胆固醇流出的载脂蛋白-ⅰ的程度随THP-1细胞的分化和泡沫细胞的形成

文摘

载脂蛋白-ⅰ(apoA-I)、高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白质成分,有许多对动脉粥样硬化的保护功能,其中一个是胆固醇流出的能力。虽然胆固醇流出容量测量建议是一个关键生物标志物来评估发展的动脉粥样硬化的风险,分析没有优化,直到日期。本研究旨在调查不同状态的影响细胞胆固醇流出的能力。我们还研究了apoA-I修改,同型半胱氨酸的影响,动脉粥样硬化的危险因素,在不同状态的细胞胆固醇流出的能力。胆固醇流出apoA-I能力极大地受到THP-1细胞的分化程度和减毒过度泡沫细胞的形成。N-Homocysteinylated apoA-I表明降低胆固醇流出能力比普通apoA-I优化条件,而无显著差异在胆固醇流出apoA-I之间过度的细胞分化能力或泡沫细胞形成状态。这些结果表明,胆固醇流出apoA-I能力取决于细胞的状态。因此,胆固醇流出试验应使用协议执行优化根据实验的目的。

1。介绍

动脉粥样硬化是心血管和脑血管疾病的主要诱因。因为这些死亡的主要原因是发达国家(1),动脉粥样硬化的预防是非常重要的。在人类中,存在许多防御机制对动脉粥样硬化的发展,和载脂蛋白-ⅰ(apoA-I)、高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白质成分,与一些相关机制。抗氧化剂(2,3)和抗炎能力(2,4,5)和胆固醇流出能力(6,7)被广泛认为是antiatherosclerotic apoA-I的函数。胆固醇流出中起着特别重要的作用在预防动脉粥样硬化病变进展的过多的脂质,如胆固醇,从动脉粥样硬化病变中删除由apoA-I通过腺苷结合盒转运体A1 (ABCA1)。最近,有研究报道,胆固醇流出能力与心血管事件的发生呈负相关(8- - - - - -10]。

众所周知,apoA-I,在胆固醇流出中起着核心作用能力,由各种反应如氧化改性,糖化,homocysteinylation [11- - - - - -15]。这些apoA-I的修改,可能导致动脉粥样硬化的发展,一直是许多研究的焦点调查功能失调在胆固醇流出。实际上,有各种研究修改apoA-I和胆固醇流出能力之间的关系,已报告(16- - - - - -18]。然而,测量的化验胆固醇流出能力尚未优化甚至通过使用相同的细胞系,尚不清楚是否细胞胆固醇流出条件可能会导致不同的能力。因此,在这项研究中,我们评估了胆固醇流出apoA-I通过使用各种状态的细胞的能力。

此外,我们关注的角色同型半胱氨酸(Hcy),动脉粥样硬化的危险因素之一,在胆固醇流出19,20.]。Hcy蛋氨酸的代谢物,是一种重要的氨基酸,并转换为蛋氨酸和半胱氨酸21]。Hcy的一部分转化为同型半胱氨酸thiolactone (HcyT) methionyl-tRNA合成酶(22]。HcyT富含活性和被绑定到赖氨酸残基(N-homocysteinylation)的许多正常人血浆中蛋白质如白蛋白、血红蛋白、纤维蛋白原(23]。我们最近报道说,N-homocysteinylated apoA-I (N-Hcy apoA-I)存在于正常的人类血清总apoA-I[1.0 - -7.4%的比率24]。然而,的影响N-homocysteinylation apoA-I的胆固醇流出能力尚未证实。我们也评估了胆固醇流出的能力N-Hcy apoA-I使用各种状态的细胞和比较结果,通过使用正常apoA-I。

2。材料和方法

2.1。化学和血液样本

除非另有说明,所有和光纯化学试剂购买来自kouichi。血样从健康志愿者获得知情同意后,和东京研究伦理委员会批准的医疗和牙科大学(1441)。

2.2。细胞培养

人类单核细胞细胞系,THP-1 rpmi - 1640年从写明ATCC购买和维护(Sigma-Aldrich)含10%胎牛血清的边后卫,0.1%青霉素和链霉素,0.1%不重要的氨基酸在37°C下5%的股份有限公司₂。

