一个快速和简单的定性方法对琼脂筛选油质的酵母

文摘

寻找新的油质的酵母极大的兴趣是由于他们的许多重要的应用。目前筛选过程是费时的,这些需要液体的文化。在这个工作中,一个新的、快速、经济、简单的定性方法筛查油质的酵母。荧光染料罗丹明B,被选中,因为它的荧光脂质含量直接相关,和不需要额外的步骤或专用设备。这种方法只需要增加染色琼脂板上的酵母。在可见光下,很容易观察到nonpigmented油质的酵母变成彩色,而非油质的酵母保持本色的。发达的方法也很有用改善介质组合在特定的应用程序。此外,它也适应使用替代碳源,如木质纤维原料和甘油。开发方法应用于屏幕124最近孤立nonpigmented酵母在三种不同的碳源,即葡萄糖、甘油和龙舌兰蔗渣水解。五株被选为良好的脂质生产商在所有测试碳源和脂质积累超过48%。 Furthermore, the assay was adapted to screen reddish-pigmented yeasts. Considering all the above, the developed method has a wide range of applications in the field of microbial oils.

1。介绍

微生物油脂或单细胞油脂被定义为产生的油油质的微生物。这些微生物能够积累超过20%的干电池体重(起重集团)作为细胞内脂质液滴的形式。这种积累主要是由于过量的碳(C)和有限的可用性另一个营养的来源,如氮(N) (1,2]。从酵母油脂主要是甘油三酯,可以比较,在化学成分、脂质获得植物油籽(植物油)。此外,酵母可以利用广泛的营养来源,包括工业废物,降低生产成本。代谢工程正在进行以获得较高的细胞脂质含量,从而获得更高的最终脂质产量(2,3]。在这些程序,以及隔离和寻找新的油质的酵母,殖民地的选择最高的脂质生产是可取的。油从酵母有许多应用在食品、制药和生物燃料产业。其中,作为生产生物燃料的替代原料,如生物柴油,脱颖而出2,4]。事实上,常见的生物柴油原料是植物油,它代表了大约88%的生产成本(5)并生成争论关于食用油和耕地的使用生物燃料生产。油从酵母也存在有更好的单位面积产量的优势与植物油相比,明显缩短生产时间。

因此,寻找新的油质的酵母是极大的兴趣。尽管一些定性和定量检测方法已经开发出来,他们非常辛苦,需要液体文化、耗时、耗资源,或者需要使用有毒的化合物。

可用的定量方法对油质的酵母的筛选,木村等描述的方法。6)及其修改(7)是最常用的。这些方法需要液体文化和涉及脂质含量估计在酵母使用昂贵的荧光染料尼罗红荧光计,是有限的,因此,这些方法的快速荧光的猝灭。这种限制导致实验结果显著的变化,和许多实验室没有获得这种类型的设备。

其他定量筛选方法是基于比色或光谱光度测量的技术。这些方法比荧光的更便宜,因为他们只需要一个分光光度计,这是更便宜,更常见的在大多数实验室荧光计,但他们仍然有液体需要文化的缺点,样品处理时间长,和一些有毒或危险物质的使用。这种方法的例子包括那些被Thakur et al。8),包括使用苏丹黑B,胫骨et al。9),包括油红O的使用,和一种羚羊等。10),这是基于sulfo-phospho-vanillin反应和脂质。相反,定性方法筛选油质的微生物也被报道。最常用的方法之一被诺里斯et al。11),包括使用苏丹黑B染色胞内脂质黑色(12,13)和红色染料复染色细胞的其余部分红色。然而,诺里斯的技术需要液体文化和额外的步骤如涂片制备和显微镜可视化。

另一个最近报道技术油质的酵母的筛选需要使用Bodipy探针直接视图酵母在荧光显微镜下,观察细胞内的脂质滴(14]。这种技术也有一个缺点是需要脂质文化和不适当的弱lipid-producing酵母的检测。

