文摘
自发修复软骨损伤有一定的能力,但修复组织经常显示软骨终端分化的现象,造成不可逆转的破坏其结构和功能,严重影响患者的生活和工作的质量。具有重要意义,研究过程中遇到的问题修复软骨损伤。本文主要研究干细胞,促进膝关节退行性骨骼关节软骨的再生。首先,动物关节软骨缺损是建模,10毫升的动物静脉血液,0.5毫升的PRP由离心收集,与软骨碎片混合,并移植到缺陷面积成凝胶。bmsc组,1毫升的bmsc细胞浓度为107 /毫升注射关节内的细胞。组织学染色体观察6周、12周后,和软骨组织修复的效果进行了分析和评估,及相关数据进行统计分析。我们评估了自发的部分软骨损伤的修复能力,全层软骨损伤,和骨软骨损伤。此外,部分软骨损伤修复,通过使用软骨损伤体外模型模拟体内微环境和生物材料,表面的粘附和细胞形态部分,全层软骨损伤进行评估,和实验进一步用来评估内部和外源诱导迁移源对体外培养细胞的影响。在细胞浓度的研究中,软骨修复效果增加的浓度在一定范围内,增加和组织修复能力保持稳定,当浓度超过107细胞/毫升。使用ECM-oriented支架复合自体bmsc,成功构建组织工程软骨,而正常软骨组织的组织学和生物化学特征,和更好的修复受损的关节软骨的大型动物。
1。介绍
关节退行性变通常是由外伤或其他病理原因引起的软骨和骨软骨损伤,最终导致整个关节结构完全破坏,导致联合函数的全部损失。目前的研究表明,尽管某些生物制剂可以推迟疾病的恶化和减少患者不同程度的痛苦,这些药物不能有效促进组织再生。由于关节软骨再生的能力极其有限,关节成形术已成为不可避免的手术方法在后期恢复关节功能。本文描述了临床修复技术广泛用于修复关节软骨缺陷并讨论了这些技术的长期和短期临床疗效。与此同时,在未来10年,治疗方法和再生生物制剂的发展有望治疗关节软骨损伤和恢复关节功能。这些产品包括细胞和胞外的材料,如自体和同种异体细胞,和各种各样的多功能细胞技术。这些技术的关键是利用组织工程方法将生物技术转化为临床产品,因此在这些方面发挥着重要的作用。
关节软骨损伤是非常广泛,如创伤、遗传学和退行性改变。postinjury修复的过程中,在工作中哪些因素?大量的实验研究证明,确实有一些蛋白质的过程中关节软骨修复软骨代谢的调节中起着重要的作用[1),但这些都是已知单一蛋白质,并没有分析和研究所有蛋白质可能在修复过程中发挥作用。因此,有必要使用干细胞促进所有蛋白质的异常变化的研究关节软骨修复过程中关节滑液(2]。本文旨在研究这些干细胞软骨修复的作用,为临床治疗提供新思路和新方法的软骨损伤。
骨关节炎(OA)是一种风湿性疾病引起慢性疼痛和残疾。没有有效的治疗方法。Vonk LA研究细胞外囊泡的作用(EVs)由人类骨髓间充质干细胞分泌(BMMSCs)人类OA软骨的修复。他测试和观察到的影响BMMSC-EVs OA软骨炎症;治疗肿瘤坏死因子-α与BMMSC-EVs刺激OA软骨细胞单层培养;48小时后,使用中存在检测促炎gene-expressing软骨细胞;和4周后,1,9-dimethylmethylene蓝色(DMMB)分析了其粘多糖含量。此外,再生组织的石蜡切片染色的蛋白多糖(saffron-O)和II型胶原蛋白(免疫染色)。他的方法证明BMMSC-EVs软骨修复的一个重要媒介,但详细的原则仍然没有证明(3]。
软骨组织工程是一个优化组合的一种新型的支架,细胞来源,生长因子,已成为一个有前途的战略软骨再生和修复。傅n研究的作用polycaprolactone-polyethylene glycol-polycaprolactone (PCL-PEG-PCL) PCEC脚手架在软骨修复。他第一次准备PCEC薄膜和测试它们的属性使用扫描电子显微镜和原子力显微镜。细胞接种后,细胞的形态学PCEC膜(SCC大鼠脂肪干细胞和音乐绿色荧光小鼠脂肪干细胞)由扫描电子显微镜和荧光显微镜观察。Ccts-8方法用于检测细胞生存能力PCEC膜。此外,完成了大鼠软骨缺陷,PCEC电影嵌入式为8周评估其治疗效果。