评价Yarrowia lipolytica油生产生物柴油：土地使用石油产量，碳和能量平衡

摘要

酵母油已成为生产生物柴油的合适替代原料，因为它们的成分与植物油等常见原料相似。此外，它们的优势是不与人类或动物的饲料竞争，而且，它们不与耕地竞争。在这项工作中，对碳和能量平衡进行了评估Yarrowia lipolytica作为模型酵母，使用生物柴油中的粗甘油作为唯一的碳源，这提高了生物柴油的整体产量6%。这一过程呈现出正能量平衡。通过油脂脂肪酸谱和十六烷值的测定，评价了酵母油作为生物柴油底物的可行性。此外，在土地利用方面，蔬菜、微藻类和酵母油之间的油产量的比较也被提出。结果表明y lipolytica产油量远高于植物油(767倍)和微藻(36倍)。

1.介绍

生物柴油已成为化石柴油最可持续和可再生的替代品。它的定义是游离脂肪酸烷基酯的混合物，通常来自植物油和动物脂肪[1]。使用这些油作为原料约占生产成本的88% [2而且还引发了关于在世界上仍然存在饥饿的情况下使用食用油生产生物燃料的争论。因此，许多研究都集中在利用低成本的非食用原料，如废油或非食用油[1]。在这方面，微生物油已成为替代原料。微生物油被定义为由含油微生物，所产生的油，即，微生物能够作为脂质在细胞内的液滴[的形式积累它们的干细胞重量（DCW）的20％以上3]。这种积累主要是由于碳(C)来源过多，而另一种营养物质(如氮(N))数量有限[4，五]。酵母菌的脂质主要是三酰基甘油，就其化学组成而言，可以与从植物油籽(植物油)中获得的脂质进行比较。此外，酵母可以利用各种营养来源，包括工业废物，这可以降低生产成本。生物柴油的主要副产物是粗甘油，在成本很高的提纯过程之前，其应用范围有限。由于生物柴油产量的增加，粗甘油的可用性增加，这引起了研究人员的注意。有几项研究侧重于通过在生物工艺过程中将其作为微生物培养物的底物来增加该副产物的价值[6-10]。

其中研究最多的含油酵母，我们可以发现Yarrowia lipolytica，一种已知基因组的二态酵母[11]。在这项工作最近分离y lipolytica菌株在粗甘油培养作为模型来评估其生物质能潜力和碳平衡。此外，脂肪酸谱和十六烷值进行评价。最后，蔬菜，微藻和酵母油之间的土地利用石油产量的比较提出。据我们所知，这是这种包括酵母油的第一份报告。

2.材料和方法

2.1。酵母菌株

用于研究的酵母菌株为aYarrowia lipolytica，之前在我们实验室分离得到，根据其脂质含量和多功能性选择其在不同底物中生长。根据Segura等人的研究，采用PCR-RFLP分析进行酵母鉴定[12]。这种野生型酵母根据《布达佩斯条约》存放在农业研究服务处的培养标本(NRRL)中，编号为NRRL Y-50997。

2.2。酵母油的生产

酵母油在含有100毫升氮限制介质的500个毫升锥形瓶中制备。氮限制培养基根据Suutari等制备。[13，用粗甘油代替葡萄糖。接种10ml的YPD (20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母提取物)过夜预培养。液体培养在250 rpm和30℃的轨道振动器上重复进行72小时。在生产过程中采集样品并冷冻直到进一步分析。粗甘油是从当地一家生物柴油生产商获得的。除非另有说明，商业级化学品是从Sigma-Aldrich(墨西哥)购买的。

2.3。分析方法

在酵母产油细胞生长过程中，对所有样本进行脂质含量、氮和甘油消耗分析。干燥至恒重后，通过DCW测定细胞生长或生物量。用Schneiter等人的方法从细胞中提取脂质来测定脂质含量[14]。用DCW和脂质含量计算脂质百分比。氮消耗被报道为上清液中无机和有机氮的总和，通过Chaney等人提出的比色技术来测量。15和Sun等人[16]， 分别。

生物质的元素组成从最终酵母培养物中获得洗涤和干燥样品中的测量，并且使用EA 1108个Fisons的仪器型号EA1108 CHNS测定。最终培养物的脂肪酸谱在配备有火焰离子化检测器使用Alltech公司AT-WAX30毫米×0.25毫米×0.25仪（PerkinElmer®模型于AutoSystem，USA）的气相色谱仪进行分析μm毛细管柱(美国J和W科学公司)，氮气作为载气。脂肪酸甲酯的保存时间与商业标准进行了比较，并以十七酸甲酯作为内标得到了脂质谱。所有的测量都是一式两份的。

