘易斯出版商,页199 - 205年,波卡拉顿,佛罗里达州,美国,1993年。视图:谷歌学术搜索
26. r . r . Guillard和j . h . Ryther”海洋浮游硅藻的研究。我。Cyclotella娜娜Hustedt,Detonula confervacea(克里夫)格兰。”加拿大《微生物学,8卷,第239 - 229页,1962年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. y Cai和c·p·Wolk使用有条件地致命的基因淡水藻类的一种sp.应变PCC 7120选择双重组和欺骗插入序列,”细菌学期刊,卷172,不。6,3138 - 3145年,1990页。视图:谷歌学术搜索
28. n . j .富勒n . j .西方,d .玛丽et al。”群落结构动力学和磷酸盐的地位picocyanobacterial种群在亚喀巴湾,红海,”湖沼学和海洋学,50卷,不。1,第375 - 363页,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. d . Lindell e·巴丹和a . f .文章”的监管ntcA海洋中的表达和亚硝酸盐吸收聚球藻属sp.应变WH 7803。”细菌学期刊,卷180,不。7,1878 - 1886年,1998页。视图:谷歌学术搜索
30. g . Muyzer t . Brinkhoff Nubel, c . Santegoeds h·谢弗和c·帕,“变性梯度凝胶电泳(DGGE)在微生物生态学”分子微生物生态学手册公元l . Akkermans j·d·范·Elsas和f . j . de Bruijn Eds。1和2卷,第769 - 743页,2004年。视图:谷歌学术搜索
31. m . Schauer诉Balague、c . Pedros-Alio和r . Massana“季节性变化的分类组成bacterioplankton在沿海贫营养系统中,“水生微生物生态学没有,卷。31日。2、163 - 174年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. k (d·彼得森:彼得森,g . Stecher m . Nei和s . Kumar“MEGA5:分子进化遗传学分析使用最大似然,进化距离,和最大的精简方法,”分子生物学与进化,28卷,不。10日,2731 - 2739年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. r·席尔瓦r . Negri鲁兹诉,“夏天一系列ultraphytoplankton EPEA沿海车站(阿根廷北部),“浮游生物研究期刊》的研究没有,卷。31日。4、447 - 458年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. d . Mella-Flores s Mazard f . Humily et al .,”的分布Prochlorococcus和聚球藻属间在地中海受到全球变暖的影响?”Biogeosciences,8卷,不。9日,第2804 - 2785页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. 诉Tai, r·s·伯顿和b . Palenik”,时间和空间分布的海洋聚球藻属在南加州湾评估杂交bead-arrays,”《海洋生态发展系列卷,426年,第147 - 133页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. j . Pittera f . Humily m . Thorel d . Grulois l . Garczarek c . 6,“连接热生理学和纬度的利基分区在海洋聚球藻属”,ISME日报,8卷,不。6,1221 - 1236年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. l . f .阿提加斯e . Otero r . Paranhos et al .,“向拉美和加勒比地区的国际海洋微生物普查(LACar ICoMM):概述目前的一些研究方向,”航空杂志上Biologia热带卷,56号1,第214 - 183页,2008。视图:谷歌学术搜索

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