2.3。胆固醇流出的能力

THP-1与rpmi - 1640细胞培养介质包含100 ng / mL的佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA;Sigma-Aldrich)补充0.2%牛血清白蛋白(BSA) 24-well细胞培养板密度为2.5×10⁵细胞/。分化细胞,制备各种状态的孵化时间是不同的从1到5天作为显示在图1(一)。删除后上层清液,THP-1细胞富含rpmi - 1640含乙酰化低密度脂蛋白(acLDL) (50μg蛋白/毫升),T0901317(1更易/ L;恩佐生命科学),肝X受体(LXR)受体激动剂促进ABCA1的表达,³H-cholesterol (1μCi /毫升;PerkinElmer), BSA (0.2%)。加载时间也不同在1到5天来生成不同的泡沫细胞阶段。THP-1细胞被洗了三次rpmi - 1640中含0.2% BSA在平衡与T0901317 rpmi - 1640补充(1更易/ L)和BSA(0.2%) 18个小时。删除后上层清液,细胞被孵化apoA-I (10μg / mL)和T0901317 rpmi - 1640年(1更易/ L)额外的4小时。射流中分离细胞和氢氧化钠(0.1 mol / L)直接添加到细胞裂解。媒体和细胞溶解产物都是计算使用的放射性液体闪烁计数器。胆固醇流出容量计算辐射的比例在中按给定的公式:³在中/ H-cholesterol (³H-cholesterol在媒介+³H-cholesterol细胞)}×100−百分比的被动扩散的情况下没有受体(apoA-I)。

2.4。形态分析

显微观察、THP-1细胞分化和装载密度为2.5×10⁵细胞/对不同时期盖玻片(热费希尔科学)24-well细胞培养板。孵化后,贴壁细胞用磷酸缓冲盐(PBS)洗净,然后用3.7%甲醛溶液固定。与PBS洗涤后,细胞分化与苏木精染色的解决方案,和细胞分化与苏木精染色后加载解决方案之后,油红O工作解决方案评估泡沫细胞形成的程度。板用蒸馏水洗净,在显微镜下观察(BX53-34-FL,奥林巴斯)。semiquantification的脂质滴油红O染色进行与ImageJ(美国国立卫生研究院)。

2.5。流仪结果

THP-1细胞对PMA 6-well文化板块(1.0×10⁶细胞/)不同时期如上所述,然后附着细胞用PBS。轻轻洗涤后,细胞被分离细胞刮刀和沾有异硫氰酸荧光素(FITC)共轭anti-CD11b老鼠免疫球蛋白(Abcam、ab25727单克隆)(30分钟稀释1:100)在一个黑暗的地方在4°C。洗后,细胞被固定为3%多聚甲醛/ PBS。删除聚集,细胞被过滤用尼龙过滤器和浓度调整到1.0×10左右⁵细胞/毫升。CD11b表达式分析了流式细胞术(史诗XL,贝克曼库尔特)和激励在505 nm和发射在545 nm)。样本使用FITC-conjugated鼠标控制的免疫球蛋白作为同形像控制(Abcam、ab91365单克隆)在每一天和细胞的比例超过了同形像的最大荧光强度控制被定义为某些CD11b阳性细胞。

2.6。制备低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和apoA-I

低密度脂蛋白(1.019 - -1.063 g / mL)和高密度脂蛋白(1.063 - -1.21 g / mL)被超速离心法分离血清来自健康受试者,像前面描述的那样25]。接下来,低密度脂蛋白和高密度脂蛋白分数对PBS透析。净化apoA-I,高密度脂蛋白分数delipidated乙醇/醚3:2 (v / v),并应用于s - 200人力资源(Sigma-Aldrich)列(2.5×90厘米),平衡与20更易与L Tris-HCl缓冲区(pH值7.4)包含6.8 mol / L尿素。孤立apoA-I分数是透析对PBS和储存在−20°C到使用(补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/9891316)。低密度脂蛋白部分乙酰化是以前报道(26]。