他的方法是片面的和不客观地解释实验的结果(4]。骨髓间充质干细胞(MSC)治疗是目前临床试验治疗软骨损伤。虽然细胞疗法治疗效果,还有物流与运输相关的限制和业务挑战,存储,和适当的处理。液是由纳米双层脂质膜囊泡分泌细胞存在于MSC分泌的身体。他们已经发现调解msc的再生和免疫调节功能在动物模型。张年代假设人类MSC液可能代表一种新的细胞疗法方法促进软骨再生。因此,他们从人类胚胎的条件培养基纯化液间充质干细胞和评估他们的修复能力关键尺寸骨软骨缺损的免疫活性的大鼠模型。他的方法是基于假设的实际情况,和可信度不高5]。
本研究测试的影响BMSC-Exos和关节chondrocyte-derived液(AC-Exos)软骨再生通过一系列实验。图片水凝胶作为生物载体,满载BMSC-Exos AC-Exos,羊的关节软骨缺损的修复是作为动物模型。体内实验评估了icr总值,软骨修复得分,组织学染色、免疫组织化学染色。的影响不同液修复软骨损伤和纤维化程度的新组织观察;体外实验进行coculture BMSC-Exos和AC-Exos软骨细胞和使用光学显微镜观察,免疫印迹,流式细胞仪和免疫荧光技术检测软骨细胞表型的变化。
2。Osteoarticular软骨再生
2.1。退行性膝关节疼痛的影响
有四个主要方面,影响老年人的生活质量,包括身体健康,心理健康,和外部经济和社会活动。老年人最重要的是身体健康。自出生以来,年老、疾病和死亡是人的正常的自然衰老过程;当有一种疾病,它会直接影响老年人的健康。因为它不够健康,自然衰老过程自然会加速,这直接反映在各种身体功能逐渐退化,因此,老年人的身心健康遭受双重打击。退行性肌肉骨骼疾病和其他疾病在老年人中发病率高(6]。
膝关节的结构更加复杂,上部股骨和胫骨平台越低,以及上覆韧带肌肉组织,所以膝关节周围的肌肉的退化性变化将导致相应的膝关节结构的变化。研究表明,人们每天损失1%到3%的肌肉力量没有锻炼(7]。在65岁老年人,因为他们已经退休了,很少参加体育活动,这将加剧带来的变化退行性肌肉损失。随着生活水平的提高和智力的发展,移动电话可以生活在基本完成所有事情,和人们的懒惰也将相应增加。如果你不锻炼或每天锻炼,肌肉和关节将无法满足人们的需求为锻炼,这将导致膝关节周围的韧带变得异常紧张,膝关节会变得不稳定,甚至步行和腿会变得不稳定。因此,膝关节力线的结构将会改变。膝关节力线的变化将导致两个膝盖的关节和关节上下移动槽。运动的槽将过度研磨膝关节周围的韧带和引起疼痛8]。肌肉力量的失衡也会导致相对位置的两根骨头膝关节的来回移动,左和右,这运动加剧了膝盖疼痛的发生。
退行性膝关节疼痛已经成为一种普遍现象。退行性膝关节疼痛是影响老年人生活质量的主要因素。通常表现为疼痛在上下楼梯时,走路,不稳定和颠簸,可怜的弯曲和扩展。在严重的情况下,关节功能可能发生损失,导致丧失劳动能力和生活(9,10]。大约有2.5亿名世界各地的膝盖疼痛,患者和老年人占30%的膝盖疼痛。大约有210000老年病人在中国接受膝关节置换手术。据相关统计,膝盖疼痛患者的数量在我国60岁以上的年可以达到一半,和伤残率可以达到5/8。老年人膝盖疼痛从社会吸引了越来越多的关注。如何改变这种情况已经给我们带来了很多的思考[11]。
2.2。软骨组织工程
根据矩阵的构成,可以分为弹性软骨,软骨纤维软骨,透明软骨。关节软骨是透明软骨组织生长表面的关节。透明关节软骨是一种股骨头软骨细胞组成的和无力的组织、水、胶原纤维和蛋白聚糖(12]。
组织工程技术的出现带来了另一种可能的修复和重建器官和组织(13]。软骨组织工程是植物体外软骨细胞或干细胞分化能力可以使三维支架的生物相容性。脚手架可以模拟天然软骨结构和功能,可以与周围软骨植入后软骨缺陷。组织很好地融合软骨组织修复和再生,保持新软骨的功能很长一段时间没有软骨退化和修复软骨缺损的目的最终实现由创伤引起的,先天畸形,和疾病14,15]。