2.4。质量和能量平衡方程

批量或烧瓶微生物培养的质量平衡可用以下公式描述[17]: 其中X是生物质浓度（g / L），t是时间（h），和μ是比生长速率（H^-1)。在指数增长阶段，μ被认为是常数。积分(1)，初始条件为X = X₀t = t时₀，它变成[17] 使用（2),μ很容易计算。

为了执行所产生的微生物油的能量平衡，一个过程相似，提出了通过安绍等。[18]被使用并被描述如下。

微生物生长的元素平衡方程可表示为[17] 在条款 ， ， ，和对应于衬底的元素组成，氮源，细胞生物质，和细胞外产物，分别。由于微生物油主要是细胞内的（占在细胞生物质的术语），乘积项可被忽略。碳平衡可以表示为 在哪里C是碳生物量产量和d与呼吸比有关。还原程度分别表示基质中单位碳的电子数和生物量中单位碳的电子数相对于每个分子中碳的价态。碳原子为4，氢原子为1，氧原子为-2，氮原子为-3 [17]。从这个意义上说，方程(3)为 在哪里 下标分别表示基质(S)和生物量(B)。还原程度高表示氧化程度低，这与底物碳变成生物质时获得的相对电子(还原)有关。

另一方面，用干生物量和甘油元素组成来计算η，表示生物质形成能产率，对应于生物质燃烧热与对应底物代谢量的燃烧热之比[19]。根据埃里克森等人。[20]可与生物量与基质产量( ）如下: 在哪里和分别为生物量和基质中的碳质量分数。

为了完成生物质能潜力，根据Meier等[21]，燃烧热（ ）可由生物质元素组成用下式计算，标准误差为5%。 在这 ， ， ，和是生物量中每种元素的重量分数。

2.5。十六烷值计算

十六烷值(CN)是利用多元回归方程经验计算的[22]。 其中CN表示最终混合物的十六烷值，是个人FAME的质量分数，和是纯FAME的CN。 其中X是各脂肪酸的碳数。

3。结果与讨论

3.1。文化动力学和碳平衡

酵母y lipolytica在限氮培养基中培养72 h。数字1礼物的生物量和脂质产生的动力学，以及甘油和氮的消耗。可以观察到，氮气以36个小时完全消耗，而只有63％的初始甘油中的溶液在末端被消耗。这表明，酵母可能能够继续消耗甘油，但是由于生物质在48小时达到静止生长期时，将培养物在72小时被停止。在酵母脂质生产同时氮被完全消耗，这是按照与以前的报告〔几乎增加4，并持续增加，直到48小时，此时脂质产量达到稳定阶段。每12小时监测一次pH值的变化(数据未显示)，72小时后pH值仅从5.5下降到51显示最大生物量，油脂比例，脂质含量和油脂产量达到。得到的脂质百分比高于使用甘油作为碳源的类似条件下的其他报告更高[6-10]。

以甘油消耗量计算，最大理论脂质对底物产量( ）值为0.3 g脂质/g甘油;这是基于碳平衡的，因为32mol的甘油可以产生1mol的甘油三酯[23]。表中获得的值1相当于理论值的63%，这意味着所用的63%的甘油直接转化为脂质。考虑到工艺仍可优化，这是一个很有希望的结果。此外，由于残留的以甘油形式存在的碳原子可以返回到相同的过程中，因此生物柴油的总收率可以提高6%。

值得一提的是，这种野生型毒株y lipolytica是其中最好在脂质含量和脂质百分比[条款在粗甘油培养时24，25但在脂质产量方面表现突出。此外，可以优化培养条件和培养基组成，以提高最终产量。

3.2。能量平衡

生物质的元素组成，在培养结束时，为50.2％的碳，7.63％的氢，34.16％的氧，和5.96％的氮，其对应于CH的元素式_1.82Ø_0.51ñ_0.1。对于其他种类的产油酵母菌，据报道其元素组成相对恒定(≈75.6%的碳、11.6%的氢和12.7%的氧)[26]但是这只能在类似的培养条件的特定碳源（乙醇）施加。