2.7。西方墨点法

的表达CD11b PMA治疗后不同时期被西方墨点法评估如前所述[24]。THP-1细胞细胞溶解radioimmunoprecipitation缓冲区(里帕缓冲区;50更易与L / L Tris-HCl pH值8.0包括150更易与氯化钠,0.5%钠脱氧胆酸盐,1.0%诺乃清洁剂p 40 (MP生物医学)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)在4°C。总蛋白在细胞溶解产物的数量是衡量Folin-Lowry方法。细胞溶解产物是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到PVDF膜(微孔),然后孵化与5%的脱脂牛奶Tris-buffered盐水含0.05%渐变20(洗涤缓冲)。PVDF膜与主要抗体,孵化anti-CD11b (Abcam、ab52478单克隆)和反β肌动蛋白(圣克鲁斯,sc - 13 - 656,多克隆)。三个洗洗涤缓冲后,膜与peroxidase-labeled孵化二级抗体(贝克曼库尔特,IM0831多克隆)。CD11b的乐队β肌动蛋白被ECL可视化主要免疫印迹检测试剂(通用电气医疗集团)。Semiquantification是由微(CS分析仪,阿)。

2.8。N-Homocysteinylation apoA-I的

N-Homocysteinylation apoA-I的执行,根据之前报道的方法作了一些修改(15]。纯化apoA-I (70μmol / L)孵化有或没有10更易/ L HcyT (MP生物医学)37°C 6小时。然后,样本对PBS透析。确认生产N-Hcy apoA-I、样品处理半胱胺被孤立的等电点聚焦和转移到PVDF膜,然后孵化与主要抗体,anti-apoA-I(学院生物医学,11 a-g2b多克隆)。洗涤三次后,膜与peroxidase-labeled孵化二级抗体(医学和生物实验室)。包含apoA-I是可视化的乐队与3、3′-diaminobenzidine-4HCl和H₂O₂,semiquantified CS分析仪。

2.9。统计分析

细胞胆固醇流出能力差异的分析利用克鲁斯卡尔-沃利斯测试一个Mann-Whitney紧随其后测试Bonferroni调整。比较胆固醇流出apoA-I与能力N-Hcy apoA-I被一个Mann-Whitney评估测试。结果表示为平均值+标准偏差(SD)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。分化影响胆固醇流出apoA-I的能力

THP-1细胞分化与PMA治疗后1 - 5天。确认在每个阶段分化的细胞,THP-1细胞的形态学评估与苏木精染色(图1(一))。温和的形态变化观察到1.5天,这些大多是adendritic细胞大约20μm大小。从1.5到2天,观察细胞的动态变化。细胞树突形成的规模越来越大、显示出现相应的增加刺激。接下来,我们评估CD11b的表达,对THP-1细胞粘附分子,通过流量仪分析(图1 (b))。CD11b的表达实际上是增加THP-1与PMA刺激巨噬细胞,而表情THP-1单核细胞没有PMA治疗几乎没有发现(数据未显示)。最终,CD11b在第二天的表达显著高于在第一天(< 0.01)和维护一个高原州(图1 (b))。类似的趋势也观察到在免疫印迹分析(数据2(一个)和2 (b))。分化的影响THP-1细胞胆固醇流出apoA-I能力评估在泡沫细胞形成的条件,周期为1天。胆固醇流出能力最高的,第二高的在第二天和第一天的区别,分别后,逐渐死去的第三天(图3)。尽管泡沫细胞形成的时间固定为1天,总数³H-cholesterol流出之前被细胞主要是根据不同分化时期,在第一天的最低水平,在第二天达到峰值,后逐渐降低第三天(补充图2 (a))。此外,³H-cholesterol大规模流出后在中也显示出类似的总趋势³H-cholesterol被细胞(补充图2 (b))。胆固醇流出百分比表达的能力在很大程度上不同于实际的流出³H-cholesterol质量。相比之下,ABCA1表达是在最高的第一天,逐步减少与PMA治疗的持续时间(补充图3)。