另一个广泛使用的定性方法,检查油质的酵母是被埃文斯et al。15),要求使用琼脂文化的优势。然而,这种方法也需要多个附加步骤琼脂孵化后,如印刷复制的琼脂板在滤纸上,与苏丹黑B染色,用乙醇洗涤,干燥,因此耗时、耗资源。此外,还有在印刷复制品一步菌株污染的风险。殖民地与高脂质含量表现为黑蓝色/紫色斑点,而那些低脂质是彩色的天空蓝色或保持清白的。

染料罗丹明B已被用于染色油在培养皿的媒体,目的是确定微生物脂肪酶活性(16]。然而,在这项研究之前,该染料没有用于染色细胞内脂质在培养皿中培养微生物。

基于上述方法,油质的微生物的筛选大量的菌株是非常昂贵和耗时的多个步骤。因此,大量的野生型菌株的筛选或突变体需要一个更快、更经济的方法。这项工作的目标是开发一种快速筛选方法油质的酵母,识别脂质积累的水平直接从琼脂文化和发达的方法来验证通过脂质在殖民地的直接量化。此外,该方法的适用性与其他碳源也进行了研究。

2。材料和方法

2.1。酵母菌株

的酵母Yarrowia lipolytica写明ATCC 9773和酿酒酵母乙醇红(Fermentis 42138)以前在我们实验室分类油质的脂质(超过50%)和非油质的脂质(小于20%),分别,因此作为积极的和消极的控制,分别。

两个reddish-pigmented酵母,也从土壤中分离我们的实验室,用于测试该方法的另一个应用程序对这些类型的酵母。红酵母都确定为红酵母mucilaginosa由PCR-RFLP根据Segura et al。17),被称为r . mucilaginosa一个和r . mucilaginosaB。

此外,最近124年孤立的野生型nonpigmented(白色)酵母菌株从我们实验室集合。这些酵母分离主要来自土壤和食物浪费。大部分的酵母尚未确定,因此在该使用连续编号的标签。

2.2。媒体和文化条件

因为高carbon-to-nitrogen比(C / N)改善脂质积累,nitrogen-limited介质被用来开发方法。这种媒介是基于描述的协议Suutari et al。18),有以下成分:23 g / L葡萄糖,0.3 g / L蛋白胨,0.5 g / L酵母提取物,7 g / L KH₂阿宝₄,2 g / L Na₂HPO₄∙7小时₂啊,1.5 g / L MgSO₄,20 g / L琼脂(pH值5.5±0.2),对应80 C / N。

丰富的媒介(YPD)也准备以下成分:20 g / L葡萄糖,20 g / L蛋白胨,10 g / L酵母提取物,和20 g / L琼脂(pH值5.5±0.2),对应于一个C / N的2.1,它被称为一个缓慢/ N的媒介。

两种不同的媒体与替代碳源也被测试。第一个有相同的成分为上述nitrogen-limiting媒介除了纯甘油是用来代替葡萄糖。第二介质是准备像之前描述的那样使用龙舌兰蔗渣水解物(19),以下成分:甘蔗渣水解(80% v / v,这对应于20 g / L 10 g / L木糖和葡萄糖),磷酸缓冲(50毫米,pH值6.8,20% v / v), 1.7 g / L酵母氮基,1.5 g / L NH₄Cl, 20 g / L琼脂。

表示时,染料的解决方案添加了染料制备部分中描述的所有媒体。

酵母都维护在YPD琼脂板和储存在4°C长达3个月。从存储酵母培养液是准备通过孤立的殖民地,而镀YPD和孵化30°C 1天。媒体评价,孤立的酵母殖民地从新鲜培养液的单点测试了盘子。之后,盘子被孵化30°C 2天,定期检查。

2.3。染料制备

不同之前报道脂类染料进行了测试:油红O (9](Sigma-Aldrich O0625),苏丹黑B [8,15)(199664年Sigma-Aldrich),尼罗红(6](Sigma-Aldrich N3013)和罗丹明B (16,20.)(Sigma-Aldrich 83689)。各自所有的染料溶解在溶剂,根据先前的报道(见表1通过0.22 -)和过滤μ无菌注射器膜(Millex SLGS033SB)。微型滤波器染料解决方案添加到无菌琼脂媒体,和由此产生的媒体被添加到培养皿(类似于图中所示的过程1)。琼脂媒体被置于无菌培养皿中,琼脂凝固后,盘子是接种和孵化。