软骨组织工程软骨种子细胞,包括支架和传感器信号。来自各种来源的细胞被用来作为软骨组织工程的种子细胞,如软骨细胞、成纤维细胞和干细胞。生长因子等的监管信号加速和促进软骨修复的效果。可以添加到培养基生长因子促进细胞生长和分化细胞体外培养时,也可以加载到支架和生长因子促进细胞分化和组织再生。许多生长因子,如TGF -βPDGF-BB FGF, BMP, IGF,已用于软骨组织工程(16]。
尽管组织工程的方法已成功在许多软组织的再生,在软骨组织工程仍有许多尚未解决的问题。一方面,软骨本身的结构和性质使其难以损伤后自我修复。另一方面,如何找到一个更先进,更方便、更可控的三维支架制备技术尤为重要。准备组织工程软骨支架可以模拟自然的内部结构和生理成分软骨,给细胞和组织的最佳生长微环境。仍有挑战,实现理想的功能性替代。
2.3。软骨再生方法
在人体中各种类型的干细胞,干细胞从骨髓中提取具有许多独特的优势在临床应用。由于其相对容易分离和强大的繁殖能力,它方便我们获得他们从捐赠者和商店在现成的细胞银行。此外,临床实验证实,大量临床体外和体内的实验发现,人类骨髓间充质干细胞可以分化成软骨组织和骨组织再生和发挥重要作用的骨软骨和软骨缺陷(缺陷17]。具体来说,骨髓间充质干细胞是来源于骨关节炎患者,他们显示在体外可以产生蛋白聚糖,II型胶原蛋白保持软骨细胞在三维支架的形状。另一个显著特点是选择性地迁移到病变组织和器官的能力。他们发现分泌细胞因子,抑制细胞增殖在软骨缺陷。这些细胞因子被认为起着关键作用在同种异体移植和异种移植。在软骨修复,msc可以激活特定的软骨组织修复系统,可用于滋养,促进其增长和修复通过直接释放合成,增殖,再生成软骨损伤因素。通过趋化因子的释放来创建一个再生环境,骨髓间充质干细胞也可能促使内源性干细胞到cartilage-damaged区域修复受损软骨组织(18]。
目前,大多数研究通过干细胞软骨再生骨骨髓来源间充质干细胞。虽然骨髓提取过程是非常痛苦的,它是一种有效的方法来获取干细胞。然而,干细胞也可以从其他来源获得,包括脂肪组织、肌肉、皮质松质骨,滑膜,骨膜和脐带。人类脂肪干细胞是最容易获得的。体外研究表明,这些干细胞增殖和分化能力类似于骨髓间充质干细胞。脂肪干细胞被认为是一种理想的来源的干细胞由于其相对体外隔离能力强,抗炎作用,没有免疫原性。与其他来源的干细胞相比,其增殖和分化能力不太可能受到个人的影响。年龄的影响:通过将脂肪干细胞注入膝关节的老年病人患有膝关节炎,结合关节镜微创手术对关节腔灌洗的临床可行性和安全性人类脂肪干细胞软骨退行性疾病的治疗研究。治疗的结果是改善身体机能,促进关节软骨修复,从而减轻患者的膝关节的疼痛19]。然而,类似于结合注射骨髓间充质干细胞,这种技术也有一些类似的问题。这些问题包括细胞的数量需要促进软骨再生,注入一个或多个注射是否需要获得理想的效果,注射的最佳时间窗,这项技术的长期安全。此外,一些证据提供的进一步改善需要组织活检MRI。
3所示。试验研究Osteoarticular软骨的再生
3.1。研究对象
导向支架促进种子细胞的粘附和生长的支架,促进种子细胞在支架的均匀分布,并帮助种子细胞在支架的布置安排自然关节软骨细胞。这决定了新组织的结构和功能特征。这是具有重要意义的功能性组织工程软骨的建设。在先前的研究中,面向支架结合自体骨髓干细胞可以更好地修复兔膝关节软骨取向后,但是没有报告使用在大型动物修复关节软骨缺损。
骨髓间质干细胞具有多向分化潜能和方便的来源。自体来源的细胞没有影响身体的供区。他们可以在体外增殖迅速,不会失去干细胞特征后多个段落。他们目前在软骨组织工程的种子细胞的来源问题。然而,先前的研究工作是基于chondrogenic感应的小动物骨髓干细胞,和长期效应感应没有评估的安全。因此,本研究选择自体骨髓基质干细胞作为种子细胞,修复羊的关节软骨缺陷复合定位支架后没有任何诱发因素。
3.2。细胞培养和组织工程软骨组织的建设