3.2。泡沫细胞的形成对胆固醇流出apoA-I的能力

在实验中THP-1细胞的分化阶段和PMA治疗固定为2天,THP-1巨噬细胞与acLDL孵化1到5天。细胞内脂滴的积累是评估使用油红O染色(图4(一))。脂质水滴沾油红O隐约从第一天观察,大大增加了取决于加载段acLDL(图4 (b))。随后,apoA-I胆固醇流出能力的每一个阶段的细胞被确定。胆固醇流出能力最高的1天与acLDL加载后,大大减少加载时间的方式(图5)。细胞吸收的总³H-cholesterol流出之前显示逐渐增加,而媒介³H-cholesterol流出后略下降期间acLDL加载(补充图2 (c)和2 (d))。此外,观察ABCA1的表达无显著变化(补充图4)。

3.3。胆固醇流出的能力N-Hcy apoA-I

使用监管细胞分化的不同阶段和泡沫细胞形成,的影响N-homocysteinylation对胆固醇流出apoA-I是评估的能力。确认的程度N-homocysteinylation apoA-I, apoA-I孵化与HcyT测试使用等电点聚焦。正常apoA-I相比,N-Hcy apoA-I表明更高的等电点(pI)根据附加的数量同型半胱氨酸化合物(图6(一))。的比例N-Hcy apoA-I总apoA-I等电点聚焦模式(图51.9±5.9%6 (b))。胆固醇流出apoA-I和能力N-Hcy apoA-I达到那些山峰第二天,逐步减少取决于治疗的时期PMA(图7(一))。泡沫细胞的形成,明显降低胆固醇流出apoA-I能力和观察N根据acLDL -Hcy apoA-I加载(图7 (b))。另外,胆固醇流出的能力N-Hcy apoA-I显著低于完整apoA-I分化和泡沫细胞的形成在第一天和第二天,分别;然而没有观察到显著差异在第三天(图7)。

4所示。讨论

胆固醇流出antiatherosclerotic apoA-I功能是至关重要的,和评价的能力将提供重要信息的预防和诊断动脉粥样硬化。然而,在先前的报道apoA-I化验胆固醇流出的测量能力和修改apoA-I一直使用不同的方法执行。因此,修改apoA-I对胆固醇流出的影响能力是经常引起争议16- - - - - -18]。我们的目的是评估apoA-I的胆固醇流出容量的变化在不同细胞分化和泡沫细胞形成和调查的影响N-homocysteinylation apoA-I胆固醇流出的能力在这些条件。首先,我们确认CD11b的形态学特征和表达,这是一个建立的巨噬细胞分化标志THP-1细胞治疗PMA (27]。THP-1细胞治疗PMA 2天显示行为与巨噬细胞形态相似,包括增加细胞体积(28]。众所周知,PMA诱导CD11b表达式通过三角洲蛋白激酶C (PKC -δ)[27]。增加的表达CD11b THP-1细胞治疗PMA为2天观察流仪和免疫印迹分析而ABCA1的表达减少从第一天到第五天(补充图3)。PMA假定是减少了通过PKC激活(ABCA1基因表达29日),因为PKC激活了PMA如上所述。总的来说,这些结果表明,不同的分化细胞准备。第二,我们评估的影响THP-1细胞胆固醇流出的分化能力。胆固醇流出能力达到了一个峰值在第二天和第三天(图后下降3)。在第一天,吸收³H-cholesterol进入细胞和水平在中检测到低(补充图2 (a)和(b))。在第二天,细胞内的吸收³H-cholesterol大约三倍在第一天。相反,后第三天,细胞内和媒介³H-cholesterol降低,介质的比率下降³H-cholesterol略大于细胞内³H-cholesterol。这些结果表明,胆固醇流出的增加容量表示在第二天的比例是由THP-1巨噬细胞的分化,并减少后第三天将由ABCA1的表达,减少关键运输车apoA-I胆固醇流出。在许多研究中,PMA刺激的持续时间是不一致的胆固醇流出能力评估(16- - - - - -18]。我们的研究结果表明,PMA治疗的最佳时间是2天,如果胆固醇流出能力需要评估在最大的舞台。