2.4。荧光检测

荧光检测,紫外灯(UVGL-15紧凑的紫外灯)365海里,和盘子被检查在一个黑暗的房间使用适当的个人防护设备。

2.5。脂质含量量化

验证该方法,定性结果比较三种酵母殖民地的脂质含量在每一个测试板。首先,每个殖民地都放在preweighted 2毫升埃普多夫®管,和1毫升蒸馏水被添加到每个管。生物质是分散和冻结在-20°C。一旦冻结,冻干,然后加权的管子是确定每个殖民地的干电池重量(起重集团)。冻干生物质被提取的脂质使用过程基于描述Folch et al。21]。短暂,氯仿:甲醇(2:1,v / v)混合添加,和样本用离心机。最后,脂质提取被底层的蒸发溶剂回收。获得的脂质重,计算每个样本的脂质含量百分比的起重集团。

3所示。结果与讨论

3.1。染料的选择

的发展方法的第一步是使用不同的染料和准备程序使用富国和nitrogen-limited媒体基于表中列出的参考方法1。染料的解决方案被微型滤波器避免培养基灭菌后燥热引起退化和添加但凝固之前。琼脂凝固后,盘子被接种和培养2天在30°C。

所有盘子可见光下观察。目标是选择染料,最容易检测脂质积累。预期的反应是建立清晰的油质的之间的菌落颜色差异和非油质的酵母的研究。研究了染料中,只有苏丹黑B和若丹明B显示差异油腻的和非油质的酵母。然而,罗丹明B显示最好的分化,因此被选为最佳染料的开发方法。此外,罗丹明B要求更容易和更便宜的优势比苏丹黑B(表准备1)。

所选染料罗丹明B (C₂₈H_31日N₂O₃Cl;mol. wt。479;(IUPAC N - (9) - ortho-carboxyphenyl 6 - (diethylamino) 3 h-xanthen-3-ylidene]二乙基氯化铵),是一个高度水溶性的,基本的氧杂蒽类的红色染料。这种染料用于染色脂质在不同的应用程序16,20.,22,23]。在准备浓度用于这项工作和在该条件下,这种染料污染物和有害物质。

使用罗丹明B 10 mg / L (16),y lipolytica殖民地出现在一场激烈的粉红色,而酿酒酵母殖民地的白色孵化两天后,如图2。因为酵母成长为白色菌落dye-free媒体,这个结果表明,罗丹明B能够穿透细胞膜和细胞内的脂质滴染色。

图的最后过程与所选染料呈现在图1。值得一提的是,屏蔽染料溶液的光并不是必要的,因为在黑暗与光明的条件下得到了相同的结果。

3.2。若丹明B的浓度选择

检查是否罗丹明B的浓度10 mg / L是最佳,罗丹明B的浓度不同,也就是说,5、10和20 mg / L(表1),使用油质的酵母和非油质的模型。

如图2,颜色区分这两种类型的酵母可以观察到罗丹明B的浓度。酵母y lipolytica出现在一个强烈的粉红色,这类似于介质的颜色。然而,10 mg / L罗丹明B导致更加明显的区分油腻的和非油质的酵母。这种区分对应于脂质57±2%的百分比y lipolytica和20±3%酿酒酵母,分别。若丹明B浓度的20 mg / L,颜色区别也是明显的,但有些颜色也由于酵母酿酒酵母。鉴于上述研究结果,10 mg / L被选为最佳浓度。

3.3。Carbon-to-Nitrogen比(C / N)的选择

正如前面提到的,高音c / N值可以在微生物诱导脂质积累。评估是否先前的实验中使用的C / N的80是最佳的开发方法,三种不同的高音C / N媒体和低廉/ N(或富裕)介质与油质的酵母进行了测试y lipolytica。C / N值分析与140年,80年,40岁和2.1。这些值是基于材料和方法描述的媒体除了葡萄糖浓度是改变了媒体的C / N值140和40。