获得的软骨组织发送到临床细胞培养培养的空间。严格按照要求和标准的中国制药和生物制品检验研究所,自体软骨细胞分离、培养,扩大和质量监控。培养周期的程度。孤立的主要细胞在低密度扩大到107人。种子细胞在体外。复合三维支架的操作遵循标准化的操作过程和组织工程软骨移植。
他们体外共培养2 - 3周,第二个小切口是执行移植操作,构建组织工程软骨组织植入回缺陷。手术后组织工程软骨移植的标准操作程序。手术当天,组织工程软骨组织转移到医院,细胞生化功能测试同时,和文化的解决方案是进行细菌和支原体检测,以确保植入组织的质量和无污染。手术方法:做一个小切口,以减少关节,用锋利的刀切垂直在受损的软骨下骨软骨,并使用一个圆形的刮匙清除受损的软骨下骨组织。修剪的组织移植到一个缺陷的形状,和组织工程化软骨修复组织边缘的缺陷与6 - 0螺纹针吸收性缝线(面临的骨膜生发层软骨表面)。密封和纤维蛋白胶缝合区。最后,检查移植固定,被动地扩展和flex联合几次,和缝合伤口后确认没有位移。
3.3。机械试验
机械测试是用来评估的压缩性能修复组织。首先,样本是固定的基础力学试验机(英斯特朗,型号5543,广州,MA),和位置调整,这样的中心缺陷直接低于压模。执行压缩试验的力10 n。速度设置为0.06毫米/分钟。当软骨层被压缩到20%的软骨层的厚度,停止压缩和压缩允许回到原来的位置。应力-应变曲线的斜率是实测抗压模量(MPa)。机械试验之前,冷冻样品在室温下放置在PBS为3 - 4个小时完全平衡。
3.4。测试指标
观察一般的形状,颜色,质地,和体积变化的测量复杂的一个星期后。观察细胞的生存和分布测量复杂的文化。一个星期后把细胞支架复杂,已经培养了一个星期,用PBS冲洗,立即冻结部分。的部分将与95%的酒精脱水和固定AO-PI染色和赫斯特33258荧光染色法;观察骨髓干细胞在支架倒置显微镜下。
4所示。分析Osteoarticular软骨再生
4.1。分析BMSC-Exos的影响和AC-Exos维护正常的软骨细胞表型
我们彩色信封BMSC-Exos AC-Exos与绿色和红色荧光膜荧光染料和cocultured软骨细胞。通过荧光显微镜,我们发现大量的绿色和红色荧光在软骨细胞的细胞质中积累。建议两个液可以被大量软骨细胞,和两个液可以进入软骨细胞发挥作用(20.]。
软骨细胞在体外培养时,他们会逐渐去分化随着文化通道数量的增加,失去了独特的软骨细胞表型。肉瘤的组织通过扩张软骨细胞通常是纤维软骨(21]。身体透明软骨的正常关节软骨组织,组成良好的成熟的软骨细胞表型和细胞外基质分泌的(22]。因此,在软骨细胞扩张的过程中,如何有效地维持软骨细胞的表型已经成为软骨修复成功的一个重要因素。在这个实验中,BMSC-Exos和AC-Exos cocultured与软骨细胞来检测这两个液是否影响软骨细胞表型的维护。免疫印迹结果表明,特定的标记的表达Sox9的软骨细胞治疗BMSC-Exos逐渐减少从4日到10日通过细胞培养,而对于软骨细胞AC-Exos对待,Sox9始终保持高表达但没有表达减少。
如图1流式细胞术结果显示,当软骨细胞与BMSC-Exos cocultured或者第十段,Sox9和Aggrecan-positive表达细胞的百分比分别为3.3±0.69%和2.8±0.53%,分别虽然AC-Exos后软骨细胞治疗,积极表达Sox9和Aggrecan 10通道细胞达到92.3±0.68%和94.1±0.46%,分别。光学显微镜结果表明,软骨细胞的细胞形态学处理BMSC-Exos逐渐从椭圆长轴形状改变,这表明BMSC-Exos不改变细胞的去分化的趋势。的软骨细胞治疗AC-Exos始终保持一个椭圆形细胞形状(23]。
免疫荧光染色结果表明,Aggrecan的表达(红色荧光)的软骨细胞治疗BMSC-Exos是第四代的显著降低,而对于软骨细胞治疗AC-Exos, Aggrecan的表达总是保持在一个更高的水平。
4.2。检测细胞内铁的磁标记bmsc的原子吸收光谱仪