接下来,我们研究了泡沫细胞胆固醇流出能力形成的影响。油红O阳性细胞,这表明脂滴的形成,增加比例加载acLDL(图4)。与此同时,胆固醇流出容量减少加载时间的方式(图5)。虽然有一个增加细胞内³H-cholesterol通过天分泌的水平³H-cholesterol介质的apoA-I逐渐减少(补充图2 (c)和2 (d))。此外,没有观察到显著变化ABCA1表达(补充图4)。细胞内胆固醇酯的过度积累据报道,抑制溶酶体酸性脂肪酶(LAL)活动,与胆固醇代谢相关的酶(30.]。自由胆固醇吸收到细胞被酰基辅酶a酯化胆固醇酰基转移酶(ACAT)和存储为脂滴(31日]。由于胆固醇酯水解通过ABCA1 LAL免费和移除胆固醇,抑制LAL可能导致减少胆固醇流出不管ABCA1表达在细胞表面的程度。因此,降低胆固醇流出而减少ABCA1表达可能与LAL活动的损失造成的过度吸收acLDL,包括³H-cholesterol,效果可能会逆转ACAT抑制剂的存在。这些结果表明,加载胆固醇的最佳时间是1天如果胆固醇流出产能评估在最大的舞台。长时间加载胆固醇降低胆固醇流出,因为过多的胆固醇积累能力。

我们所知,本研究首次表明胆固醇流出之间的关系的能力和条件THP-1细胞分化和泡沫细胞的形成等,在深度。使用这些不同的细胞状态,我们检查的影响N-homocysteinylation apoA-I胆固醇流出的能力。N-Hcy apoA-I发现了比完整apoA-I(图带正电的乐队6)和总apoA-I被定义为一个百分比,如前所述[15]。变化在胆固醇流出apoA-I和能力N-Hcy apoA-I使用THP-1细胞对PMA不同时间间隔表明类似的趋势,而值在第二天达到高峰,然后逐渐降低(图7(一))。然而,显著差异观察apoA-I与胆固醇流出的能力N-Hcy apoA-I在第一天和第二天。相反,没有观察到显著差异在这些能力在3天之后。此外,胆固醇流出apoA-I和能力N-Hcy apoA-I也评估使用THP-1细胞治疗胆固醇加载在不同的时间间隔。同样,这两种类型的胆固醇流出能力apoA-I显示相同的行为,和N-Hcy apoA-I表示能力显著低于apoA-I加载后第一天和第二天。只有少数研究已经报道之间的关系Hcy和胆固醇流出能力(32,33]。我们之前报道,胆固醇流出apoA-I能力没有明显的下降N-homocysteinylation [15]。在前面研究PMA刺激的时间是3天,表明过度分化的细胞可能在考虑可能的影响N-homocysteinylation。确认的效果N-homocysteinylation apoA-I胆固醇流出能力,修改网站的影响apoA-I及其剂量反应应该调查。然而,我们的研究结果的重要性在这项研究中重申细胞分化程度和泡沫细胞形成apoA-I任何修改的影响时,不仅限于此N-homocysteinylation,胆固醇流出能力评估。优化实验条件需要根据测量的目的。然而,我们关注THP-1细胞在这项研究。还需要进一步的调查来评估使用其他单核细胞胆固醇流出能力或单核细胞的细胞株34- - - - - -40]。尽管本研究只有apoA-I检查,研究使用HDL可能需要确认一个准确的机制。进一步的实验将为我们提供一个提示动脉粥样硬化的不同阶段的评价。

5。结论

总之,胆固醇流出apoA-I和能力N-Hcy apoA-I取决于细胞的状态;因此,重要的是要评估细胞的胆固醇流出几个州的能力为目的。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢副教授龟田Hara(一般同位素研究部门,医疗和牙科研究中心科学)慷慨地提供技术建议尤其是关于同位素的处理。这项工作是支持的科研补助金(KAKENHI)从日本促进社会科学(jsp)授予15号k19174(观之Ohkawa)和26460642 (Minoru Tozuka)。

补充材料

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