正如预期的那样,殖民地在富裕的粉红色(低廉/ N)中等强度弱,而所有的殖民地高音C / N媒体变成了一场激烈的粉红色,因为更多的脂质生产提高C / N(图3)。事实上,脂质量化后得到了类似的结果。事实上,在C / N值测试,脂质积累的最佳比例为80,与脂质含量的58±2%。因此,我们的方法也可以用来选择最好的C / N的增加脂质生产。

3.4。该方法的反应水平

如上所述,使用定性的方法获得的响应是酵母殖民地的粉红色,白色或黄色的媒体没有染料。验证一个更高的粉红色强度对应于一个更高的脂质含量,该参数测量和相关的颜色强度不同的酵母。

脂质积累水平筛查的目的是定义为发展殖民地的粉红色的强度。不同的符号在图4表示不同程度的脂质积累和颜色强度:符号“-”表示非油质的酵母(缩写),这些菌株没有呈现出粉红色或白色或淡黄色的中心,符号“+”表示稍微彩色殖民地或脂质差生产者(缩写PLP),符号“+ +”表示moderate-stained殖民地或温和的脂质生产商(缩写MLP)和符号“+ + +”指定一个强烈的粉红染色的殖民地,这几乎是相同的颜色作为媒介,或者一个好的脂质(缩写为GLP)生产商。这些水平是与酵母的脂质含量有关。

值得一提的是,埃文斯的文化时间用于描述的方法(15琼脂)接种3到4天,大约4 h进行样品处理(包括滤纸的印刷复制品)和一个额外的变量的时间取决于干燥箱,导致整体文化大约5到6天时间从接种到结果。使用我们的罗丹明B-based方法,2天的文化琼脂是充分的,不需要进一步的处理步骤。

3.5。替代碳源

因为替代碳源的探索是极大的兴趣降低成本,开发方法也使用两种不同的基质进行验证。第一个测试的替代来源是甘油,中描述的测试中设计材料和方法用甘油代替葡萄糖。第二介质测试涉及的使用木质纤维素的水解物中提到的材料和方法。在这两种媒体,罗丹明B的浓度增加了10 mg / L。

得到了相同的脂质内容使用替代碳源。发达的媒体被用于油质的菌株的筛选124最近孤立的野生型nonpigmented酵母菌株在我们实验室集合。筛选菌株的脂质生产能力超过48小时的潜伏期。使用上面描述的定性反应水平(图4),孵化后的菌株被分类如图5。获得的结果与传统的碳源,如葡萄糖,表明glp 31株。相比之下,使用甘油,确认为glp 27株,而在媒体与木质纤维素的水解物,只有14个酵母显示良好的脂质积累。

几株被确认为GLP在中木质纤维素的水解物,因为类似于所有木质纤维素的残留物,这中含有木糖和抑制化合物(19]。并不是所有的压力都能吸收这种类型的糖在这些化合物的存在19,24,25),这限制了菌株能够使用木质纤维原料的数量。这种变化的方法也可以应用于其他木质纤维素的残留减少时间和资源选择时通常使用油质的酵母(25,26]。这种方法还允许选择油质的酵母同时通过评估两个重要方面:生长在木质纤维素的残留物和脂质生产能力。

如图55酵母在所有三个媒体列为GLP(菌株64、71、99、104和119年),反映出他们使用三种不同的碳源的能力测试。选定的殖民地与参考油质的酵母(y lipolytica),他们的脂质含量高于48%。具体来说,脂质含量在64株,71年,99年,104年和119年48岁,49岁,52岁,55岁,分别和53%。尽管压力还没有完全确定,但一些油腻的酵母属发现除了Yarrowia是假丝酵母和Debaryomyces。