如表所示1超顺磁性氧化铁的吸收与SPIO浓度。细胞内铁增加标签的浓度的增加,8岁到达顶峰μ克/毫升,平均细胞铁含量为2.77±0.93更易与L。SPIO继续增加时,细胞内铁显示下降的趋势(24]。通过这个结果,我们也可以发现高浓度的SPIO标记(10μ克/毫升和12μg / ml)将减少SPIO的细胞。
如表所示2和图2在过去,SPIO涂以右旋糖酐体内降解时间短,这是难以满足组织工程跟踪的时间要求,因为其表面带负电荷,它不容易被细胞,转染是必需的。本实验使用self-synthesized裴修改SPIO粒子准备一种新型SPIO表面正电荷。当铁含量的最终浓度是8μ克/毫升以上的细胞cocultured 24小时,正率是由显微镜与普鲁士蓝染色后发现的。高达99%,它证明了新的SPIO已成功转入bmsc效率极高的标签(25]。实验研究表明,这种新型的SPIO可以直接被细胞吞噬标签干细胞,没有与转染剂混合,操作方便。机制是间充质干细胞的表面带负电荷,而新近的表面准备裴/ SPIO是带正电的。可以直接相互吸引或在细胞表面或通过正面和负面的指控,并通过内吞作用进入细胞。带正电的混合物应该使用转染剂。研究表明,时间SPIO体内和排除体内的降解没有粒径相关,但与包埋剂的分子量和表面的亲水性。裴具有良好的亲水性,可以延长调节分子量。标记细胞的跟踪时间接近软骨缺损修复和愈合的时间。
4.3。提取EHG hiPS-MSC-Exos和制备的水凝胶
如图3,纳米颗粒分析结果表明,提取的hiPS-MSC-Exos粒径范围为50 - 150海里;TEM结果表明,hiPS-MSC-Exos球形或椭圆形;和免疫印迹检测结果表明,上述结果证实hiPS-MSC-Exos的成功提取。后的流变试验结果表明,辐射EHG前体溶液与395 nm LED光源20秒钟,一个EHG水凝胶形成稳定的三维结构。
如图4,我们测试了EHG水凝胶的集成与软骨和招募软骨细胞的能力缺陷通过体内实验。扫描电镜结果表明,EHG水凝胶和软骨组织是紧密相连的,并没有发现差距之间的接口,这表明EHG形成了一个紧密集成与软骨通过化学交联。他染色结果表明,EHG水凝胶是完全和紧密连接到周围的软骨组织骨软骨缺损,EHG水凝胶是紧密集成与软骨下骨底部的缺陷。骨软骨组织的紧密集成允许EHG水凝胶中的液直接接触的细胞周围的组织,它可以调节周围的细胞。
我们进一步研究了监管EHG水凝胶对周围的细胞缺陷的影响通过体内实验。DAPI染色结果表明,细胞的数量在缺陷EHG组明显高于HG组。他染色结果表明,软骨细胞,bmsc,炎症细胞的缺陷。这个结果表明EHG水凝胶可以有效地招募软骨细胞和BSMCs缺陷的缺陷。
5。结论
软骨组织本身不能治愈受伤后,自体软骨细胞移植受限于缺乏细胞来源和数量。干细胞从组织的角度来看,这项研究证实,软骨组织具有干细胞特征和细胞增殖效率高,不管生理和病理条件。这些细胞的出现可能是由于环境的变化,以及相关的表面标记是动态变化的。
本文实验证实hiPS-MSC-Exos能有效修复软骨损伤,促进透明软骨再生。体外实验的结果证实,hiPS-MSC-Exos可以显著提高软骨细胞的增殖和迁移,伴着。这个结果表明hiPS-MSC-Exos功能显著促进软骨细胞再生和修复软骨损伤,显示转换的应用前景广阔。
部分软骨受损,其基质微环境细胞不容易坚持,缺乏小生物分子能有效诱导细胞迁移。因此,我们使用生物膜材料结合基质细胞衍生因子构建生物活性材料,以促进和坚持自发迁移,然后打开软骨修复;在骨软骨损伤,有大量的来源于种子细胞的骨基质微环境参与修复,但骨软骨损伤的环境中,骨骼系统更倾向于区分,导致软骨异常终端分化。因此,我们使用胶原蛋白香丝双层支架结合甲状旁腺与荷尔蒙相关的蛋白质抑制软骨的终端分化,促进软骨形成的过程,提高自发的软骨修复的质量。
数据可用性
本文不涉及数据的研究。没有数据被用来支持本研究。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。