使用这种分析方法，数据如表所示1和（1) (9)，得到以下参数(表2)。

生物质形成能产率(η）表示由甘油提供的能量的44％转化为生物量和微生物脂质。得到的燃烧热（ ）对应于化石柴油的能量含量的约47％（45.4千焦/克[18)，显示了这种产油酵母用于生物柴油生产的潜力。这与先前的报告一致[26]其中，对于具有64％的脂质含量的酵母，干生物质的能量值达到生物柴油的73％。

此外，我们计算，我们的方法的能量成本是接近5千焦/克，并考虑到我们获得21.5千焦/克，过程总能量平衡为正，并且获得对应于4.5倍的能量。此值是类似于使用棕榈油（植物油具有最高的产率）在生物柴油生产过程中获得的能量，其对应于4.7倍[27]能源使用，但也值得一提，所使用的土地是较高的。即使是艰难的粗甘油可以用于生产其他生物燃料，张某等人。[28[结果发现，使用粗甘油生产生物柴油是唯一具有能量增益的过程，能量平衡为正，转化效率大于1，这与我们的结果一致。

3.3。脂肪酸谱

脂质脂肪酸谱允许确定可能的应用。具体地，对于生物柴油，脂肪酸轮廓具有在最终产物性能如十六烷值，粘度，密度，和熔融温度具有直接影响。在一般情况下，较高的饱和脂肪酸含量对应于较高的粘度，密度和熔化温度。因此，理想的是用于生产生物柴油的原料是富含单不饱和脂肪酸如油酸。y lipolytica油的脂肪酸概况见表3。由于获得的油富含油酸，这构成了良好的生物柴油原料。

从表中获得的脂肪酸概况3，十六烷值的计算根据（10) (12)。此计算出的值y lipolytica油为61.5，符合ASTM D976 (CN≥48)。这一结果证实了所得油是生产生物柴油的合适替代原料。

3.4。从土地使用的角度比较石油产量

生产生物柴油的主要原料是富含甘油三酯的油脂。这些通常来自可食用作物，这些作物代表了在世界上仍然存在饥饿的情况下，如何使用粮食、水和可耕地来制造生物燃料的伦理辩论。最近从不需要大量水和肥沃土地的作物中提取的非食用油，如麻疯树[29]，已被提出作为替代原料。然而，如示于图2从土地使用的角度考虑，棕榈油是最好的作物。然而，在婆罗洲等地的种植导致了森林砍伐问题，许多国家采取了不生产棕榈油的政策，直到它以可持续的方式生产。

在这个意义上说，微生物油已经引起关注，因为生物柴油的替代原料。在微生物油的许多研究已经在微藻被执行，并且已经报告说，他们目前比棕榈油高土地使用收益率[30.，尽管必须考虑到它们中的大多数需要连续的光源来促进光合作用，这使得这个过程在夜间的能量效率更低。此外，微藻中的脂质浓度是按每升毫克的顺序排列的，而在产油酵母菌中，如they lipolytica在这项工作中所使用的，它是在克每升的顺序和它们可以在搅拌罐生物反应器，而不光进行培养。关于所有上述和使用在这项工作中所获得的数据，每天每单位面积上的油的产率分别计算手掌[31], microalga [30.和酵母油。结果如图所示3。可以看出，虽然微藻产量比棕榈油高20多倍，但酵母中的油脂产量比微藻高36倍，比棕榈油高767倍。在这种情况下，酵母油作为生产生物柴油的替代原料具有很大的潜力。值得一提的是，石油产量在不断增加y lipolytica可以通过培养优化和遗传修饰[加以改进11，32]，所以产率甚至可以更高。

4。结论

当生产微生物油时，可获得正能量平衡y lipolytica粗甘油是唯一的碳源此外，生产出的脂质适合作为生物柴油生产的替代原料，在同一工艺中返回粗甘油时，整体工艺收率提高了6%。此外，在土地利用方面，获得的油料产量远高于植物油和微藻。综上所述，酵母油作为生物柴油的替代原料具有很大的潜力。关于工艺优化、经济和环境影响的进一步研究目前正在进行中。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在本文中。

的利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

这项工作由墨西哥国家科学技术委员会(CONACYT)通过项目CB-237737和FSE-250014 (CONACYT- sener)资助。在CTAFSE-3-X-17-07协议中，墨西哥能源、能源可持续性秘书处的部门基金Conacyt为Xochitl Niehus提供博士后奖学金。

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