值得一提的是,得到了同样的反应与罗丹明B琼脂板时被储存在4°C两个多月前处理,表明该方法及其选择显示稳定性好。

3.6。适应Reddish-Pigmented酵母的筛选方法

类似于埃文斯的技术(15),新方法只用于nonpigmented酵母。事实上,reddish-pigmented酵母的颜色干扰的响应可见光下使用这种方法获得的。

因此,本试验进行了测试与reddish-pigmented酵母,等红酵母mucilaginosa,使用一种不同的方法。因为若丹明B也在紫外光照射下荧光团(16与罗丹明B],殖民地的荧光染色也观察到。如图3,富人介质(低廉/ N或YPD)板看起来更红与高音c / N比盘子媒体,和这种差异可能是由于蛋白胨和酵母提取物内容的媒介。深色背景允许一个更好的对比不同殖民地富裕介质板的紫外线照射下。促进脂质积累在这个缓慢/ N中,酵母是孵化长达四天的排气可用营养和允许脂质积累。

正如所料,基于橙色荧光强度(图6),很容易区分非油质的酵母(酿酒酵母从油腻的菌株),包括reddish-pigmentedr . mucilaginosaA和b。此外,该方法允许的评估r . mucilaginosaa或b产生更多的脂肪。显示的筛查方法r . mucilaginosaB更油腻的,这个结果验证了其脂质比例(见脂肪百分比图6)。y lipolytica脂质含量最高,显示出更高的橙色荧光。

3.7。摘要协议为白色或Nonpigmented测定酵母

(1)准备琼脂培养基用以下模型组成:23 g / L葡萄糖,0.3 g / L蛋白胨,0.5 g / L酵母提取物,7 g / L KH₂阿宝₄,2 g / L Na₂HPO₄∙7小时₂啊,1.5 g / L MgSO₄,20 g / L琼脂(pH值5.5±0.2)。其他碳源可以通过把他们的等量的葡萄糖浓度。(2)消毒的媒介(3)添加一个微型滤波器罗丹明B溶液的浓度1 g / L在丙酮的剂量10毫升/ L获得最终浓度10 mg / L的媒介。(4)中倒入培养皿中,让它凝固。(5)接种的盘子用新鲜酵母殖民地。(6)孵化的板在30°C 2天。(7)根据图评估酵母菌菌落颜色4。

3.8。协议分析的总结红色或Reddish-Pigmented酵母

(1)准备琼脂培养基用以下模型组成:20 g / L葡萄糖,20 g / L蛋白胨,10 g / L酵母提取物,和20 g / L琼脂(pH值5.5±0.2)。这篇作文被选中来获得一个黑暗的背景板。(2)消毒的媒介。(3)添加一个微型滤波器罗丹明B溶液的浓度1 g / L在丙酮的剂量10毫升/ L获得最终浓度10 mg / L的媒介。(4)中倒入培养皿中,让它凝固。(5)接种的盘子用新鲜酵母殖民地。(6)培养4天的板在30°C。(7)根据图评估酵母菌菌落颜色6。

4所示。结论

发达的定性方法,检查油质的酵母是一个合适的选择筛选大量的菌株,可以用于分析reddish-pigmented酵母。此外,它还可以使用当几个感兴趣的碳源或营养。这些程序不太耗时、耗资源,因为他们不依赖于测量,液体文化,或复杂的设备。获得的反应是直接从殖民地种植在琼脂,及其脂质生产能力可分为简单地通过可视化可见光或紫外光下的盘子。我们最好的知识,提出了筛选替代油质的菌株在reddish-pigmented酵母构成定性过程的第一份报告这些类型的微生物。此外,开发方法及其替代品可以应用于媒体的进步,自动化系统的大规模筛选,和食品技术,表明其高通用性。此外,分析的扩展油质的真菌和细菌也被探索。

数据可用性

所有生成的数据或分析在本研究中包括这篇文章。

信息披露

这项工作提出了抽象在13欧元联邦国会脂质:新的挑战在技术、质量控制和健康。欧元美联储是一个活泼的网络脂质,脂肪和油。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由墨西哥国家科学技术委员会(CONACYT)通过项目cb - 237737, bio - 264299, fse - 250014 (CONACYT-SENER)。它还提供了一个博士奖学金Xochitl Niehus[336376/234603]和硕士奖学金马科斯Vargas-Sanchez [784158/610651]。

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